吳 題，魏曉玲，馮常青，黃云俠，徐時(shí)長(zhǎng)，邱福祥，鄭英潔，李文卿，何華勤

（1福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2福建省煙草專賣局煙草科學(xué)研究所，福州 350003）

0 引言

鎂作為僅次于氮、磷、鉀的植物第四大營(yíng)養(yǎng)元素，在提高植物抗逆性方面有重要作用。長(zhǎng)期以來(lái)，南方紅壤地區(qū)由于高溫、多雨等原因，含鎂礦物受到風(fēng)化、淋洗等作用，造成土壤中的有效性鎂含量降低[1-2]。鎂缺乏已成為限制國(guó)內(nèi)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中作物產(chǎn)量的重要因子，合理施用鎂能有效提高作物產(chǎn)量、改善品質(zhì)、提升抗逆境脅迫能力[3-4]。鎂的運(yùn)輸與分配離不開(kāi)鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，前人發(fā)現(xiàn)細(xì)菌中有3種不同類型的鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，即鈷抗性A基因(CorA)、鎂轉(zhuǎn)運(yùn)基因(MGT)A/B和MGTE[5-7]。植物中MGT是CorA亞家族中的一類。研究人員已從水稻、甘蔗、玉米、甘藍(lán)型油菜、巴西橡膠樹(shù)等植物中鑒定出鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族[8-12]。在擬南芥中，鑒定出的鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族有10個(gè)成員和1個(gè)假基因(AtMRS2-9)，并被命名為AtMGT基因或AtMRS2[13]。對(duì)AtMGT基因家族研究較為深入的是AtMGT1基因，該基因蛋白定位于質(zhì)膜并參與根中鎂離子的吸收，且對(duì)鎂離子具有高親和性和專一性，能轉(zhuǎn)運(yùn)土壤中符合生理濃度范圍的鎂離子，也能轉(zhuǎn)運(yùn)其他的二價(jià)陽(yáng)離子，但對(duì)其他二價(jià)陽(yáng)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)要求其濃度高出土壤生理濃度[14]。AtMGT6是一種質(zhì)膜局部轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以介導(dǎo)局部鎂離子吸收和低鎂耐受性，主要與環(huán)狀核苷酸門控通道(CNGC)家族蛋白AtCNGC10協(xié)同吸收并轉(zhuǎn)運(yùn)擬南芥根中的鎂。在水稻中，研究人員已鑒定出9個(gè)鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族成員。OsMGT1是首個(gè)被克隆的水稻MRS2/MGT類基因，其位于質(zhì)膜中，參與Mg2+的吸收且介導(dǎo)根部的鎂運(yùn)輸[9,15-16]。目前，對(duì)植物中MGT家族基因的研究?jī)H有少數(shù)報(bào)道，而對(duì)煙草中MGT家族成員的鑒定與功能研究尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者從煙草基因組中鑒定出鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因MGT，分析不同鎂濃度與光強(qiáng)處理下煙株不同組織部位鎂含量與鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)量的關(guān)系，以期探究MGT對(duì)煙株鎂離子運(yùn)輸?shù)臋C(jī)制，為提高煙草的鎂營(yíng)養(yǎng)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)處理

實(shí)驗(yàn)于2020—2021年在福建省煙草專賣局煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所進(jìn)行。選用煙草‘翠碧一號(hào)’為實(shí)驗(yàn)材料。煙草植株培養(yǎng)至七葉一心后移栽至1000 mL的水培罐(12 cm×8 cm×11 cm)中，加不同鎂濃度的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。營(yíng)養(yǎng)液中的鎂(Mg2+)濃度梯度設(shè)置為0、12.0、48.0、120.0 mg/L。為模擬福建煙區(qū)2—6月的氣溫跳躍式上升的情況，結(jié)合往年福建煙區(qū)的氣象資料，在煙苗移栽前期和團(tuán)棵期（移栽后38天）分別設(shè)置了18、33℃（高溫）2個(gè)階段的溫度。煙苗移栽前期人工氣候室的溫度設(shè)定為18℃，濕度為80%，光照強(qiáng)度為160 μmol/(m2·s)(8:00—24:00)和0 μmol/(m2·s)(0:00—8:00)。待煙苗生長(zhǎng)至團(tuán)棵期時(shí)，將溫度設(shè)定為33℃，濕度保持不變，設(shè)置2種光照處理，一種是高溫正常光照，即光照強(qiáng)度為600μmol/(m2·s)24 h，另一種是高溫強(qiáng)光，即光照強(qiáng)度為1200μmol/(m2·s)24 h。利用照度計(jì)（美國(guó)Kestrel公司，DRM-FQ）測(cè)定到達(dá)葉片表面的光照強(qiáng)度，以保證到達(dá)煙草葉片的有效光照強(qiáng)度。

經(jīng)過(guò)不同鎂濃度與光強(qiáng)處理6天后，煙株間出現(xiàn)明顯差異，各處理下分別取3株長(zhǎng)勢(shì)相同的煙株，并將它們的第2、3葉位的葉片剔除主脈后剪碎混合均勻，同時(shí)把相同處理下的3株長(zhǎng)勢(shì)相同的煙株的根系剪下混勻，分別打包速凍后于-80℃冰箱中冷凍保存，用于MGT基因表達(dá)量分析。

1.2 煙株不同部位鎂含量的測(cè)定

鎂的測(cè)定采用ICP-AES法。ICP儀的高頻功率為1150 W、等離子氣流量10 L/min、輔助氣流量0.5 L/min、載氣流量0.5 L/min、泵轉(zhuǎn)速45 r/min，工作氣體為純度大于99.99%的氬氣，觀測(cè)方式為垂直觀測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液均為100μg/mL。分析波長(zhǎng)為280.270 nm。

1.3 煙株基因組中鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因篩選

從NCBI網(wǎng)站上下載擬南芥和水稻的MRS2/MGT基因家族成員蛋白序列作為query序列，以白肋煙‘TN90’的Ntab-TN90參考注釋版本(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?)與 Sol Genomics Network網(wǎng)站的烤煙‘K326’數(shù)據(jù)庫(kù)(https://solgenomics.net/tools/blast/?db_id=236)為目標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST，整合2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)結(jié)果。使用DNAMAN[17]軟件進(jìn)行氨基酸序列分析，利用ORF Finder軟件(http://www.ncbi.nlh.nih.gov/gorf/gorf.html)對(duì)開(kāi)放閱讀框進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用MEME(https://meme-suite.org/meme/)對(duì)得到的序列進(jìn)行Motif基序預(yù)測(cè)，用在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對(duì)序列存在的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，利用TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)進(jìn)行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)的預(yù)測(cè)。MGT蛋白的氨基酸數(shù)目、分子量等理化性質(zhì)的分析利用在線預(yù)測(cè)軟件(https://web.expasy.org/protparam/)。利用亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)在線網(wǎng)址(https://www.genscript.com/wolf-psort.html)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。用MEGA 7.0[18]根據(jù)Neighbor-joining法，重復(fù)1000次構(gòu)建煙草、擬南芥和水稻MRS2/MGT基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.4 煙株MRS2/MGT基因家族的表達(dá)量分析

使用Takara公司的RNA提取試劑盒對(duì)經(jīng)過(guò)不同鎂濃度與光強(qiáng)處理的煙株葉片與根部樣品進(jìn)行RNA的提取，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并保存于-20℃冰箱中，用于MRS2/MGT基因家族的表達(dá)量分析。引物的設(shè)計(jì)利用Primer 5軟件[19]進(jìn)行，以β-actin為內(nèi)參基因，引物序列信息如表1所示，而后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QPCR)分析。

表1 NtMRS2/MGT基因QPCR驗(yàn)證所用的引物

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草MRS2/MGT基因家族的鑒定及其進(jìn)化分析

由于煙草基因組數(shù)據(jù)尚不完整，因此利用Sol Genomics Network網(wǎng)站的烤煙‘K326’數(shù)據(jù)庫(kù)與NCBI網(wǎng)站的白肋煙‘TN90’的數(shù)據(jù)庫(kù)同時(shí)進(jìn)行比較分析。以擬南芥與水稻的MRS2/MGT基因家族成員的蛋白序列作為參考序列，在以上2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中分別進(jìn)行搜索比對(duì)，將在2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中得到的序列進(jìn)行整合，并進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域、MRS2結(jié)構(gòu)域與基序(Motif)的預(yù)測(cè)，同時(shí)含有MRS2結(jié)構(gòu)域、2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)，并且在靠近C端的第一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的末端附近共享一個(gè)保守的Gly-Met-Asn(GMN)三肽基序，被認(rèn)為是MRS2/MGT基因家族的成員，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示同時(shí)滿足以上3個(gè)條件的序列有7個(gè)，分別命名為NtMGT1～NtMGT7（表2）。其中NtMGT5基因有2種可變剪接形式的蛋白質(zhì)，本研究?jī)H對(duì)第一種形式的蛋白質(zhì)序列加以分析。

表2 NtMRS2/MGT基因信息表

對(duì)上述鑒定獲得的煙草MGT蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如表3所示。煙草MRS2/MGT基因家族成員編碼的蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)目為372～499，相對(duì)分子質(zhì)量為41.71～54.95 kDa，理論等電點(diǎn)值處于4.83～6.09之間。對(duì)煙草MGT蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)4個(gè)MGT成員定位于質(zhì)膜，3個(gè)MGT成員定位于葉綠體。說(shuō)明煙草MGT蛋白的功能主要是維持質(zhì)膜與葉綠體中鎂離子的平衡。相似性結(jié)果分析表明，NtMRS2/MGT蛋白家族的序列相似性處于15.23%～88.60%，其中NtMGT2與NtMGT3相似度最高（表4）。

表3 NtMRS2/MGT蛋白特征

表4 NtMRS2/MGT各成員之間相似度 %

將煙草7個(gè)MRS2/MGT基因的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，并分析其氨基酸保守位點(diǎn)，結(jié)果如圖1所示。7個(gè)煙草MGT蛋白都含有鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白保守的Gly-Met-Asn(GMN)三肽基序（圖1中用紅框標(biāo)記），這與其他植物中MRS2/MGT基因的序列特征相符。利用TMpred的跨膜域分析結(jié)果，表明NtMGT1、NtMGT2、NtMGT3、NtMGT6與NtMGT7有2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，NtMGT4與NtMGT5有3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，所有NtMRS2/MGT近C端都有2個(gè)疏水跨膜域（圖2）。

圖1 NtMRS2/MGT蛋白序列比對(duì)

圖2 NtMGTs的跨膜結(jié)構(gòu)域

水稻、擬南芥和煙草MRS2/MGT的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果見(jiàn)圖3。MRS2/MGT基因家族可分為5個(gè)亞族，除在D亞族中無(wú)煙草MRS2/MGT基因外，在其他亞族內(nèi)均有煙草MRS2/MGT家族成員。在A和C亞族中各有2個(gè)煙草MRS2/MGT旁系同源基因，在擬南芥、煙草與水稻分離之后，在煙草內(nèi)發(fā)生了重復(fù)事件。B和E亞族中各有1個(gè)煙草直系同源基因。

圖3 煙草、擬南芥與水稻基因組中MGTs蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.2 不同處理下煙株不同部位鎂含量分析

鎂是多種酶的活化劑，其含量變化會(huì)影響煙草產(chǎn)量和品質(zhì)。在本研究中，煙株鎂含量的變化趨勢(shì)如表5所示。無(wú)論是高溫強(qiáng)光還是高溫正常光處理，隨著鎂離子供應(yīng)濃度的增加，煙株地上部和地下部的鎂含量均顯著提高。在相同鎂離子濃度供應(yīng)下，強(qiáng)光處理煙株地上部的鎂含量顯著低于正常光處理，其中L1200Mg0比L600Mg0處理的降低了58.74%，L1200Mg12比L600Mg12處理的降低了37.84%，L1200Mg48比L600Mg48處理的降低了23.18%，L1200Mg120比L600Mg120的處理降低了31.29%。在Mg2+48.0 mg/L時(shí)，高溫強(qiáng)光與高溫正常光處理下煙株地上部鎂含量的差異減小。另一方面，鎂供應(yīng)濃度的增加使得高溫強(qiáng)光或高溫正常光處理下煙株地下部鎂含量顯著增加。在相同鎂離子濃度下，光照對(duì)處理下煙株地下部鎂含量的影響基本與地上部相似，除了在Mg2+48.0 mg/L時(shí)強(qiáng)光處理煙株地下部鎂含量顯著高于正常光處理的。以上結(jié)果表明，提高鎂離子供應(yīng)能增大煙株地上部和地下部鎂含量。而強(qiáng)光會(huì)抑制煙株對(duì)鎂的吸收，但適宜的鎂離子供應(yīng)能促進(jìn)強(qiáng)光下煙株對(duì)鎂的吸收。

煙株鎂含量與鎂濃度、光強(qiáng)以及鎂濃度和光強(qiáng)交互作用的方差分析如表5。鎂離子供應(yīng)濃度、光強(qiáng)及鎂供應(yīng)和光強(qiáng)交互對(duì)煙株地上部鎂含量的影響均達(dá)顯著性水平；不同鎂離子供應(yīng)濃度對(duì)煙株地下部鎂含量影響不顯著，但光強(qiáng)及光強(qiáng)與鎂供應(yīng)濃度的交互對(duì)煙株地下部鎂含量的影響均達(dá)到顯著性水平。說(shuō)明改變鎂離子供應(yīng)濃度、光強(qiáng)均能影響煙株地上部和地下部的鎂含量，兩者的互作也顯著影響鎂含量。

表5 不同鎂濃度與光強(qiáng)處理下煙株的地上部和地下部鎂含量 g/kg

2.3 煙草不同部位MRS2/MGT基因的表達(dá)量分析

應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)分析不同處理下煙株地上部和地下部MRS2/MGT基因的表達(dá)情況，結(jié)果如圖4所示。隨著鎂供應(yīng)濃度的升高，正常光處理下煙株根中NtMGT1的表達(dá)量表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢(shì)，而強(qiáng)光處理下卻呈緩慢上升趨勢(shì)；當(dāng)鎂(Mg2+)供應(yīng)濃度為48.0 mg/L時(shí)，強(qiáng)光處理下煙株NtMGT1基因的表達(dá)量顯著高于正常光處理；而且不同處理下煙株根中NtMGT1的表達(dá)量與其地下部鎂含量的變化趨勢(shì)基本一致（圖4A）。由圖4B～D可見(jiàn)，煙株葉片中NtMGT2、NtMGT4與NtMGT5的表達(dá)量隨著鎂供應(yīng)濃度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在鎂(Mg2+)供應(yīng)濃度為48.0 mg/L時(shí)達(dá)到最大值。同時(shí)，強(qiáng)光處理下這3個(gè)基因的表達(dá)量高于正常光處理。

圖4 不同鎂供應(yīng)濃度與光強(qiáng)處理下煙株根和葉中NtMGT基因的表達(dá)量

3 結(jié)論與討論

植物鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、維持鎂離子穩(wěn)態(tài)等的作用，因此對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育有重要的影響[20]。筆者首先應(yīng)用同源序列比對(duì)策略，從煙草基因組中鑒定出7個(gè)NtMGTs家族成員，且各成員在近C末端均有典型的GMN基序。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示該基因家族與擬南芥、水稻的分離后，在煙草基因組內(nèi)可能發(fā)生了重復(fù)事件[21-22]。

本研究發(fā)現(xiàn)煙株MRS2/MGT基因的表達(dá)具有組織特異性。在不同鎂供應(yīng)濃度與光強(qiáng)處理下，煙株葉片中NtMGT2、NtMGT4與NtMGT5基因，根中NtMGT1基因的表達(dá)均出現(xiàn)顯著性差異。前人研究也獲得相同結(jié)論。AtMGT10主要在成熟的擬南芥維管組織或者幼嫩的葉片中表達(dá)，介導(dǎo)葉綠體中鎂的轉(zhuǎn)運(yùn)以提高葉綠體中的鎂含量[23]。研究人員在擬南芥角果中發(fā)現(xiàn)AtMGT2、AtMGT4、AtMGT6、AtMGT9的表達(dá)，而在種子中僅發(fā)現(xiàn)AtMGT2有表達(dá)。水稻MGTs基因的表達(dá)主要在芽和愈傷組織中[24]。本研究還發(fā)現(xiàn)，在強(qiáng)光處理下，NtMGT1基因在根中的表達(dá)量逐漸上升，且與在根系中鎂含量的變化趨勢(shì)一致，說(shuō)明強(qiáng)光處理下煙株可能通過(guò)提高NtMGT1基因的表達(dá)量來(lái)提高煙株根系對(duì)鎂離子的吸收能力，以增加根系中的鎂含量。前人也發(fā)現(xiàn)擬南芥根對(duì)鎂的吸收主要由AtMGT1等介導(dǎo)完成[25]。以上結(jié)果表明，煙株NtMGT1基因主要在根系表達(dá)，且強(qiáng)光下其表達(dá)量上調(diào)，促進(jìn)煙株吸收更多的鎂離子。隨著鎂供應(yīng)濃度的升高，煙株葉片中NtMGT2、NtMGT4與NtMGT5基因的表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，可能是因?yàn)檫@3個(gè)基因?qū)儆跓煵莸母哂H和鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，在外界鎂濃度較低時(shí)，基因表達(dá)量提高，對(duì)鎂離子的轉(zhuǎn)運(yùn)能力加強(qiáng)，而在鎂離子濃度較高時(shí)(Mg2+120.0 mg/L)，表達(dá)量降低，可能在此時(shí)主要由低親和鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)起作用。在強(qiáng)光下，當(dāng)鎂離子濃度等于或者高于48.0 mg/L時(shí)，NtMGT2、NtMGT4與NtMGT5基因的表達(dá)量顯著高于正常光處理，說(shuō)明煙草鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)受光誘導(dǎo)。前人在對(duì)橡膠樹(shù)與擬南芥的MGTs基因的研究發(fā)現(xiàn)，在成熟橡膠樹(shù)葉片中，中午光照最強(qiáng)時(shí)，HbMGT10的表達(dá)量是夜晚的3倍，在擬南芥中AtMGT10受到光誘導(dǎo)后表達(dá)量也提高2倍[26]。強(qiáng)光誘導(dǎo)NtMGT2、NtMGT4與NtMGT5基因表達(dá)量增加，使得對(duì)Mg2+的轉(zhuǎn)運(yùn)能力增強(qiáng)。而且NtMGT2的亞細(xì)胞定位分析顯示其定位于葉綠體，暗示NtMGT2可能在強(qiáng)光下介導(dǎo)葉綠體鎂離子的轉(zhuǎn)運(yùn)。

總之，本研究鑒定到煙草基因組中7個(gè)MRS2/MGT家族成員，其中NtMGT1在煙株根系中特異性表達(dá)，而NtMGT2、NtMGT4、NtMGT5在葉片中特異表達(dá)，而且其表達(dá)受到光誘導(dǎo)。研究結(jié)果可為在煙株高溫強(qiáng)光時(shí)期合理施用鎂肥的生產(chǎn)實(shí)踐提供理論指導(dǎo)。但目前對(duì)于煙草MGT基因家族的研究?jī)H僅是管中窺豹，關(guān)于煙草鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的特性、表達(dá)規(guī)律等都尚待探究，而在高溫強(qiáng)光下鎂離子是如何被烤煙根部吸收，通過(guò)何種途徑在木質(zhì)部運(yùn)輸以及如何在烤煙內(nèi)部進(jìn)行分配等分子機(jī)制都不得而知。因此，對(duì)NtMGT基因家族的研究還需要大量細(xì)致的工作，以解釋在高溫強(qiáng)光下烤煙內(nèi)部的鎂離子是如何被吸收轉(zhuǎn)運(yùn)以及分配的，為在生產(chǎn)上如何合理施用鎂肥以緩解高溫強(qiáng)光對(duì)烤煙的傷害，提高煙草的產(chǎn)量與品質(zhì)提供理論指導(dǎo)。