劉朝陽，胡華兵，王榮華，劉乃新，王茂芊

（1黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080；2石河子農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，新疆石河子 832000）

0 引言

甜菜是除甘蔗外中國重要的糖料作物之一，由于甜菜種子自身萌發(fā)緩慢，抗逆性較弱，難以滿足苗齊、苗勻、苗壯的需求，如何快速提高甜菜的發(fā)芽率、田間出苗率，提高甜菜的產(chǎn)量是亟待解決的問題[1-2]。為了獲得高而穩(wěn)定的產(chǎn)量，甜菜種子必須具有一定的抗性[3]。因此種子引發(fā)具有加速發(fā)芽、提高抗逆性、打破種子休眠的效果，能夠使種子自身代謝提高、活力增強(qiáng)、出苗整齊和改善營養(yǎng)狀況[4-6]。影響種子引發(fā)效果的因素多種多樣，引發(fā)方法、引發(fā)劑、時間、溫度等均對引發(fā)效果有影響，它們之間既相互作用又會相互影響[7]。水引發(fā)具有廉價、簡捷、安全環(huán)保和易推廣的優(yōu)勢，是促進(jìn)萌發(fā)但并不引起傷害的浸種技術(shù)[8-9]。如羅金梅等[10]為了探討打破豇豆種子休眠的處理途徑進(jìn)行豇豆種子水引發(fā)研究，結(jié)果表明新收獲的豇豆種子在20℃引發(fā)12 h能夠滿足生產(chǎn)需求。周紅濤等[11]研究發(fā)現(xiàn)，以水引發(fā)技術(shù)為基礎(chǔ)的“兩段浸種法”明顯提高了早稻種子殺菌劑抑制生長作用的抗性。江緒文等[12]在水引發(fā)處理對菠菜種子萌發(fā)及活力的影響研究中發(fā)現(xiàn)，不同大小等級菠菜種子通過適宜的水引發(fā)、保濕時間種子的活力得到提高。劉華榮等[13]研究水引發(fā)對百喜草萌發(fā)與幼苗生長的影響，結(jié)果表明35℃48 h的引發(fā)組合更加適于百喜草。由于國內(nèi)甜菜種子引發(fā)起步較晚，甜菜種子水引發(fā)的研究鮮有報道[14-15]。本研究以蒸餾水為引發(fā)劑，設(shè)置不同的溫度以及不同的預(yù)浸種時間組合，對甜菜種子進(jìn)行9個不同溫度、預(yù)浸種的處理，研究在水引發(fā)下先在常溫下預(yù)浸種時間10、20、30 min，然后在10℃相對濕度100%的環(huán)境中保濕24 h對甜菜種子萌發(fā)特性以及生理特性的影響，以期為甜菜種子引發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

試驗于2021年5—9月在黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院甜菜遺傳育種重點實驗室進(jìn)行。

1.2 試驗材料

供試材料選用甜菜單粒種TD802，由黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院的甜菜優(yōu)良品種選育團(tuán)隊提供。

1.3 試驗方法

研究采用的引發(fā)劑為蒸餾水，共設(shè)置有9個處理（表1）。甜菜種子先在蒸餾水中分別預(yù)浸種10、20、30 min，然后分別在10、20、30℃相對濕度100%的環(huán)境中保濕24 h，9個處理試驗的對照均為TD802干種子。浸泡結(jié)束后用蒸餾水快速清洗3～4次，用濾紙吸附干凈表面的浮水，置于25℃的鼓風(fēng)干燥箱中24 h，在此期間待種子與浸種前質(zhì)量一致時，再取出備用。

表1 蒸餾水的不同預(yù)浸種時間和處理溫度組合的9個處理

1.3.1 甜菜種子發(fā)芽試驗及電導(dǎo)率測定 本研究的引發(fā)處理試驗在黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院的甜菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心進(jìn)行。采用蒸餾水和次氯酸鈉將發(fā)芽盒清洗干凈、消毒、晾干，將滅過菌的發(fā)芽紙平鋪在晾干的發(fā)芽盒中，每個紙格放2粒種子，種子均勻擺開后，將33 mL蒸餾水均勻噴進(jìn)盒子里。每個處理3次重復(fù)，溫度設(shè)置為23℃。每天檢測發(fā)芽種子數(shù)，調(diào)查發(fā)芽勢和發(fā)芽率，測量胚根及肧軸總長度，計算發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)以及臨界閾值[式(1)～(4)]。利用Excel軟件數(shù)據(jù)分析和作圖。

挑選已引發(fā)處理和未引發(fā)的50粒顆粒飽滿的種子，以未引發(fā)的種子為對照，每個處理重復(fù)3次。放入潔凈的250 mL的燒杯中，加入200 mL蒸餾水，以未浸泡任何種子的蒸餾水為空白，用保鮮封口。于24℃室溫條件下浸泡24 h，用電導(dǎo)率儀測定溶液電導(dǎo)率，用400～600 mL的蒸餾水作為沖洗水，沖洗電導(dǎo)儀2次，用濾紙吸干。再將種子及浸泡液于沸水浴中煮10 min，冷卻至室溫后搖勻再次測定絕對電導(dǎo)率，并計算出相對電導(dǎo)率，如式(5)。

1.3.2 甜菜幼苗形態(tài)生理指標(biāo)的測定 采用硫代巴比妥酸(TBA)的方法測定丙二醛含量；SOD活性的測定采用氮藍(lán)四唑(NBT)還原法；用愈創(chuàng)木分法測定POD活性；采用紫外吸收法測定CAT活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度、預(yù)浸種時間萌發(fā)特性的處理結(jié)果

2.1.1 10℃不同預(yù)浸種時間引發(fā)組合的處理結(jié)果 表2結(jié)果顯示，處理1、2、3的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)分別為88.67%、88.33%、90%和32、32.9、34.43，均高于對照，與對照相比發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)分別高出了3.67、3.33、5個百分點和5.56、6.46、7.99。臨界閾值是對種子發(fā)芽率以及發(fā)芽指數(shù)的綜合評價，其值越大越能說明該種子引發(fā)效果好。根據(jù)上述發(fā)芽率以及發(fā)芽指數(shù)可得，處理1、2、3的臨界閾值均高于對照，其中處理3的臨界閾值最高達(dá)到了17.66，處理1和2分別為16.44、16.89，相比對照(13.64)分別高出了4.02、2.8、3.25。發(fā)芽勢分別為88%、85.67%、88.67%，均高于對照，分別高出了5、2.67、5.67個百分點。由活力指數(shù)結(jié)果可見，3個同一溫度不同預(yù)浸種組合處理的活力指數(shù)分別相較于對照高出1.69、1.6、1.49倍，分別為276.63、263、245.18。試驗結(jié)果顯示，在10℃不同預(yù)浸種時間組合處理甜菜種子時，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、臨界閾值均明顯高于對照，其中處理1的活力指數(shù)最高，處理3的臨界閾值最高。表明這3種組合處理可以有效激發(fā)種子活力，促進(jìn)種子生長。

表2 10℃不同預(yù)浸種時間組合處理甜菜種子萌發(fā)調(diào)查表

2.1.2 20℃不同預(yù)浸種時間引發(fā)組合的處理結(jié)果 表3結(jié)果顯示，處理4和6的發(fā)芽率相同均為86.33%，處理5的發(fā)芽率則為89.67%，而處理4、5、6的發(fā)芽指數(shù)分別為38.78、41.89、39.71，均高于對照，與對照相比發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)分別高出了1.33、4.67、1.33個百分點和12.34、15.45、13.27。處理4、5、6的臨界閾值均是高于對照，其中處理5的臨界閾值最高達(dá)到了21.39，處理4和6分別為19.82、20.29，相比對照分別高出了7.75、6.18、6.65。發(fā)芽勢分別為85%、89.33%、86%，分別高出對照2、6.33、3個百分點。由活力指數(shù)結(jié)果可見，3個同一溫度不同預(yù)浸種組合處理的活力指數(shù)分別較對照高出 2.49、2.44、2.73 倍 ，分別為 408.78、400.21、447.4。試驗結(jié)果顯示，在20℃不同預(yù)浸種時間組合處理甜菜種子時，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、臨界閾值均明顯高于對照，其中處理5的臨界閾值最高，引發(fā)效果好于其他2組處理，但是在常溫下預(yù)浸種30 min，然后在20℃保濕24 h的活力指數(shù)最高。表明處理6相較于其他2組更能激發(fā)種子自身活力。

表3 20℃不同預(yù)浸種時間組合處理甜菜種子萌發(fā)調(diào)查表

2.1.3 30℃不同預(yù)浸種時間引發(fā)組合的處理結(jié)果 表4結(jié)果顯示，處理7、8、9的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)分別為89%、86%、91%和32.4、35.61、36.35，均高于對照，與對照相比分別高出了4、1、6個百分點和5.69、9.17、9.91。根據(jù)上述發(fā)芽率以及發(fā)芽指數(shù)可得出，處理7、8、9的臨界閾值均高于對照，分別為16.65、18.24、18.63，較對照分別高出了3.01、4.6、4.99。發(fā)芽勢分別為87.33%、85%、90.67%，分別高出對照4.33、2、7.67個百分點。由活力指數(shù)結(jié)果可見，3個同一溫度不同預(yù)浸種組合處理的活力指數(shù)分別較對照高出2.13、2.63、2.51倍，分別為349.8、431.12、411.29。試驗結(jié)果顯示，在30℃不同預(yù)浸種時間組合處理甜菜種子時，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、臨界閾值都明顯高于對照，其中處理8的活力指數(shù)明顯高于其他2組，臨界閾值低于處理9，但是差異并不是很明顯。表明在常溫下預(yù)浸種20 min，然后在30℃保濕24 h的處理，能夠更好地使種子生長。

表4 30℃不同預(yù)浸種時間組合處理甜菜種子萌發(fā)調(diào)查表

2.1.4 不同溫度、預(yù)浸種時間引發(fā)組合的電導(dǎo)率處理結(jié)果 圖1結(jié)果顯示，9個不同引發(fā)組合相對電導(dǎo)率均高于對照且差異顯著(P＜0.05)，其中處理1、2、8，處理3、7，以及處理5、6、9的相對電導(dǎo)率分別相同，分別為95.33%、96%、94%。在10、20℃，隨著預(yù)浸種時間的增加呈增長趨勢，30℃與之相反，呈緩慢下降趨勢。結(jié)果表明，處理3和處理7能夠最大限度、最快速地修復(fù)、重建細(xì)胞膜，使種子損傷達(dá)到最小且滲出物最少。處理4細(xì)胞的損傷較為嚴(yán)重。

圖1 不同引發(fā)組合相對電導(dǎo)率處理結(jié)果

不同組合活力指數(shù)和電導(dǎo)率比對結(jié)果如圖2所示。9個不同引發(fā)組合的活力指數(shù)均高于對照且差異顯著(P＜0.05)，浸出液電導(dǎo)率均低于對照且不同溫度間差異顯著(P＜0.05)。在10℃時，隨著預(yù)浸種時間的增加，活力指數(shù)呈緩慢下降的趨勢，浸出液電導(dǎo)率無明顯差異，相較于對照降低了28.01%、27.44%、30.21%。在20℃時，隨著預(yù)浸種時間的增加，浸出液電導(dǎo)率雖然無顯著差異，卻呈緩慢下降的趨勢，比對照降低了40.38%、37.55%、36.02%。在30℃時，活力指數(shù)隨著預(yù)浸種時間的增加呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，浸出液電導(dǎo)率呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢，相比對照而言，分別降低了52.04%、51.45%、55.52%。根據(jù)活力指數(shù)以及電導(dǎo)率，在10℃時，除處理2浸出液電導(dǎo)率外處理1活力指數(shù)最高，浸出液電導(dǎo)率較低，因此處理1為10℃的最佳組合處理。在20℃和30℃時，處理6和處理8的活力指數(shù)最高，浸出液電導(dǎo)率最低，為20℃和30℃的最佳組合處理。經(jīng)過篩選處理1、6、8為最佳組合進(jìn)行后期的生理指標(biāo)測定。

圖2 不同組合活力指數(shù)和浸出液電導(dǎo)率比對

2.2 不同溫度、預(yù)浸種時間生理特性的處理結(jié)果

2.2.1 丙二醛 根圖3結(jié)果顯示，對照與處理1差異不顯著，但卻與處理6和處理8的差異顯著(P＜0.05)。處理1、8相比對照上升了0.06、1.84 μmol/g，處理6相比對照下降了1.25 μmol/g。隨著浸種溫度的增加，丙二醛含量呈先降低后增加的趨勢，預(yù)浸種時間則與之相反，呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢。結(jié)果表明，處理6丙二醛含量最低，處理8丙二醛含量最高；在常溫下預(yù)浸種30 min，然后在20℃保濕24 h，甜菜種子對逆境條件反應(yīng)較強(qiáng)，細(xì)胞膜質(zhì)過氧化水平也相對穩(wěn)定；在常溫下預(yù)浸種20 min，然后在30℃保濕24 h，甜菜種子對逆境條件反應(yīng)較弱。

圖3 不同引發(fā)組合丙二醛處理結(jié)果

2.2.2 抗氧化酶 SOD結(jié)果（圖4）顯示，對照與3個不同溫度、預(yù)浸種時間的組合處理差異均不顯著，處理1、6與處理8差異顯著(P＜0.05)。處理8相比對照上升了74.17 U/g，而處理1、6則分別下降了66.46、43 U/g，處理1、6、8隨著溫度的增加呈逐漸上升的趨勢，而隨著預(yù)浸種時間的增加則是呈先上升再下降的趨勢。CAT結(jié)果（圖5）顯示，對照與3個不同溫度、預(yù)浸種時間的組合處理差異均不顯著，處理1、8與處理6差異(P＜0.05)顯著。處理1、8相比對照分別上升了44.78、24.88 U/(g·min)，而處理6則下降了34.82 U/(g·min)，處理1、6、8隨著溫度的增加呈現(xiàn)先降低再增加的趨勢，而隨著預(yù)浸種時間的增加則是呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。POD結(jié)果（圖6）顯示，對照與處理6差異不顯著，但卻與處理1、8差異顯著(P＜0.05)。處理1和處理8相比對照上升了2.14和3.48倍，雖然處理6與對照差異不顯著，但是比對照上升了1.21倍，3個處理隨著溫度的增加呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢，但是隨著預(yù)浸種時間的增加則出現(xiàn)先上升再下降的趨勢。結(jié)果表明，處理8的SOD、POD活性最強(qiáng)，處理1的CAT活性最強(qiáng)，處理6的CAT、POD活性最弱。總體上，在常溫下預(yù)浸種20 min，然后在30℃保濕24 h的處理其抗氧化酶活性是最強(qiáng)的，能夠有效地消除逆境脅迫所產(chǎn)生的過氧化傷害。

圖4 不同引發(fā)組合SOD處理結(jié)果

圖5 不同引發(fā)組合CAT處理結(jié)果

圖6 不同引發(fā)組合POD處理結(jié)果

3 討論

種子引發(fā)的方法多種多樣，但是水引發(fā)相較于其他引發(fā)方法具有諸多優(yōu)點，在保證引發(fā)效果的同時更易于獲取、推廣。水引發(fā)已應(yīng)用到多種植物的引發(fā)研究，但是對于甜菜種子的研究卻鮮有報道，因此對于甜菜種子萌發(fā)具有重要意義。如劉慧霞等[16]在水引發(fā)對紫花苜蓿種子萌發(fā)及其生理活動的影響研究中發(fā)現(xiàn)，水引發(fā)能夠在萌發(fā)速率、萌發(fā)一致性以及修復(fù)生物膜、增強(qiáng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及抗逆性上具有顯著作用。馬向麗等[17]通過水引發(fā)對不同貯藏年限納羅克非洲狗尾草種子活力的影響研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過水引發(fā)的種子，可溶性糖、可溶性蛋白含量以及POD、CAT活性均有所上升，SOD活性先降低后升高。

水引發(fā)方法具有多種方式，如兩段浸種法、預(yù)浸種再保濕法、直接浸種法、控制給水法等，也有選擇自來水、去離子水等作為引發(fā)溶劑的。因此本研究的創(chuàng)新點在于將預(yù)浸種再保濕法和溫度相結(jié)合，篩選出好的組合處理。如黃如葵[18]在對水引發(fā)技術(shù)對三倍體西瓜種子發(fā)芽性能的影響研究中，先浸種2 h，然后在20℃相對濕度100%的環(huán)境中分別培養(yǎng)24、48 h，結(jié)果表明，種子的貯藏性能以及抗衰老能力得到增強(qiáng)。李振華等[19]研究水引發(fā)對煙草活力和萌發(fā)特征的影響，采用去離子水直接浸種24 h，結(jié)果表明低活力的種子萌發(fā)率基本也都達(dá)到90%以上。閔丹丹等[20]在紫花苜蓿種子水引發(fā)條件的優(yōu)化研究中，采用了控制給水的方法，發(fā)現(xiàn)溫度在10℃、引發(fā)時間為36 h、引發(fā)加水量為種子初始重的90%時種子的活力指數(shù)最高，可作為紫花苜蓿種子引發(fā)的最適條件。

電導(dǎo)率以及丙二醛反映細(xì)胞膜的完整性以及膜脂過氧化的成程度，是膜系統(tǒng)是否受到傷害的重要標(biāo)志之一[21-22]。抗氧化酶的增強(qiáng)意味著植物膜脂過氧化過程減緩，抗逆性提高[23]。如賀紅娟等[24]研究水引發(fā)對油松種子及幼苗的生理效應(yīng)及其作用機(jī)制，表明種子的可溶性糖、可溶性蛋白以及幼苗的過氧化氫酶、過氧化物酶均得到了提高。張同禎等[25]研究水引發(fā)對‘鄭單958’玉米種子萌發(fā)及幼苗生理特性的影響，發(fā)現(xiàn)12 h的水引發(fā)處理能夠促進(jìn)種子萌發(fā)，而且可溶性糖、可溶性蛋白增加，抗性酶增強(qiáng)。本研究運用蒸餾水作為引發(fā)劑設(shè)置不同的預(yù)浸種時間和溫度組合引發(fā)甜菜種子TD802，根據(jù)活力指數(shù)以及電導(dǎo)率，篩選出不同預(yù)浸種時間以及溫度效果較好的3組處理進(jìn)行生理試驗，發(fā)現(xiàn)處理6的抗氧化酶活性以及丙二醛含量均是最低。處理8的抗氧化酶活性最高，但是丙二醛含量也是最高的。處理1的丙二醛含量不是最高，同時抗氧化酶活性也不是最低，具有一定的穩(wěn)定性。

本研究不足之處在于甜菜種子預(yù)浸種時間較短，時間區(qū)間不大；在甜菜保濕階段未設(shè)置時間梯度，只設(shè)定為24 h，未做保濕階段時間上的處理對比。國內(nèi)現(xiàn)階段甜菜引發(fā)研究還只是處于初級階段，對甜菜水引發(fā)方面更是少之又少，今后可采用自來水、去離子水等引發(fā)試劑多做研究，設(shè)置不同的溫度、時間、浸種方法等，篩選出更多適宜甜菜種子水引發(fā)的條件。

4 結(jié)論

本研究中不同溫度、預(yù)浸種時間組合處理的9個處理對甜菜種子的萌發(fā)特性各有不同且均高于對照，3個最佳組合的生理特性則各不相同。在9個組合處理中，處理9的發(fā)芽率、發(fā)芽勢最高，處理5的發(fā)芽指數(shù)以及臨界閾值最高，處理6的活力指數(shù)最高。甜菜種子活力結(jié)合電導(dǎo)率可以做出更加準(zhǔn)確的判定。其中處理1為10℃以及預(yù)浸種10、20、30 min的最佳組合，處理6為20℃以及預(yù)浸種10、20、30 min的最佳組合，處理8為30℃以及預(yù)浸種10、20、30 min的最佳組合。隨著溫度的增加，丙二醛、POD、CAT都呈現(xiàn)先下降在上升的趨勢，但是隨著預(yù)浸種時間的增加，丙二醛、SOD、POD則是先上升再下降的趨勢。綜合3個酶活力指標(biāo)來看，處理8的酶活性最強(qiáng)，但是該處理的丙二醛含量也是最高，表明處理8在消除過氧化傷害的同時對逆境條件反應(yīng)較弱。處理6的酶活性最弱，相對的該處理的丙二醛含量也是最低，表明處理6對逆境條件反應(yīng)較強(qiáng)，細(xì)胞膜質(zhì)過氧化水平也相對穩(wěn)定。相較于處理6和處理8，處理1的丙二醛含量不是最高，同時抗氧化酶活性也不是最低，表明處理1細(xì)胞膜質(zhì)過氧化水平穩(wěn)定的同時能夠有效消除逆境脅迫所產(chǎn)生的過氧化傷害。結(jié)果表明，水引發(fā)處理對甜菜種子具有明顯的促進(jìn)作用，其中處理1引發(fā)效果最穩(wěn)定，能夠更好地在增強(qiáng)種子活力的同時提高種子的抗逆性。