茅國(guó)峰 張小姣

紹興市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，紹興 312000

多重耐藥細(xì)菌感染是臨床醫(yī)生面臨的一個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題。 革蘭陰性菌可導(dǎo)致對(duì)多種或全部常用抗菌藥物耐藥， 這促使人們?cè)谠缙诳咕幬镏袑ふ姨娲?，如黏菌素（CST）。 CST 類是從產(chǎn)孢子多黏桿菌中分離出的一組陽(yáng)離子環(huán)狀多肽抗菌藥物，屬于多黏菌素家族。 羰基氰氯苯腙（CCCP）是脂溶性質(zhì)子泵抑制劑，為功能強(qiáng)大的解偶聯(lián)劑，已廣泛用于革蘭陰性菌主動(dòng)外排的研究。 最近，CCCP 誘導(dǎo)多黏菌素逆轉(zhuǎn)對(duì)大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的耐藥性已有報(bào)道，但這種增強(qiáng)作用的原因尚不清楚。 本文通過(guò)尋找能夠逆轉(zhuǎn)多黏菌素耐藥性的化學(xué)物質(zhì)，包括苯甲酸鈉（SB）和水楊酸鈉 （SS）， 為臨床治療多重耐藥菌感染提供更多依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

一、菌株來(lái)源

2020 年1—12 月收集紹興市人民醫(yī)院 163 株非重復(fù)革蘭陰性桿菌菌株，共篩選到多黏菌素耐藥菌9 株，包括鮑曼不動(dòng)桿菌5 株、變形桿菌2 株、大腸埃希菌1 株、銅綠假單胞菌1 株。 另外，各選1 株對(duì)多黏菌素敏感的大腸埃希菌（編號(hào)：92407）、銅綠假單胞菌（編號(hào)：020417）和鮑曼不動(dòng)桿菌（編號(hào)：91804），作為時(shí)間-殺菌試驗(yàn)的對(duì)照菌株。 大腸埃希菌ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC27853，均購(gòu)自原衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

二、試劑和儀器

全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)VITEK MS 購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司；血瓊脂平板購(gòu)自鄭州安圖公司；微量肉湯稀釋法試劑盒購(gòu)自溫州康泰生物生物科技有限公司； 多黏菌素和CCCP 質(zhì)子泵抑制劑及SB 和 SS 化合物購(gòu)自 Sigma 公司；PCR 儀購(gòu)自德國(guó)Biometra 公司；Taq 酶及PCR 反應(yīng)相關(guān)試劑購(gòu)自日本Takara 公司；紫外成像系統(tǒng)購(gòu)自德國(guó)Whatman Biometra 公司。

三、細(xì)菌鑒定

菌種鑒定采用法國(guó)生物梅里埃公司生產(chǎn)的VITEK MS 全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)。

四、藥敏試驗(yàn)

采用2 倍連續(xù)稀釋法和固定濃度法，分別單獨(dú)檢測(cè)多黏菌素、CCCP、SB、SS 的最低抑菌濃度（MIC）及多黏菌素聯(lián)合 15/30 μmol/L CCCP、15/30 mmol/L SB 和 15/30 mmol/L SS 的 MIC， 初步檢測(cè)各種潛在增強(qiáng)劑的MIC 值。 根據(jù)CLSI M100 2020 版判定標(biāo)準(zhǔn)，大腸埃希菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)多黏菌素的耐藥折點(diǎn)均≥4 mg/L。

MIC 測(cè)定按照 CLSI 指南和 EUCAST 建議進(jìn)行。 同時(shí)檢測(cè)多黏菌素單獨(dú)及聯(lián)合CCCP、SB 和SS對(duì)大腸埃希菌ATCC25922 和銅綠假單胞菌ATCC27853 MIC 的影響。用于測(cè)定多黏菌素MIC 的濃度范圍為0.063~4 096 mg/L， 所有MIC 測(cè)定至少3 次。 一旦確定了MIC， 計(jì)算部分抑菌濃度指數(shù)（FIC） 用來(lái)評(píng)估多黏菌素和每種化學(xué)物質(zhì)之間的協(xié)同作用。 FIC=MIC/MIC+MIC/MIC。 FIC≤0.5 為協(xié)同作用，0.5

五、mcr 耐藥基因測(cè)定

煮沸法提取細(xì)菌DNA 模板。 mcr-1 基因引物序列為 F:5'-GCTCGGTCAGTCCGTTTG-3'；R：5'-GA ATGCGGTGCGGTCTTT-3'）；mcr-2 序列 F:5'-TGTT GCTTGTGCCGATTGGA-3'；R：5'-AGATGGTATTGT TGGTTGCTG-3'）。 反應(yīng)條件為：95 ℃變性 3 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s， 共 33 個(gè)循環(huán)；最后，72 ℃延伸10 min。 PCR 擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）確定耐藥基因分型。

六、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合試驗(yàn)

挑選攜帶mcr 耐藥基因大腸埃希菌作為供體菌， 利福平耐藥的大腸埃希菌EC600 作為受體菌，體外共培養(yǎng)獲取相應(yīng)接合子。接合子用含3 mg/L 多黏菌素和300 mg/L 利福平的中國(guó)藍(lán)平板篩選接合子。 篩選出接合子與受體菌形態(tài)相同，PCR 確證接合子是否攜帶mcr 基因。

七、時(shí)間-殺菌試驗(yàn)

挑取純培養(yǎng)7 株多黏菌素耐藥菌落于2 mL 肉湯中，35 ℃18 h 過(guò)夜培養(yǎng)。 將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液調(diào)節(jié)至0.5 麥?zhǔn)蠞岫?，再將其稀?00 倍，搖床震蕩1.5 h（t+0 h）。 在預(yù)先配置好多黏菌素藥物濃度（4 mg/L）的肉湯中接種t+0 h 的菌液，使得初始濃度在10CFU/mL左右， 單獨(dú)及聯(lián)合30 mmol/L SB、30/15 mmol/L SS或30 μmol/L CCCP 進(jìn)行時(shí)間-殺菌試驗(yàn)。 37 ℃培養(yǎng)24 h，在 7 個(gè)時(shí)間點(diǎn)（t+0、t+2、t+4、t+8、t+12、t+24 和t+48 h）取10 μL 菌液進(jìn)行適當(dāng)稀釋涂布平皿，通過(guò)連續(xù)稀釋法測(cè)定樣本中的活菌落數(shù)。 若同一濃度中聯(lián)合藥物組最低菌落計(jì)數(shù)比單藥組最低菌落計(jì)數(shù)減少≥3 lgCFU/mL 定義為殺菌作用； 減少≥2 lg CFU/mL 定義為協(xié)同作用； 減少≤1 lgCFU/mL 定義為無(wú)關(guān)作用；聯(lián)合后增加≥2 lgCFU/mL 則定義為拮抗作用。

結(jié) 果

一、多黏菌素耐藥株MIC

9 株多黏菌素耐藥菌株的 MIC 分別為 4、8、4、8、32、1 024、2 048、8 和 4 mg/L， 范圍為 4～64 μg/mL（敏感折點(diǎn)為≤2 mg/L）。 從1 株多黏菌素耐藥大腸埃希菌中檢測(cè)到mcr-1 基因， 未成功將耐藥質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到受體菌中。

二、質(zhì)子泵抑制劑和化合物對(duì)多黏菌素MIC 的影響

結(jié)果表明，30 μmol/L（5 mg/L）CCCP 可降低所有實(shí)驗(yàn)菌株的多黏菌素MIC。 除變形桿菌之外，30 μmol/L CCCP、30 mmol/L SB、15 mmol/L SS 和 30 mmol/L SS可將菌株的MIC 降低至臨床折點(diǎn)以下（≤2 mg/L）。除1株鮑曼不動(dòng)桿菌和變形桿菌之外，15 μmol/L CCCP可將其他菌株的MIC 降低至臨床折點(diǎn)以下。 使用CCCP 質(zhì)子泵抑制劑后，2 株天然耐藥的變形桿菌菌株多黏菌素的MIC 最低， 但仍然為≥128 mg/L。30 μmol/L CCCP 將2 株鮑曼不動(dòng)桿菌菌株多黏菌素的MIC 下降幅度最大， 數(shù)值只有原來(lái)的1/64；2株ATCC 質(zhì)控菌株的多黏菌素MIC 下降了50%，但兩個(gè)濃度的SB 和SS 對(duì)質(zhì)控菌株的MIC 沒(méi)有任何影響。 具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 CCCP、SB 和SS 對(duì)各類菌株CST 的最低抑菌濃度的影響（mg/L）

注：CST：多黏菌素；CCCP：羰基氰氯苯腙；SB：苯甲酸鈉；SS:水楊酸鈉；CCCP15：15 μmol/L CCCP；CCCP30：30 μmol/L CCCP；SB15：15 mmol/L SB；SB30：30 mmol/L SB；SS15：15 mmol/L SS；SS30：30 mmol/L SS；：殺菌試驗(yàn)中對(duì)多黏菌素耐藥菌株；：殺菌試驗(yàn)中對(duì)多黏菌素敏感菌株

菌株名稱 CST CCCP CST+CCCP15 CST+CCCP30 SB CST+SB15 CST+SB30 SS CST+SS15 CST+SS30鮑曼不動(dòng)桿菌72909a 4 272 1 0.5 139 2 1 125 2 1鮑曼不動(dòng)桿菌82809 8 272 1.0 0.5 139 4 2 125 2 1鮑曼不動(dòng)桿菌90801 4 272 0.5 0.25 139 2 1 125 1 0.5鮑曼不動(dòng)桿菌120309 8 272 2 0.125 139 2 1 125 2 0.5鮑曼不動(dòng)桿菌120310 32 272 4 0.5 139 4 2 125 2 1變形桿菌11213a 1 024 136 1 024 128 278 1 024 1 024 250 1 024 1 024變形桿菌11215 2 048 136 2 048 128 278 2 048 2 048 250 2 048 2 048大腸埃希菌91610a 8 68 2 0.25 139 4 1 250 2 1銅綠假單胞菌011917a 4 136 2 0.5 139 2 1 125 2 1大腸埃希菌ATCC25922 0.5 68 0.5 0.25 139 0.5 0.5 62.5 0.5 0.5銅綠假單胞菌ATCC27853 0.5 136 0.5 0.25 139 0.5 0.5 62.5 0.5 0.5大腸埃希菌b 1 136 0.5 0.5 139 0.5 0.25 62.5 1 0.5銅綠假單胞菌b 1 136 1 0.5 139 1 0.5 62.5 1 0.5鮑曼不動(dòng)桿菌b 1 136 1 0.5 139 1 1 62.5 1 0.5

三、聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果

FIC 結(jié)果顯示， 多黏菌素與 CCCP 或 SB 或 SS聯(lián)合后，對(duì)除變形桿菌之外的7 株細(xì)菌均有協(xié)同或相加作用。 其中，30 μmol/L CCCP 對(duì)包括變形桿菌在內(nèi)的所有菌株均有協(xié)同作用，30 mmol/L SB 和30 mmol/L SS 對(duì)除變形桿菌之外的所有菌株均有協(xié)同作用，多黏菌素聯(lián)合15 μmol/L CCCP、15 mmol/LSB、30 mmol/L SB、15 mmol/L SS 或 30 mmol/L SS 對(duì)變形桿菌的聯(lián)合藥敏結(jié)果均無(wú)作用。本次聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)中，未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生拮抗作用的菌株，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 CST 聯(lián)合 CCCP、SB、SS 的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：CST：多黏菌素；CCCP：羰基氰氯苯腙；SB：苯甲酸鈉；SS:水楊酸鈉；FIC：部分抑菌濃度指數(shù)；DI：藥物相互作用；CCCP10：10 μmol/L CCCP；CCCP25：25 μmol/L CCCP；SB14：14 mmol/L SB；SB28：28 mmol/L SB；SS14：14 mmol/L SS；SS28：28 mmol/L SS

菌株名稱 CST+CCCP10 CST+CCCP25 CST+SB14 CST+SB28 CST+SS14 CST+SS28 FIC DI FIC DI FIC DI FIC DI FIC DI FIC DI鮑曼不動(dòng)桿菌72909 0.287 協(xié)同 0.217 協(xié)同 0.601 相加 0.451 協(xié)同 0.612 相加 0.474 協(xié)同鮑曼不動(dòng)桿菌82809 0.162 協(xié)同 0.154 協(xié)同 0.601 相加 0.451 協(xié)同 0.362 協(xié)同 0.349 協(xié)同鮑曼不動(dòng)桿菌90801 0.162 協(xié)同 0.154 協(xié)同 0.601 相加 0.451 協(xié)同 0.362 協(xié)同 0.349 協(xié)同鮑曼不動(dòng)桿菌120309 0.287 協(xié)同 0.108 協(xié)同 0.351 協(xié)同 0.326 協(xié)同 0.362 協(xié)同 0.287 協(xié)同鮑曼不動(dòng)桿菌120310 0.162 協(xié)同 0.108 協(xié)同 0.226 協(xié)同 0.264 協(xié)同 0.175 協(xié)同 0.287 協(xié)同變形桿菌11213 1.278 無(wú)關(guān) 0.309 協(xié)同 1.050 無(wú)關(guān) 1.101 無(wú)關(guān) 1.056 無(wú)關(guān) 1.112 無(wú)關(guān)變形桿菌11215 1.278 無(wú)關(guān) 0.247 協(xié)同 1.050 無(wú)關(guān) 1.101 無(wú)關(guān) 1.056 無(wú)關(guān) 1.112 無(wú)關(guān)大腸埃希菌91610 0.397 協(xié)同 0.399 協(xié)同 0.601 相加 0.326 協(xié)同 0.181 協(xié)同 0.237 協(xié)同銅綠假單胞菌011917 0.575 相加 0.309 協(xié)同 0.601 相加 0.451 協(xié)同 0.612 相加 0.474 協(xié)同

四、多黏菌素體外殺菌試驗(yàn)結(jié)果

多黏菌素聯(lián)合30 μmol/L CCCP 對(duì)除變形桿菌之外的所有菌株均有較強(qiáng)的殺菌作用， 對(duì)變形桿菌具有較好的協(xié)同作用。 在t+4 h， 多黏菌素聯(lián)合30 μmol/L CCCP 或 30 mmol/L SB 或 15 mmol/L SS或30 mmol/L SS 對(duì)大腸埃希菌的最低菌落計(jì)數(shù)均減少≥3lg CFU/mL；在t+8 h，多黏菌素聯(lián)合30 μmol/L CCCP 或 28 mmol/L SB 或 14 mmol/L SS 或28 mmol/L SS 對(duì)銅綠假單胞菌的最低菌落計(jì)數(shù)均減少≥3lg CFU/mL； 在 t+12 h， 多黏菌素聯(lián)合 30 μmol/L CCCP 或 28 mmol/L SB 或 15 mmol/L SS 或30 mmol/L SS 對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的最低菌落計(jì)數(shù)均減少≥3lg CFU/mL；多黏菌素聯(lián)合 30 μmol/L CCCP 在t+12 h 之后對(duì)變形桿菌具有協(xié)同作用。 所有多黏菌素耐藥菌株在48 h 時(shí)殺菌效果達(dá)到了最佳狀態(tài)。具體結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 多黏菌素單獨(dú)及聯(lián)合CCCP、SB 和SS 時(shí)的體外殺菌曲線

討 論

多黏菌素被認(rèn)為是目前治療碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌的最后一道防線，因此耐藥多黏菌素細(xì)菌的廣泛傳播引起了臨床工作者的警惕。 質(zhì)粒介導(dǎo)的可移動(dòng)多黏菌素耐藥基因mcr 可在動(dòng)物、食品、農(nóng)場(chǎng)、人類和環(huán)境中分離到的不同細(xì)菌中檢出。 本研究從多黏菌素耐藥大腸埃希菌（MIC=8 mg/L）中檢測(cè)到mcr-1 耐藥基因， 推測(cè)該基因在菌株對(duì)多黏菌素耐藥機(jī)制中發(fā)揮了重要作用，但結(jié)合試驗(yàn)未取得成功，可能與菌株耐藥質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到受體菌需要付出適應(yīng)性代價(jià)有關(guān)。

CCCP 是最典型的質(zhì)子泵抑制劑， 為一種抑制質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)的解耦聯(lián)劑，其作用是破壞外排系統(tǒng)的主動(dòng)外排作用，能顯著降低耐藥菌的MIC。 有研究表明，CCCP 可逆轉(zhuǎn)大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、變形桿菌屬等對(duì)多黏菌素的耐藥性。 本研究對(duì)9 株多黏菌素耐藥革蘭陰性菌菌株進(jìn)行了檢測(cè)， 結(jié)果顯示，CCCP、SB 或 SS 聯(lián)合多黏菌素后，均可不同程度地降低多黏菌素的MIC 值，SB 和SS引起的多黏菌素耐藥性逆轉(zhuǎn)與CCCP 相似， 除變形桿菌之外，其余大部分菌株對(duì)多黏菌素的MIC 均下降至折點(diǎn)以下。 SS 和SB 對(duì)多黏菌素MIC 的下降原因不能完全用外排泵來(lái)解釋，其作用機(jī)制可能與其生理pH 下的負(fù)電荷及脂溶性有關(guān)。 本研究中，高濃度 CCCP（30 μmol/L）對(duì)多黏菌素 MIC 逆轉(zhuǎn)的幅度最大，但低濃度 CCCP（15 μmol/L）對(duì) 2 株 ATCC質(zhì)控菌株的MIC 沒(méi)有任何變化，同Malla 等研究類似，可見(jiàn)高濃度的CCCP、SB 和SS 對(duì)增強(qiáng)多黏菌素的殺菌能力更有效，濃度依賴性的抑菌劑可更有效地增強(qiáng)多黏菌素的殺菌作用。

本次聯(lián)合藥敏結(jié)果顯示， 多黏菌素和CCCP 或SB 或SS 聯(lián)合后， 對(duì)除變形桿菌之外的細(xì)菌均有協(xié)同或相加作用， 高濃度的CCCP 對(duì)包括變形桿菌在內(nèi)的所有菌株均有協(xié)同作用，且所有聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果中均未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生拮抗作用的菌株，殺菌試驗(yàn)結(jié)果與聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果基本一致。 以上結(jié)果表明，SB 和SS 均是多黏菌素良好的抗菌佐劑， 它們對(duì)獲得性耐藥菌株具有類似CCCP 的殺菌效果。 但SB、SS 與 CCCP 不同， CCCP 是一種氧化磷酸化抑制劑，具有較大的毒性，可導(dǎo)致細(xì)胞的逐漸損害以及生命體的死亡，而SB 和SS 毒性較小且已被批準(zhǔn)用做人類食用防腐劑，并能治療和預(yù)防很多疾病。根據(jù)本研究初步結(jié)果，SB 和SS 可部分或完全逆轉(zhuǎn)多黏菌素的耐藥性，這為臨床在治療多黏菌素耐藥革蘭陰性菌引起的感染提供了新的思路。

綜上，SB 和SS 可部分或完全逆轉(zhuǎn)多黏菌素的耐藥性，是包括多黏菌素等抗菌藥物治療的良好促進(jìn)劑。 但因本研究中菌株數(shù)量有限，且不同革蘭陰性菌對(duì)多黏菌素耐藥機(jī)制存在差異，故SB 和SS 逆轉(zhuǎn)不同革蘭陰性菌對(duì)多黏菌素耐藥性的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

利益沖突

所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

茅國(guó)峰：設(shè)計(jì)研究思路及方案、統(tǒng)計(jì)分析、撰寫論文；張小姣：材料收集、實(shí)驗(yàn)操作