吳帶娣，黃慧玲，單耀楷，鄒 璇，龔麗珍，詹若挺, 3，陳立凱, 3*

? 藥材與資源 ?

廣藿香基因克隆及其參與廣藿香醇生物合成功能分析

吳帶娣1, 2，黃慧玲1, 2，單耀楷1, 2，鄒 璇1, 2，龔麗珍1, 2，詹若挺1, 2, 3，陳立凱1, 2, 3*

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006 2. 嶺南中藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州中醫(yī)藥大學(xué)），廣東 廣州 510006 3. 嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，廣東 茂名 525000

從廣藿香中克隆HAD（haloacid dehalogenase）超級(jí)家族蛋白水解酶基因，驗(yàn)證其編碼蛋白與廣藿香醇合酶（patchoulol synthase，PcPTS）蛋白互作，探究其參與調(diào)控廣藿香醇生物合成的作用。從廣藿香轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，篩選出一條具有完整編碼區(qū)并且包含HAD-like結(jié)構(gòu)域的基因序列（），并對(duì)該基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析。利用qRT-PCR對(duì)的表達(dá)模式進(jìn)行分析。利用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證PcHAD與廣藿香PcPTS蛋白的互作情況。通過(guò)瞬時(shí)過(guò)表達(dá)，分析其對(duì)廣藿香醇甲羥戊酸合成途徑（mevalonate pathway，MVA）相關(guān)基因的表達(dá)以及對(duì)廣藿香醇含量的影響。從廣藿香中克隆得到HAD-like基因，其開(kāi)放閱讀框?yàn)?149 bp，編碼蛋白長(zhǎng)度為382個(gè)氨基酸，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為43 000，且為不穩(wěn)定的親水性蛋白，亞細(xì)胞定位結(jié)果表明該蛋白定位于葉綠體。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PcHAD完整蛋白能與PcPTS完整蛋白互作，且PcHADN與PcPTSN互作。與對(duì)照組相比，瞬時(shí)過(guò)表達(dá)廣藿香葉中的廣藿香醇含量提高了30%，MVA途徑基因包含、和在內(nèi)表達(dá)量均顯著上調(diào)。從廣藿香中克隆得到1個(gè)與廣藿香醇合酶PcPTS互作的基因，該基因在瞬時(shí)過(guò)表達(dá)后上調(diào)和MVA途徑多個(gè)基因的表達(dá)量，且能夠顯著提高廣藿香醇的含量，表明該基因可能在廣藿香醇生物合成中發(fā)揮正向調(diào)控作用，為進(jìn)一步揭示廣藿香中HAD-PTS復(fù)合體的功能提供科學(xué)依據(jù)。

廣藿香；廣藿香醇；HAD；蛋白互作；合成調(diào)控；功能分析

廣藿香(Blanco) Benth為唇形科刺蕊草屬植物，其干燥地上部分為藥用部分。廣藿香作為芳香化濕藥的代表之一，具有芳香化濁、開(kāi)胃止嘔、發(fā)表解暑的功效[1]。廣藿香不僅是中成藥的主要原料，也是抗病毒口服液、藿香正氣水、藿香鼻炎膠囊等中成藥的重要組成部分。廣藿香油是廣藿香提取的揮發(fā)性成分，是廣藿香諸多藥效的主要成分。廣藿香油除了作為藥用，還廣泛用于輕化工業(yè)，可作為配制各種殺蟲(chóng)劑、定香劑和化妝護(hù)膚品等的重要原料[2-4]，市場(chǎng)需求大，具有廣闊的應(yīng)用前景。雖然廣藿香已在亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛種植，如印度、馬來(lái)西亞、中國(guó)和越南，但從廣藿香植物中提取的廣藿香油含量低（干質(zhì)量比為0.54%～5.20%）且不穩(wěn)定，難以滿足全球市場(chǎng)對(duì)廣藿香藥材的巨大需求[5-6]。因此需要系統(tǒng)研究其合成積累機(jī)制，采用新的技術(shù)手段調(diào)控廣藿香油含量，而利用自身代謝途徑是提高廣藿香油產(chǎn)量的有效途徑。

廣藿香醇（patchoulol）是廣藿香油的主要成分，是1種三環(huán)倍半萜類的次生代謝化合物，是我國(guó)歷版藥典中用于評(píng)價(jià)廣藿香藥材及廣藿香油質(zhì)量的指標(biāo)成分。在廣藿香中廣藿香醇主要是在甲羥戊酸途徑（mevalonate pathway，MVA）進(jìn)行合成，其合成主要分為3個(gè)階段，第1個(gè)階段是異戊烯基二磷酸酯（isopentenyl diphosphate，IPP）和二甲基烯丙基二磷酸（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP）的合成；在前體IPP的合成中，6種酶參與反應(yīng)，包括乙酰乙酰輔酶A硫解酶（acetoacetyl-CoA thiolase，AACT）、羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶（hydroxymethylglutaryl-CoA synthase，HMGS）、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（hydroxymethylglutaryl-CoA reductase，HMGR）、甲羥戊酸激酶（mevalonate kinase，MVK）、磷酸甲羥戊酸激酶（phosphomevalonate kinase，PMK）和甲羥戊酸二磷酸脫羧酶（mevalonate pyrophosphate decarboxylase，MPD），IPP和DMAPP在異戊烯基異構(gòu)酶的作用下可以相互轉(zhuǎn)換；第2階段，廣藿香醇直接前體的生成，法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase，F(xiàn)PPS）縮合IPP和DMAPP以形成法尼基焦磷酸；第3階段，廣藿香醇合酶（patchoulol synthase，PcPTS）催化法尼基焦磷酸生成廣藿香醇[7-8]。根據(jù)廣藿香醇的生物合成途徑可知，PcPTS能直接催化法呢基焦磷酸生成倍半萜類終產(chǎn)物廣藿香醇，是調(diào)控廣藿香醇生物合成的關(guān)鍵，因此PcPTS功能受到了不少研究者的關(guān)注。6-丙酮酰四氫蝶呤合酶基因的克隆[9]、表達(dá)規(guī)律[10]和酶活功能[11]等已有不少報(bào)道。另外關(guān)于調(diào)控廣藿香醇合酶的轉(zhuǎn)錄因子的研究已也取得新進(jìn)展，如陳秀珍等[12]找到了調(diào)控的6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子PatDREB、PatERF061和PatSWC4等，并對(duì)其功能進(jìn)行了分析。黃偉展等[13]成功構(gòu)建pRI101-PTS過(guò)表達(dá)載體，獲得了遺傳過(guò)表達(dá)廣藿香植株，這些研究為探討廣藿香醇生物合成的分子調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。

絕大多數(shù)蛋白質(zhì)通過(guò)配體或者以復(fù)合體的形式參與調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)，在轉(zhuǎn)錄、翻譯、信號(hào)傳遞等方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用，因此研究蛋白互作對(duì)理解分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)至關(guān)重要。酵母雙雜交是研究植物蛋白間互作非常有用的系統(tǒng)，是篩選和發(fā)現(xiàn)新互作蛋白的一項(xiàng)首選技術(shù)[14]。在高通量篩選和嚴(yán)格篩選壓力的基礎(chǔ)上，許多研究通過(guò)雙雜交方法獲得了候選獵物蛋白，如小麥[15]、擬南芥[16]、水稻[17]等。也有許多研究通過(guò)雙雜驗(yàn)證2個(gè)蛋白之間的互作并明確互作結(jié)構(gòu)域，如小麥[18]、番茄[19]、水稻[20]等。目前對(duì)PcPTS在萜類化合物合成途徑中涉及到的蛋白尚不清楚。因此，為了進(jìn)一步解析廣藿香醇生物合成的分子機(jī)制，課題組前期構(gòu)建了廣藿香cDNA酵母文庫(kù)，以PcPTS為誘餌，篩選到候選互作蛋白HAD-like蛋白PcHAD。本實(shí)驗(yàn)對(duì)基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位分析以及組織表達(dá)模式分析。通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)驗(yàn)證PcHAD蛋白與PcPTS蛋白互作，進(jìn)一步利用瞬時(shí)過(guò)表達(dá)和RT-qPCR分析PcHAD蛋白對(duì)廣藿香醇生物合成的調(diào)控作用。本研究揭示PcHAD參與調(diào)控廣藿香醇的生物合成的分子機(jī)制，為藥用植物次生代謝合成調(diào)控提供新的思路。

1 材料、試劑及儀器

1.1 材料

本研究材料廣藿香采集于廣州中醫(yī)藥大學(xué)時(shí)珍山，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)詹若挺研究員鑒定為唇形科刺蕊草屬植物廣藿香(Blanco) Benth.。繁育廣藿香植物在嶺南中藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 試劑

pLB零背景快速克隆試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司植物?？俁NA提取試劑盒購(gòu)自于上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA膠回收試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、PCR酶2×Phanta Master Mix，2×Taq Plus Master Mix II（Dye Plus）、均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。DH5α Chemically Competent Cell，GV3101（pSoup-p19），Y2HGold Chemically Competent Cell均購(gòu)自上海唯地生物科技有限公司。金擔(dān)子素A（aureobasidin A，AbA）、5-溴-4-氯-3-吲哚-α--吡喃半乳糖苷（X-α-Gal）均購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司。引物合成和基因測(cè)序由廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司完成。

1.3 儀器

電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；凝膠成像儀分析系統(tǒng)（廣州博鷺騰儀器儀表有限公司）；CFX960熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；PCR儀（杭州博日科技有限公司）；激光共聚焦顯微鏡（蔡司ZEISS）；Q Exactive mass spectrometer質(zhì)譜儀（Thermo fisher公司）。

2 方法

2.1 PcHAD基因的克隆

課題組前期進(jìn)行酵母雙雜文庫(kù)篩選得到候選互作蛋白并利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)候選互作蛋白進(jìn)行注釋分析，發(fā)現(xiàn)包含1個(gè)含HAD-like結(jié)構(gòu)域的蛋白。為了進(jìn)一步驗(yàn)證廣藿香中的含HAD-like結(jié)構(gòu)域的蛋白與PcPTS的蛋白互作關(guān)系，本試驗(yàn)利用其GenBank蛋白序列號(hào)下載蛋白氨基酸序列，利用本地Blast方法與廣藿香全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBI：PRJNA528262）進(jìn)行blastp比對(duì)，選取比對(duì)分?jǐn)?shù)最高（567），e值為0并具有完整編碼框的基因。根據(jù)獲得的候選基因序列，設(shè)計(jì)引物（表1）擴(kuò)增完整編碼區(qū)。

表1 基因克隆及載體構(gòu)建引物序列

Table 1 Primers used for gene cloning and vector construction

基因名引物序列 (5’→3’)用途 PcHADF: ATGGTGGATTCAATTGCTGC基因克隆 R: TCACCAGAATCCATCATCATAAA PcHADF: CATGGAGGCCAGTGAATTCATGGTGGATTCAATTGCTGCAACPGADT7載體 R: GCTCGAGCTCGATGGATCCTCACCAGAATCCATCATCATAAACACCTACT PcHADNF: CATGGAGGCCAGTGAATTCATGGTGGATTCAATTGCTGCAACPGADT7載體 R: CAGCTCGAGCTCGATGGATCCACCTAACCACCCACAACCCAT PcHADCF: GCCATGGAGGCCAGTGAATTCGCTGTATTTGAGTGGGAAGGTGTPGADT7載體 R: GCTCGAGCTCGATGGATCCTCACCAGAATCCATCATCATAAACACCTACT PcPTSF: TCAGAGGAGGACCTGCATATGATGGAGTTGTATGCCCAAAGTGTTPGBKT7載體 R: GCTAGTTATGCGGCCGCTTAATATGGAACAGGGTGAAGGTACAACT PcPTSNF: TCAGAGGAGGACCTGCATATGATGGAGTTGTATGCCCAAAGTGTTPGBKT7載體 R: GGTTATGCTAGTTATGCGGCCGCGTGATGAGATGCGTATTGCTCGTAG PcPTSCF: CAGAGGAGGACCTGCATATGAAAGGCTTGCTCAAACTTGCTPGBKT7載體 R: TATGCTAGTTATGCGGCCGCAACAGGGTGAAGGTACAACTGC PcHADF: AGGACAGCCCAGATCACTAGTATGGTGGATTCAATTGCTGCA亞細(xì)胞定位載體 R: GCCCTTGCTCACCATGGATCCCCAGAATCCATCATCATAAACACC PcHADF: TTCGTGTTCTTGTCATTAATTAAATGGTGGATTCAATTGCTGCA過(guò)表達(dá)載體 R: TCAAGTTGCAGGACCGCGGCCGCTCACCAGAATCCATCATCATAAACA

提取廣藿香葉片的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA作模板，利用Vazyme高保真酶對(duì)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃、3 min；95 ℃變性15 s，56 ℃復(fù)性15 s，72 ℃延伸，33個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min。PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確定擴(kuò)增所得片段與預(yù)期大小一致之后，將目的基因片段純化回收并連接到克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)菌落PCR鑒定后挑取陽(yáng)性菌液，由廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司完成測(cè)序。

2.2 生物信息學(xué)分析

首先使用SnapGene軟件將獲得測(cè)序序列與原序列進(jìn)行對(duì)比初步確認(rèn)所獲序列的正確性，然后使用生物信息分析軟件和在線工具進(jìn)行分析。用ORFfinder預(yù)測(cè)其編碼的蛋白，利用ExPASy-ProtParam tool在工具預(yù)測(cè)編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，分別用SOPMA和SWISSMODEL對(duì)PcHAD蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析；采用Uniprot上的BLAST軟件進(jìn)行序列對(duì)比分析，下載序列相似性比較高的氨基酸序列利用DNA MAN進(jìn)行同源對(duì)比分析。

2.3 亞細(xì)胞定位分析

采用無(wú)縫克隆的方法將去除密碼子的片段克隆至載體pAN580綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)簽的N端。通過(guò)制備擬南芥原生質(zhì)體，利用聚乙二醇（polyethlene glycol，PEG）介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體[21]，在激發(fā)光為470 nm的條件下使用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP熒光信號(hào)，分析目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位情況。

2.4 表達(dá)模式分析

分別提取廣藿香不同組織部位的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用NCBI設(shè)計(jì)基因特異性引物（表2），進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。以為內(nèi)參，基因相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。每個(gè)樣品包含3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和2個(gè)技術(shù)重復(fù)，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2.5 酵母雙雜驗(yàn)證

擴(kuò)增帶有coRI和amHI酶切位點(diǎn)的和片段，分別連接至酵母表達(dá)載體pGADT7，構(gòu)建重組質(zhì)粒。將含有deI和otI酶切位點(diǎn)的和片段分別插入pGBKT7載體，獲得重組質(zhì)粒。將pGBKT7-PTS按照說(shuō)明書方法轉(zhuǎn)化Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞，在SD/-Trp缺陷培養(yǎng)基生長(zhǎng)2 d得到陽(yáng)性克隆，將單克隆用100 μL ddH2O混勻，按10倍梯度再稀釋3個(gè)濃度，分別點(diǎn)涂于SD/-Trp、SD/-Trp+X-α-Gal、SD/-Trp+X-α-Gal+AbA缺陷培養(yǎng)基上觀察菌斑生長(zhǎng)情況。隨后分別將誘餌質(zhì)粒和捕獲質(zhì)粒質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞，待長(zhǎng)出陽(yáng)性菌落后，挑取單克隆稀釋3個(gè)10倍梯度濃度點(diǎn)涂于SD/-Trp-Leu（DDO）、SD/-Trp-Leu-Ade-His（QDO）、SD/-Trp-Leu- Ade-His+X-α-Gal（QDO/X）、SD/-Trp-Leu-Ade- His+X-α-Gal+AbA（QDO/X/A）缺陷培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)3 d，待顯菌斑。

表2 qRT-PCR引物序列

Table 2 Primer used for qRT-PCR

基因名引物序列（5’→3’）用途 Pc18SF: TCGCCGTTCGGACCAAATAA內(nèi)參基因 R: CGATGGTTCACGGGATTCTGC PcHADF: CCAGAGACTTTCGGCATGGTqRT-PCR R: CCACCCACAACCCATCCTTT PcPTSF: TGGGTGCTGCTTCTCGTCCTCqRT-PCR R: TGCGTTGTGGACTTGTTTCG PcFPPSF: TGCCACTTCACCGTCGTATTqRT-PCR R: TTTCAGGCTCACCGAAGCAA PcIPPIF: AAATACGTGAATCGTGACGAGqRT-PCR R: CTTGTTTCAAAGTCCCATTC PcMVDF: AGACACCCACCAACAAGCGqRT-PCR R: CTCCTTTCCGTTGAGCCACA PcPMKF: TCGAAAGGCACCTCAAGACCqRT-PCR R: AAGCATAGCATCTCTGGCCC PcMVKF: ATGAGGTCGCTTCCATCATCqRT-PCR R: TTTCGATTGTAGCATGGCTG PcHMGRF: CACCGTCTTCTTCACGCTCTqRT-PCR R: GCGGGGAATAATGAGCGACT PcHMGSF: ACGGAGCAAGCAAAGGGAAAqRT-PCR R: TTCCAACTTCAAGGCGACCA PcAACTF: TGTGCCTCTGGAATGAAAGCAqRT-PCR R: CAGCATTCCATCAACCAGCG

2.6 在廣藿香葉片中瞬時(shí)過(guò)表達(dá)PcHAD基因

采用無(wú)縫克隆的方法將克隆至pJL-TRBO載體的acⅠ和otI之間，構(gòu)建煙草花葉病毒RNA介導(dǎo)的（Tabacco Mosaic Virus RNA-Based）植物過(guò)表達(dá)載體。以空載pJL-TRBO作為陰性對(duì)照，將構(gòu)建好的pJL-HAD質(zhì)粒和空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GV3101（pSoup-p19）菌株，通過(guò)農(nóng)桿菌注射法侵染廣藿香葉片。注射后第3天，取侵染后的葉片進(jìn)行基因表達(dá)變化（引物見(jiàn)表2）及揮發(fā)性成分含量的檢測(cè)。每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。

2.7 廣藿香揮發(fā)性成分提取與檢測(cè)

取瞬時(shí)過(guò)表達(dá)后廣藿香葉片在液氮下研磨成細(xì)粉，然后用正己烷提取，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）測(cè)定廣藿香揮發(fā)性成分含量[22]。

3 結(jié)果與分析

3.1 廣藿香PcHAD基因的克隆和生物信息學(xué)分析

提取廣藿香葉片總RNA，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，以獲得的HAD序列為模板設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了長(zhǎng)度約為1100 bp的條帶，測(cè)序結(jié)果表明其為1149 bp（圖1-A）。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST對(duì)比分析，結(jié)果顯示該序列與黃花蒿L(fēng).和紫花風(fēng)鈴木L.含HAD-like結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸序列一致性性分別為80.3%和74.9%。下載一致性較高的氨基酸序列利用DNA MAN進(jìn)行同源對(duì)比分析（圖1-C），結(jié)果顯示它們均含有1個(gè)HAD-like結(jié)構(gòu)域，故將其命名為

預(yù)測(cè)編碼1個(gè)包含382 aa的蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為43 000，理論等電點(diǎn)（pI）為8.15，不穩(wěn)定指數(shù)為46.09。編碼的氨基酸序列中具有多個(gè)明顯的親水區(qū)域，大部分氨基酸屬于親水氨基酸，其合成的蛋白屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白（圖1-B）。PcHAD蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)由4種形式組成，其中無(wú)規(guī)則卷曲（random coil）所占比例最高，為43.19%，α-螺旋（alpha helix）和延伸鏈（exstened strand）分別為39.53%、12.04%，β-轉(zhuǎn)角占5.24%（圖1-D）。以c3iruA為模體對(duì)PcHAD蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)模型構(gòu)建（圖1-E），模型覆蓋范圍為132～336 aa，相似性為21%。

A-PcHAD的PCR擴(kuò)增結(jié)果 B-PcHAD的親疏水性預(yù)測(cè) C-PcHAD與其他植物HAD-like蛋白的多序列比對(duì)分析 D-PcHAD的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) E- PcHAD的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

3.2 廣藿香PcHAD的亞細(xì)胞定位分析

將空載pAN580和構(gòu)建好的PcHAD-EGFP融合表達(dá)載體通過(guò)PEG介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化到擬南芥原生質(zhì)體中，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察到陽(yáng)性對(duì)照（EGFP）在整個(gè)細(xì)胞中表達(dá)，而PcHAD-EGFP在葉綠體中呈現(xiàn)綠色熒光。以上結(jié)果表明PcHAD蛋白定位在葉綠體中（圖2）。

EGFP-pAN580空載 GFP-綠色熒光蛋白 Chlorophyll-葉綠體自發(fā)熒光 Bright field-明場(chǎng) Merge-葉綠體自發(fā)熒光、綠色熒光蛋白和明場(chǎng)疊加

3.3 PcHAD基因表達(dá)模式分析

利用qRT-PCR技術(shù)分析基因在廣藿香葉、莖、根不同組織的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，以根為對(duì)照，在葉、莖和根中都有表達(dá)，在葉片中的表達(dá)量最高，且顯著高于莖和根，表明該基因具有組織表達(dá)差異性（圖3）。

*表示差異在P＜0.05水平上顯著

3.4 PcHAD與PcPTS的互作分析

將捕獲質(zhì)粒與BD-PTS共轉(zhuǎn)至Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行酵母雙雜點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證。經(jīng)檢測(cè)BD-PTS無(wú)自激活活性（圖4-C）。陽(yáng)性對(duì)照、pGBKT7-PTS和pGADT7-HAD能在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/AbA篩選平板上生長(zhǎng)且變藍(lán)色，而陰性對(duì)照（BD-PTS+ pGADT7）不能正常生長(zhǎng)且變藍(lán)色，表明PcHAD完整蛋白能與PcPTS完整蛋白結(jié)合（圖4-D）。

通過(guò)Pfam網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)PcHAD的HAD2_like結(jié)構(gòu)域分布在134～314個(gè)氨基酸，PcPTS的Terpene_synth結(jié)構(gòu)域?yàn)?5～197個(gè)氨基酸，Terpene_synth_C為229～495個(gè)氨基酸。為進(jìn)一步分析PcHAD與PcPTS的互作域，將PcHAD和PcPTS根據(jù)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行截短（圖4-D），PcHAD截短為PcHADN（1～133 aa）和PcHADC（134～382 aa，該段被預(yù)測(cè)包含HAD2-like結(jié)構(gòu)域）。PcPTS截短為PcPTSN（25～225 aa）和PcPTSC（226～550 aa）2個(gè)片段，然后將PcHAD的截短蛋白分別和pGADT7連接PcPTS的截短蛋白分別和pGBKT7連接，利用酵母雙雜點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證PcHAD截短蛋白和PcPTS截短蛋白的互作。結(jié)果表明，PcHADN與PcPTSN互作，而PcHADC與PcPTSN不互作（圖4-D）

M-Marker A: 1-AD-HAD 2-AD-HADN 3-AD-HADC的菌落PCR電泳檢測(cè) B: 1-BK-PTSN 2-BK-PTS的菌落PCR C-誘餌載體的自激活檢測(cè) D-酵母雙雜交結(jié)果

3.5 PcHAD瞬時(shí)過(guò)表達(dá)后對(duì)廣藿香醇的合成及MVA途徑相關(guān)基因表達(dá)影響分析

提取瞬時(shí)侵染后的廣藿香葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用qRT-PCR分析基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，瞬時(shí)過(guò)表達(dá)的葉片，與CK組相比，的表達(dá)量增加約2倍，說(shuō)明成功獲得了瞬時(shí)過(guò)表達(dá)的廣藿香株系（圖5-C）。GC-MS結(jié)果顯示廣藿香醇的對(duì)照品保留時(shí)間為17.25 min，廣藿香醇含量統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)廣藿香葉片的廣藿香醇含量為1.580 mg/g，顯著高于對(duì)照（1.212 mg/g），提高了30.3 %（圖5-A、B）。

為了進(jìn)一步揭示基因的功能，本研究選取了廣藿香醇主要的生物合成途徑即MVA途徑中的9個(gè)基因，對(duì)其在瞬時(shí)過(guò)表達(dá)基因的廣藿香葉片的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果如圖5-C所示，發(fā)現(xiàn)及MVA途徑的2個(gè)關(guān)鍵基因表達(dá)量均顯著上調(diào)。

通過(guò)截短蛋白的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)明確了其互作域，PcHADN與PcPTSN互作，因此，PcHAD與PcPTS蛋白的相互作用應(yīng)該是由PcHAD的N端截短蛋白或是PcPTS的N端截短蛋白決定的。但PcHADN無(wú)相關(guān)結(jié)構(gòu)域，推測(cè)Terpene_synth這個(gè)元件可能在PcHAD與PcPTS的結(jié)合中發(fā)揮重要作用，但是具體的作用機(jī)制還不清楚，需要進(jìn)一步研究。

為了明確HAD蛋白調(diào)控廣藿香醇合成的功能，構(gòu)建了pJL-HAD的過(guò)表達(dá)載體進(jìn)行瞬時(shí)過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)后廣藿香醇的含量顯著上升。另外，RT-qPCR結(jié)果表明在瞬時(shí)過(guò)表達(dá)葉片中廣藿香醇合酶基因及MVA途徑的和基因的表達(dá)均顯著上調(diào)。據(jù)報(bào)道，類異戊二烯核心通路中的基因一旦過(guò)表達(dá)或受到抑制，將改變代謝通量，促進(jìn)通路中的反饋或前饋信號(hào)，從而調(diào)節(jié)基因的上、下游表達(dá)[26]。課題組前期過(guò)表達(dá)MYB_related轉(zhuǎn)錄因子，該基因通過(guò)上調(diào)MVA通路中的基因表達(dá)，促進(jìn)了廣藿香醇的生物合成和積累[12]。因此，基因可能通過(guò)上調(diào)及MVA途徑的和基因的表達(dá)促進(jìn)廣藿香醇的合成和積累。本研究成功克隆了，進(jìn)一步驗(yàn)證了其編碼蛋白與PcPTS蛋白的互作關(guān)系，并對(duì)其功能進(jìn)行了初步分析，探究了過(guò)表達(dá)后對(duì)廣藿香醇合成途徑基因和廣藿香醇含量的影響，為進(jìn)一步揭示PcPTS及其互作蛋白在廣藿香萜類生物合成調(diào)控中的作用奠定基礎(chǔ)。后續(xù)將通過(guò)轉(zhuǎn)基因等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示PcHAD的功能，深入了解其調(diào)節(jié)廣藿香醇生物合成的分子機(jī)制。

A-GC-MS色譜圖 B-廣藿香醇含量分析柱狀圖 C-及廣藿香醇合成途徑相關(guān)基因表達(dá)情況 CK-空載對(duì)照以18 S為內(nèi)參，以空載樣品為對(duì)照，采用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量計(jì)算。每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，Student’s t-test，與CK組比較：*＜0.05、**＜0.01

A-GC-MS chromatogram B-content of patchouli alcohol in leaf of transient overexpression plant C-expression levels ofand genes involved in cytosolic mevalonate (MVA) pathway in leaves of transient overexpression plant CK-control check. The relative expression level was calculated according to the expression of PcHAD at CK sample. 2-△△Ctmethod was used for relative quantitative calculation. Data are means ± SD of three independent biological replicates.Student’s-test:*< 0.05,**< 0.01 va CK group

圖5瞬時(shí)轉(zhuǎn)化廣藿香葉片廣藿香醇含量檢測(cè)及RT-qPCR鑒定廣藿香醇合成途徑相關(guān)基因表達(dá)情況

Fig. 5 Detection of patchouli alcohol content and expression profiles ofand genes involved in cytosolic mevalonate (MVA) pathway in leaves of transient overpression plant

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Cloning ofgene fromand functional analysis of its involvement in biosynthesis of patchouli alcohol

WU Dai-di1, 2, HUANG Hui-ling1, 2, SHAN Yao-kai1, 2, ZOU Xuan1, 2, GONG Li-zhen1, 2, ZHAN Ruo-ting1, 2, 3, CHEN Li-kai1, 2, 3

1. School of Chinese Materia Medica, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China 2. Key Laboratory of Chinese Medicinal Resource from Lingnan, Ministry of Education, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China 3. Maoming Branch, Guangdong Laboratory for Lingnan Modern Agricultural Science and Technology, Maoming 525000, China

gene of HAD (haloacid dehalogenase) superfamily protease was cloned from Guanghuoxiang (), and its coding protein interaction with patchoulol synthase (PTS) protein was verified to explore its role in regulating the biosynthesis of patchouli alcohol.In this study, agene sequence () with complete coding region and HAD-like domain was screened fromtranscriptome data for cloning and bioinformatics analysis. The tissue expression pattern ofwas analyzed by RT-qPCR. The yeast two-hybrid experiment was used to verify the interaction between PcHAD and PcPTS protein. Transient overexpression ofwas used to analyze the effect ofon the expression of genes related to the MVA pathway and the content of patchouli alcohol.The HAD-like genewas cloned from. Its open reading frame was 1149 bp, encoding 382 amino acids, and the molecular weight of the protein was 43 000. It was an unstable hydrophilic protein and subcellularly localized in the chloroplast. In the yeast two-hybrid assay, the PcHAD protein can not only interact with the PcPTS protein, but also with PcPTSN. After transient overexpression of, the content of patchouli alcohol was increased by 30% compared with the control group, and the expression of genes on the MVA pathway including,andwere significantly up-regulated.In this study,gene that interacts with patchoulol synthase PcPTS was cloned from. Transient overexpression ofcan increased the content of patchouli alcohol and the expression levels ofand genes involved in the MVA pathway, suggesting that this gene may play a positive role in the biosynthesis of patchouli alcohol. These results provided scientific basis for further research on the function of HAD-PTS complex in

(Blanco) Benth.; patchouli alcohol; HAD; protein-protein interactions; synthesis regulation; function analysis

R286.12

A

0253 - 2670(2022)13 - 4100 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.13.023

2021-11-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81803657）；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2019A1515011542）；廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃（2020B020221001)

吳帶娣（1995—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幱弥参镙祁惢钚猿煞诌z傳調(diào)控。E-mail: 1753931835@qq.com

陳立凱（1986—），男，博士，副研究員，博導(dǎo)，主要從事中藥資源利用與藥效成分的遺傳調(diào)控。E-mail: chenlk@gzucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]