路鑫怡 沃恩康 楊新燕 楊燦 徐琦 楊柳 何泳愉 項婷婷 郭潮潭
杭州醫(yī)學院檢驗醫(yī)學院與生物工程學院,杭州 310013
流感病毒是一種急性人畜共患傳染病,抗流感病毒藥物是控制流感的重要手段,但因病毒易發(fā)生變異,使得藥物易產生耐藥性。 有研究顯示,從燕窩水提液中獲得的一種病毒血凝反應抑制劑,具有廣譜抗病毒效應,可見有效利用燕窩活性成分,可為抗流感病毒藥物的研發(fā)打下基礎。 對燕窩進行酶提取,可減少其中過敏性和難消化的化合物。 本研究嘗試建立燕窩酶解液的制備方法,并研究其抗流感病毒作用,現報告如下。
犬腎上皮細胞系MDCK 細胞,小鼠單核巨噬細胞系Raw264.7 細胞,病毒株A/Memphis/1/71(H3N2)(簡稱Memphis)均為本實驗室保存。 MDCK 細胞采用 5%新生牛血清(NBS)的 DMEM 培養(yǎng);Raw264.7 細胞采用10%胎牛血清(FBS)的DMEM 培養(yǎng)。 感染性實驗均使用含有 1 μg/mL TPCK 胰酶的DMEM 作為稀釋緩沖液。
燕窩購自華東醫(yī)藥;中性蛋白酶和茚三酮試劑購自上海源葉生物科技有限公司;冰醋酸、硫酸銨購自上海麥克林生化科技有限公司;RNA 提取試劑盒、cDNA 合成試劑盒和SYBR Green 熒光定量試劑購自翊圣生物科技有限公司;DMEM/High 培養(yǎng)基購自 Cellmax;NP 抗體、M2e 抗體、M1a 抗體 (1∶1 000)由本實驗室制備并保存;β-actin 抗體 (1∶1 000)、Phospho-IKKα/β 抗 體 、IKKα/β 抗 體 、Phospho-NF-κBp65 抗體和 NF-κBp65 抗體購自 Cell Signaling 科技公司;山羊抗小鼠、山羊抗兔HRP 抗體(1∶5 000)購自杭州華安生物科技有限公司;MTT、二甲基亞砜(DMSO)購自生工生物工程(上海)股份有限公司;引物合成委托上海捷瑞生物技術有限公司,引物序列如表1 所示。
表1 實時熒光定量PCR 引物序列
注:NP:流感病毒核蛋白;M:流感病毒基質蛋白;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶
基因 上游(5'-3') 下游(5'-3')NP CAACATACCAGAGGACAAG ATCAACTCCATCACCATTG M AAGTGAGCAGGCAGCAGAG CTCGCAGCAACAACAAGAGG IL-1β AGTGATGAGAATGACCTGTT GATACTGCCTGCCTGAAG IL-6 TCCATCCAGTTGCCTTCT TAAGCCTCCGACTTGTGA IFN-γ ATCTGGAGGAACTGGCAA GTGTGATTCAATGACGCTTA TNF-α GACCCTCACACTCAGATCATCTTCT GCTACGACGTGGGCTACAG NG-κBp65 GAAGCACAGATACCACCAA CAGCCTCATAGTAGCCATC GAPDH GAAGGTCGGTGTGAACGGATTTG CATGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
1.確定燕窩酶解條件
稱取0.12 g 燕窩放入錐形瓶中,按照液料比分別為 20∶1、30∶1、40∶1、45∶1 和 50∶1 加入蒸餾水使燕窩充分溶脹。 隨后各添加10 mL 中性蛋白酶,酶解1 h,而后沸水浴10 min 使酶滅活。取10 mL 酶解后的液體加入10 mL 的50%醋酸溶液。 在酸性環(huán)境下利用茚三酮試劑測定不同液料比對唾液酸提取率的影響。 在固定合適液料比的情況下,試驗不同的酶解時長(0~8 h)對唾液酸提取率的影響。 每個液料比和每個酶解時長重復6 次。
唾液酸提取率計算公式為:x=[c×50×10/(V×0.006077)]×100%
式中,x 表示唾液酸提取率(%);c 表示從標準曲線上查到的唾液酸濃度 (mg/mL);V 表示樣本體積(mL);50 表示提取后定容體積(mL);0.006077 表示1 g 標準燕窩中唾液酸的含量(g)。
2.燕窩酶解液對MDCK 細胞毒性作用
用不含血清的細胞培養(yǎng)液將燕窩酶解液、燕窩液和中性蛋白酶分別從2.4 mg/mL 和5.52 mg/mL按2 倍倍比稀釋為8 個濃度。MDCK 細胞接種于96孔板中,每孔加入2 倍稀釋的樣本,每個稀釋度重復6 次。 同時設立正常細胞對照組和空白凋零組,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,用MTT 檢測細胞存活情況并計算細胞存活率,選擇細胞生存率高于50%的濃度作為樣本最大使用濃度。 細胞存活率=[(實驗孔吸光度-空白孔吸光度)/(對照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100%。
3.燕窩酶解液對流感病毒的體外抑制試驗
因此,在英語教學中要注重拓寬學生的語言文化知識,培養(yǎng)深刻理解不同文化內涵的能力,培養(yǎng)學生樹立遠大理想,具有把握現實、面向未來、立足本國、面向世界的遠見卓識,形成正確價值觀和優(yōu)秀品質,通過提升學生的人文精神,具備自覺抵制利己主義、拜金主義、價值迷失、信仰危機等不良思想文化滲透的能力,具備跨文化交際和傳播中國優(yōu)秀文化的能力和素養(yǎng),培養(yǎng)學生的民族自信,在學好英語語言和文化的同時,培養(yǎng)學生的愛國情操、社會責任感和歷史使命感,要有憂患意識,要懂得珍惜今天來之不易的幸福生活,切實懂得國家強大的意義。
采用以下3 種方式進行燕窩酶解液對流感病毒的體外抑制試驗:①對流感病毒的直接抑制:燕窩酶解液和4 HAU 的病毒液混勻置于37 ℃孵育4 h,混合液加入MDCK 細胞感染1 h, 棄去混合液,用PBS 洗去多余病毒后加入無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h;②對流感病毒吸附階段的抑制:燕窩酶解液加入細胞培養(yǎng)板中吸附4 h,棄去后用PBS 洗去多余燕窩并加入4 HAU 的病毒液接種1 h, 棄去后用PBS 洗去多余病毒, 加入無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h; ③對流感病毒吸附后復制增殖的抑制:MDCK 細胞中加入 4 HAU 的病毒液接種 1 h,棄去后用PBS 洗去多余病毒, 用不含血清的燕窩酶解液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。 試驗根據所需的樣本分為3 組:燕窩酶解液組、燕窩液組和中性蛋白酶組,同時設立病毒對照組。 24 h 后收集細胞上清進行血凝試驗, 根據細胞上清在稀釋數倍后是否引起紅細胞凝集現象判斷子代病毒產生量,每組重復2 次;收集細胞分別進行實時熒光定量PCR 對流感病毒的核蛋白NP 和基質蛋白M 的轉錄情況進行檢測,每組重復3 次。
4.燕窩酶解液對流感病毒作用時間試驗
MDCK 細胞接種于 6 孔板, 用 4 HAU 病毒液吸附MDCK 細胞, 作用1 h 后用 PBS 洗去未吸附的病毒,接著加入無血清培養(yǎng)基進行孵育。 將燕窩酶解液/燕窩液分別在吸附前4 h(-4 h)和吸附前2 h(-2 h),病毒開始孵育(0 h)、病毒孵育后 2 h(2 h)和孵育后4 h(4 h)加入細胞孔中。 24 h 后收集細胞采用實時熒光定量PCR 檢測流感病毒NP 的轉錄水平,每組重復3 次。 根據所用的試驗樣本分為燕窩酶解液組和燕窩液組,另設病毒對照組加入等量PBS。
5. 燕窩酶解液對流感病毒激活的NF-κB 及炎癥因子表達水平影響的檢測
燕窩酶解液和燕窩液分別與4 HAU 病毒液混合均勻置于 37 ℃孵育 4 h。 4 h 后分別加入到Raw264.7 細胞中感染1 h, 棄去混合液后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。 24 h 后收集細胞進行實時熒光定量PCR 和Western 印跡法,每組重復3 次。
采用Grapad.Prism.v8.0 軟件對數據進行作圖繪制并進行統(tǒng)計學分析,符合正態(tài)分布的計量資料采用表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD 檢驗,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。
從圖1 A 中可見, 燕窩中唾液酸的提取率隨液料比的增大而上升,在 45∶1 時最高,達到(35.24±0.18)%, 此后在液料比為 50∶1 時, 提取率下降至(11.38±0.02)%。 從圖 1 B 中可見,在液料比為 45∶1的條件下, 燕窩中唾液酸的提取率在3 h 時達到最大值,為(66.87±0.05)%,此后隨著酶解的時間延長提取率未見明顯升高。 為使燕窩中唾液酸的提取率達到理想條件,確定酶解的條件為:液料比45∶1 和酶解時長不低于3 h。
圖2 所示,隨著稀釋倍數的增加和樣本濃度的降低,燕窩酶解液組和中性蛋白酶組細胞生存率逐漸增高,燕窩組細胞生存率與濃度未見明顯的依賴關系。 選擇細胞生存率高于50%的濃度作為最大使用濃度,顯示燕窩酶解液組和燕窩液組的最大使用濃度均為1.22 mg/mL,中性蛋白酶組為0.69 mg/mL。
圖2 燕窩酶解液對MDCK 細胞毒性作用(n=6)
1.對子代病毒的影響
如圖3 所示, 使用流感病毒吸附后復制增殖的抑制方式,燕窩酶解液組子代病毒產生量為病毒對照組的1/4;而使用直接抑制方式,子代病毒產生量為病毒對照組的1/2。 燕窩酶解液組和燕窩液組對流感病毒吸附階段的抑制作用不影響子代病毒的產生。
圖3 燕窩酶解液不同體外抑制方式對子代流感病毒產生量的影響
2.不同抑制方式對流感病毒基因NP 和M 轉錄水平的影響
采用直接抑制方式,不同組別的流感病毒基因NP 和 M 差異均有統(tǒng)計學意義(F=9.92,P=0.005;F=11.27,P=0.003),詳見表2。與病毒對照組相比,燕窩酶解液組NP 和M 的轉錄水平明顯降低 (t=-2.81,P=0.023;t=-3.34,P=0.010), 而中性蛋白酶組升高(t=2.16,P=0.040;t=2.38,P=0.045)。
采用吸附階段進行抑制, 不同組別的流感病毒基因NP 和M 轉錄水平差異均有統(tǒng)計學意義(F=6.14,P=0.018;F=14.31,P<0.001),詳見表 2。與病毒對照組相比, 燕窩酶解液組NP 和M 的轉錄水 平 升 高 近 2 倍 (t=2.56,P=0.034;t=3.41,P=0.009),而燕窩液組降低(t=-1.57,P=0.154;t=-3.11,P=0.014)。
采用吸附后復制增殖進行抑制,不同組別的流感病毒基因M 的轉錄水平差異具有統(tǒng)計學意義(F=6.24,P=0.017),詳見表 2。 相比病毒對照組,燕窩液組 M 的轉錄水平降低(t=-3.05,P=0.016)。
表2 燕窩酶解液不同體外抑制方式對病毒基因NP 和M 轉錄水平的影響
注:NP:流感病毒核蛋白;M:流感病毒基質蛋白;三種抑制模式下各自病毒對照組的Ct 平均值取等于1;直接抑制模式下,NP:16.82±0.06;M:16.14±0.90;吸附階段抑制模式下,NP:13.51±1.03;M:12.78±0.18;吸附后復制增殖階段抑制模式下,NP:13.42±0.75;M:12.90±0.03;: 與病毒對照組相比,P<0.05;:與燕窩酶解液組相比,P<0.05
相對于病毒對照組病毒基因NP 和M 的相對轉錄水平直接抑制 吸附階段抑制 吸附后復制增殖階段抑制NP M NP M NP M燕窩酶解液組 3 0.41±0.14a 0.43±0.06a 1.09±0.16a 1.13±0.14a 1.69±0.27 1.67±0.24燕窩液組 3 0.73±0.20 0.74±0.13 0.91±0.18b 0.61±0.18ab 0.58±0.08 0.39±0.14ab中性蛋白酶組 3 1.52±0.34ab 1.41±0.31ab 1.40±0.20 1.00±0.12b 1.31±0.46a 0.93±0.29 F 值 9.92 11.27 6.14 14.31 3.79 6.24 P 值 0.005 0.003 0.018 <0.001 0.059 0.017組別 份數
表3 顯示, 不同組別在不同作用時間NP 轉錄水平比較差異有統(tǒng)計學意義(F=230.90、5.76、197.00、427.20 和 39.89,P 均<0.05)。 與病毒對照組相比,在0 h 和2 h 時燕窩酶解液組NP 基因的轉錄水平降低 10 倍 (t=-13.79,P=0.005;t=-21.84,P=0.002);燕窩液組 NP 轉錄水平也降低 (t=-13.22,P=0.006;t=-36.94,P=0.001), 差異具有統(tǒng)計學意義; 在-4 h和-2 h 及4 h 加入燕窩酶解液處組,NP 基因轉錄水平升高(t=19.22,P=0.003;t=2.97,P=0.097;t=2.43,P=0.136)。
表3 燕窩酶解液不同作用時間對流感病毒NP 轉錄水平的影響
注:組間兩兩比較采用LSD 檢驗,:表示與病毒對照組相比,P<0.05
不同作用時間流感病毒NP 的轉錄水平-4 h -2 h 0 h 2 h 4 h病毒對照組 3 4.84×106±2.72×105 1.15×107±3.03×105 1.14×107±9.64×105 1.36×107±6.29×105 1.11×107±6.12×105燕窩酶解液組 3 1.93×107±7.91×105a 1.42×107±1.03×106 1.08×106±1.14×105a 1.28×106±3.83×105a 1.35×107±8.43×105a燕窩液組 3 1.61×107±8.91×105a 1.34×107±9.36×105 2.69×106±3.39×104a 2.03×106±3.63×105a 1.81×107±89.13×105a F 值 230.90 5.76 197.00 427.20 29.89 P 值 <0.001 0.040 <0.001 <0.001 <0.001組別 份數
表4 和圖4 顯示,與燕窩液組相比,燕窩酶解液組的病毒 NP、M、炎癥因子 IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、NF-κB 及其家族成員 NF-κBp65 的轉錄水平均降低(t=-13.15、-15.27、-15.12、-21.31、-4.85、-7.40、-13.77 和-29.39,P 均<0.05)。 燕窩酶解液處理組的NF-κBp65 及其前體IKK 蛋白的磷酸化程度和蛋白表達量也都降低。
圖4 燕窩酶解液抑制NF-κB 的蛋白表達結果
表4 燕窩酶解液對流感病毒基因及炎癥因子轉錄水平的影響
注:NP:流感病毒核蛋白;M:流感病毒基質蛋白
組別 份數 流感病毒基因及炎癥因子的轉錄水平NP M NF-κB NF-κBp65 IL-1β IL-6 TNF-α IFN-γ病毒+燕窩酶解液組 6 0.64±0.12 0.99±0.24 0.29±0.05 0.24±0.03 89.21±12.17 0.018±0.004 8.41±0.99 0.019±0.002病毒+燕窩液組 6 0.89±0.19 1.20±0.32 0.73±0.18 0.49±0.04 304.68±25.86 0.360±0.022 15.91±1.95 0.307±0.005 t 值 -13.15 -15.27 -13.77 -29.39 -15.12 -21.31 -4.85 -7.40 P 值 0.048 0.016 0.027 0.003 <0.001 <0.001 0.002 0.008
燕窩水提物可以抑制流感病毒感染犬腎細胞和紅細胞血凝反應, 能安全有效預防流感病毒。中性蛋白酶作為一種天然酶制劑,既能夠催化分解燕窩中蛋白質為小分子的蛋白、 小肽和游離的氨基酸,同時其本身不會對燕窩的生物學特性產生影響,本文通過對燕窩的酶解提取,探討其對抗病毒作用的影響,為進一步研究燕窩抗流感機制提供參考。
在最佳液料比和酶解時長條件下,燕窩唾液酸的提取率可以達到(66.87±0.05)%,高于未經酶解的燕窩唾液酸。本研究通過MTT 法測定出燕窩酶解液在細胞上最大無毒濃度為1.22 mg/mL。
從本文子代病毒產生的結果來看,燕窩酶解液可以通過直接抑制流感病毒和抑制病毒吸附后增殖的2 種方式來降低子代病毒產生量。 從病毒基因NP 和M 的轉錄水平上看, 燕窩酶解液僅能通過直接抑制的方式降低病毒基因轉錄,其作用機制可能是酶解液通過影響流感病毒的穿入和內化過程降低了病毒NP 的轉錄水平。 本文試驗結果表明燕窩酶解液和燕窩液主要在病毒孵育初期(0 h)發(fā)揮作用,降低病毒基因NP 的轉錄。 相比燕窩液,燕窩酶解液的效果更好,NP 的表達更低。
NF-κB 的激活與流感病毒感染后雙向相關,感染早期NF-κB 被激活, 感染后期 NF-κB 參與病毒的復制。 本試驗結果顯示燕窩酶解液可以直接作用于流感病毒, 降低病毒基因NP 和M 的轉錄水平,降低 NF-κB 及其前體蛋白的表達。NF-κB 能啟動和調控眾多參與炎癥過程細胞因子和炎癥介質的基因表達,但燕窩如何激活免疫信號通路還需要深入研究。
綜上,酶解過程可以提高燕窩中唾液酸的提取率,制備的燕窩酶解液可以抑制流感病毒轉錄水平NF-κB 蛋白及調控的炎癥因子的表達。 本文結果表明進一步探討燕窩與流感病毒的作用機制,可以為流感病毒的防治和藥物研發(fā)提供新的思路。
利益沖突
所有作者均聲明不存在利益沖突作者貢獻聲明
路鑫怡:實驗研究、采集數據、分析數據、統(tǒng)計分析、論文撰寫及修改;沃恩康,楊新燕,楊燦,徐琦,楊柳,何泳愉,項婷婷:論文修改;郭潮潭:研究指導、論文指導、經費支持