白艷榮，蔣亞蓮，王進英

（1昆明學院，昆明 650213；2云南省農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所，昆明 650214）

0 引言

臘花(Chamelaucium uncinatum)為桃金娘科(Mycinatum)植物，即淘金彩梅，又名杰拉爾頓臘花或風臘花。臘花可作高檔鮮切花、綠化景觀樹、盆景、香精萃取等，具有較高的觀花、觀葉及經(jīng)濟價值。由于蠟花雄蕊較長伸出花外、雌蕊隱蔽于花心之內(nèi)導致不結(jié)實。目前，主要繁殖方式為扦插繁殖。扦插繁殖慢且生根率低，難以滿足生產(chǎn)需求。有關風臘花組培的研究，錢仲秀等[4]以3年生當年長出的半木質(zhì)化嫩枝作為外植體，初代培養(yǎng)并獲得了成功；婁麗華等[5]采用半木質(zhì)化嫩莖頂芽作為外植體，成功建立了無菌體系；湯桂軍等[6]以春季抽伸的半木質(zhì)化嫩莖莖段作為外植體，生根率可達80%；但尚未解決生根率低的問題，不能滿足生產(chǎn)上的需要。筆者以臘花的嫩芽嫩莖為繁殖材料，研究和完善臘花的組培快繁技術體系，旨在為臘花種苗工廠化生產(chǎn)提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取臘花半木質(zhì)化嫩枝頂芽做外植體。

1.2 主要試劑

試劑包括蔗糖、瓊脂、HCl、NaOH、75%酒精、2%次氯酸，激素KT、6-BA、IBA、NAA，MS、1/2MS培養(yǎng)基母液。

1.3 實驗設計

1.3.1 初代培養(yǎng) 以MS為基本培養(yǎng)基，添加3%的蔗糖和0.62%的瓊脂，培養(yǎng)基pH 5.8～6.0。設置KT(0、2、3、4 mg/L)、NAA(0、0.1、0.2、0.3 mg/L)濃度梯度組合的誘導培養(yǎng)基。選取臘花半木質(zhì)化嫩枝頂芽做好消毒處理后接種到誘導培養(yǎng)基上，設置9個處理、1個對照，每個處理接種3瓶，3次重復，每瓶接種2個外植體，每個處理接種18個芽（＞0.5 cm的芽），30天后分別統(tǒng)計不同激素濃度組合對臘花誘導培養(yǎng)的影響，進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，篩選最佳激素濃度配比的培養(yǎng)基。

1.3.2 增殖培養(yǎng) 以MS為基礎培養(yǎng)基，添加3%的蔗糖和0.62%的瓊脂，培養(yǎng)基pH 5.8～6.0。設置6-BA(0、0.5、1.0、1.5 mg/L)、NAA(0、0.1、0.2、0.3 mg/L)濃度梯度組合的增殖培養(yǎng)基。選取生長健壯的、長勢一致的臘花無菌苗接種到增殖培養(yǎng)基上，設置9個處理、1個對照，每個處理接種3瓶，重復3次，每瓶處理接種3株，每個處理接種27個芽，培養(yǎng)45天后，分別統(tǒng)計組培苗的增殖情況，研究不同濃度激素梯度組合對試管苗增殖的影響，篩選最佳的增殖培養(yǎng)基。

1.3.3 生根培養(yǎng) 以1/2MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，將無菌芽接種到不同濃度IBA(0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L)的生根培養(yǎng)基上，添加3%的蔗糖、0.62%的瓊脂和0.1%的活性炭，pH 5.8～6.0，設置6個處理、1個對照，每個處理轉(zhuǎn)接3瓶，每瓶接種3株，重復3次，每個處理接種27株無菌苗，培養(yǎng)60天后進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，研究不同濃度的IBA對組培苗生根的影響，篩選最佳的培養(yǎng)基配方。

隨機每個處理取10株長勢一致的臘花組培苗，將組培苗取出，用清水對根系進行清洗，測量每株的根長，平均值即為根長。以組培苗根基0.5 cm處的直徑作為根粗。

1.4 實驗方法

1.4.1 培養(yǎng)基的配制 每個處理配制500 mL的培養(yǎng)基，裝9瓶，按上述實驗設計量取母液。在制備MS培養(yǎng)基時，母液量取應是大量元素和微量元素各5 mL/L；在制備1/2MS培養(yǎng)基時，母液量取應是按大量元素2.5 mL/L、微量元素5 mL/L和植物生長調(diào)節(jié)劑加入燒杯中，加入15 g蔗糖，再加入瓊脂攪拌均勻后定容，用HCl或NaOH調(diào)節(jié)至pH 5.8～6.0，之后分裝到培養(yǎng)瓶中，每瓶裝55～60 mL的培養(yǎng)基，蓋上蓋子密封，添加到培養(yǎng)基中的激素或營養(yǎng)物質(zhì)都需提前滅菌，置于滅菌架上放到高壓蒸汽滅菌鍋中，在溫度為121℃下滅菌2 min，等溫度和壓力下降后取出培養(yǎng)基備用。

1.4.2 滅菌與接種 剪去相對幼嫩的半木質(zhì)化枝條頂芽作為外植體，長度為1～2 cm，剪好后的材料用洗潔精浸泡2 min，用自來水清洗干凈后用自來水流動沖洗2 h，之后到接種室用75%酒精清洗30 s后用無菌水清洗3次，每次清洗時間為25～30 s。用4%氯酸鈉溶液浸泡15 min后，用無菌水清洗5遍，每次30 s，清洗好的外植體放到無菌接種盤用無菌紙把水分吸干，把無菌外植體接種到臘花誘導培養(yǎng)基中。

將接種后的臘花外植體在培養(yǎng)架中進行培養(yǎng)，其培養(yǎng)的溫度為(23±2)℃，光強為1500～2000 lx，光照時間為12～14 h/d。在培養(yǎng)的過程中每隔7天觀察一次培養(yǎng)瓶中苗的生長狀況，誘導培養(yǎng)30天后對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，增殖培養(yǎng)45天后對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，生根培養(yǎng)60天后對實驗數(shù)據(jù)作統(tǒng)計分析，篩選出最適宜臘花生長的誘導、增殖和生根培養(yǎng)基。

1.5 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果采用單因素方差分析和Duncan’s多重比較分析不同處理之間的差異，差異顯著性水平為P=0.05。所有的統(tǒng)計分析均在SPSS 24中完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素(KT、NAA)濃度組合對臘花誘導培養(yǎng)的影響

由表1可見，不同濃度的激素(KT、NAA)濃度組合對誘導培養(yǎng)的影響有差異。當KT 3 mg/L、NAA 0.2 mg/L（A5處理）時，在此濃度組合下誘導效果是最理想的，發(fā)生個數(shù)達到16個，發(fā)生率達到88.83%，植株生長健壯，葉色為深綠色；A5與A1、A4、A6對比，雖然A1、A4、A6植株生長健壯，但是發(fā)生數(shù)和發(fā)生率不理想；A2、A3植株生長較為緩慢，但是苗生長健壯，有一定的利用價值；A7、A8雖然發(fā)生率不低，但是苗生長緩慢，且植株矮小細弱；A9、A10、A11苗生長緩慢且矮小細弱，出現(xiàn)玻璃化苗的情況，3個處理誘導出的苗基本無利用價值。

表1 風蠟花誘導培養(yǎng)基（KT和NAA濃度配比）研究結(jié)果

激素KT、NAA在中等水平對臘花誘導培養(yǎng)效果最有利。處理A1～A3 KT濃度不斷上升，但是NAA濃度較低，臘花誘導效果都不理想；A4、A6、A7濃度梯度比較接近中等水平，誘導率處于中等水平；A8、A9處理，隨著激素濃度梯度不斷增大，發(fā)生率下降；A10、A11培養(yǎng)基中不添加KT、NAA，誘導率最低。激素濃度過高或過低都不利于臘花的誘導培養(yǎng)，在激素KT濃度 2、3、4 mg/L，NAA 濃度 0.1、0.2、0.3 mg/L，KT:NAA為3:1時，臘花誘導培養(yǎng)效果最好。

2.2 不同激素(6-BA、NAA)濃度組合對臘花增殖培養(yǎng)效果的影響

由表2可得，不同激素(6-BA、NAA)濃度組合對臘花增殖效果有顯著不同。6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.1 mg/L（B2處理）時，增殖效果最為理想，增殖系數(shù)達到3.6倍，增殖倍數(shù)達到4.17倍，植株生長健壯，芽較多，葉色深綠色；B3、B4處理雖然增殖系數(shù)和增殖倍數(shù)較高，但是植株生長細弱、葉色淺綠，不是特別理想；B1、B7處理植株生長健壯、葉色深綠，表現(xiàn)為中等水平，增殖系數(shù)和倍數(shù)較B2處理低，但增殖的苗可以利用，其中，B1有一部分苗生長欠佳，但是B7的苗相對于B1來看生長健壯、葉色深綠，則B7比B1增殖效果稍好；B5、B6、B10處理增殖系數(shù)、增殖倍數(shù)都較低，但是增殖苗生長健壯，葉色深綠、營養(yǎng)充足，增殖苗可利用；B3、B4處理雖然增殖系數(shù)以及增殖倍數(shù)都較高，但是增殖苗長勢較弱，葉色不正，增殖苗營養(yǎng)不良；增殖效果最差的是B8、B9、B11處理，增殖系數(shù)比較低，而且苗幾乎不生長，45天增殖苗已經(jīng)開始老化，B11增殖倍數(shù)在所有處理中最高，但是增殖苗植株微型化、玻璃花，培育的苗無利用價值。

表2 臘花叢生芽增殖培養(yǎng)基（6-BA和NAA不同濃度配比）研究結(jié)果

當6-BA濃度過高、NAA濃度低有利于芽的分化，但不利于芽的生長；當6-BA濃度過低、NAA濃度過高不利于芽的分化，但能促進芽的生長。只有6-BA:NAA=10:1時，既能促進芽的分化又有利于幼芽的生長，獲得好的增殖苗。

2.3 不同濃度的IBA對臘花生根效果的影響

由表3可知，激素IBA濃度為0.6 mg/L（C3處理）時，臘花生根培養(yǎng)效果最佳，接種的無菌苗生根率100%，平均每株生根條數(shù)為6.84條，平均根長為6.86 cm，植株生根時間最早，且生長健壯、葉色深綠。C2、C4處理生根數(shù)中等，植株生長健壯，但是C4比C2生根時間晚，且長勢稍弱。較為一般的是C1處理，植株生長健壯，葉色深綠，但是生根時間較晚，且單株生根數(shù)較少。處理CK生根時間較晚，且平均每株生根數(shù)較少，此處理不適合生根培養(yǎng)。激素IBA濃度為0.6 mg/L最適宜臘花的生根培養(yǎng)，IBA濃度過高或過低都達不到最佳的生根效果。從表中可以看出，不添加植物生長調(diào)節(jié)劑無菌苗也能生根，但是根系細小，植株矮小，營養(yǎng)不良，不利于生根培養(yǎng)。

表3 不同濃度的IBA對臘花生根效果的研究結(jié)果

3 結(jié)論

（1）在臘花誘導實驗中，最適宜臘花誘導的培養(yǎng)基配方為MS+KT 3 mg/L+NAA 0.2 mg/L+瓊脂6.2 g/L+蔗糖30 g/L，pH 5.8，發(fā)生率達到88.8%，苗生長健壯，長勢良好，葉色深綠。

（2）在臘花增殖培養(yǎng)實驗中，最適宜臘花增殖培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.2 g/L，pH 5.8，增殖系數(shù)達到3.6倍，增殖倍數(shù)達到4.2倍，植株生長健壯，葉色深綠。

（3）在臘花生根培養(yǎng)實驗中，最適宜臘花生根培養(yǎng)的生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+IBA0.6 mg/L+瓊脂6.2 g/L+蔗糖30 g/L+活性炭0.1 g/L，pH 5.8，最早生根時間為15天，平均每株生根數(shù)為6.8條，平均根長為6.9 cm,，生根率100%，植株生長健壯，葉色深綠。

4 討論

臘花組織培養(yǎng)常用的外植體有莖尖、芽、莖段、葉片、花粉。一般幼嫩的組織材料褐變相對于較老化的組織材料來說較輕；另外，減小組織切口面積以及縮短組織暴露在空氣中的時間有利于減輕褐化。在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑和活性炭等都可以有效預防褐化的發(fā)生。有效的預防組織褐化方法有5種。（1）選擇適宜的外植體，一般以臘花的嫩莖、頂芽最為理想；（2）加入抗氧化劑或吸附劑，能有效減少褐化；（3）連續(xù)轉(zhuǎn)移外植體，對于新接種的外植體，將其快速轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上2～3次，在某些情況下可以減輕褐化，這段時間外植體的切口愈合，外滲停止；（4）對外植體進行消毒預處理；（5）給接種后的外植體適宜的暗處理。

錢仲秀等[4]以嫩莖為外植體，加入0.7%的PVP（聚乙烯聚吡氯烷酮）能有效防止褐變，平均發(fā)生率高達80%，最佳生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+IBA 0.5 mg/L，平均每株生根數(shù)4～5條，生根率為77.8%。本實驗加入了0.1 g/L的活性炭，增強了培養(yǎng)基的吸附能力，更有利于臘花植株的生長。根據(jù)本次實驗結(jié)果可知，IBA濃度過高或過低對臘花生根培養(yǎng)都無優(yōu)勢，IBA0.6 mg/L最適宜臘花的生根培養(yǎng)。