杜 雨， 劉 筠， 胡曉桐， 賈西貝， 柳 迪， 馬彥軍

(甘肅農(nóng)業(yè)大學林學院， 甘肅 蘭州 730070)

生物調(diào)節(jié)因子(general regulatory factor，GRF)是調(diào)節(jié)植物生長、發(fā)育的特異轉(zhuǎn)錄因子[1]。第一個從植物中鑒定出來的GRF為水稻(Oryzasativa)OsGRF1，結(jié)果表明這些成員在水稻葉和莖的發(fā)育過程中起重要的調(diào)控作用[2]；隨后的研究進一步表明了這些轉(zhuǎn)錄因子在植物生長和適應方面的關(guān)鍵性作用，包括根系發(fā)育[3]，開花[4-5]，葉片大小和壽命[6]，如擬南芥的AtGRF1和AtGRF2控制葉片和子葉的大小，AtGRF1/AtGRF2/AtGRF3突變體通過細胞增殖和細胞膨脹的調(diào)控產(chǎn)生較小的葉片和子葉[7]。AtGRF4對子葉和莖頂端分生組織發(fā)育有重要影響，同時也參與葉細胞的增殖[8]。AtGRF5與AtGIF1協(xié)同作用，正向調(diào)控葉原基的發(fā)育[9]。GRF蛋白的N端有QLQ(Gln、Leu、Gln)和WRC(Trp、Arg、Cys)保守結(jié)構(gòu)域[2]，且QLQ存在于所有的真核生物中[2]，WRC則是植物特有的保守結(jié)構(gòu)域[2,10-11]。除此之外，在一些GRF的C端發(fā)現(xiàn)了其他保守區(qū)域，如FFD(Phe、Phe、Asp)、TQL(Thr、Gln、Leu)和GGPL(Gly、Gly、Pro、Leu)[2,7,12]；然而，它們的角色尚未揭曉[13]。

此外，有研究報告指出GRF能積極響應非生物脅迫[14-17]。如：擬南芥(Arabidopsisthaliana)中調(diào)節(jié)植物滲透脅迫耐受性的DREB2A基因，其激活需要抑制至少一個GRF[18-19]。在正常條件下，AtGRF7與DREB2A啟動子結(jié)合，抑制該基因表達；在非生物脅迫下導致AtGRF7表達受到抑制，從而激活DREB2A基因，同時AtGRF7還參與對NaCl脅迫抗性的負調(diào)控過程[15]。在辣椒(Capsicum)中CaGRF2，CaGRF3，CaGRF6，CaGRF7，CaGRF8調(diào)控辣椒鹽脅迫過程[20]。大白菜中(Brassicarapa)BrGRF5基因不僅參與對生長發(fā)育的正調(diào)控，還參與對鹽和滲透脅迫的負調(diào)控[21]。在冷和鹽等脅迫下木薯(Manihotesculenta)的MeGRF4基因呈上調(diào)表達[22]。在熱、鹽和干旱脅迫下玉米(Zeamays)的ZmGRF4和ZmGRF13有較高的表達[23]。在白刺中GRF3，GRF3like-3，GRF2like參與鹽脅迫應答，且具有各自不同的調(diào)節(jié)功能[24]。此外，在煙草(Nicotianatabacum)[25]和菊花(Chrysanthemummorifolium)[26]也發(fā)現(xiàn)了部分成員積極參與非生物脅迫。

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr．)為茄科(Solanceae)枸杞屬(LyciumL.)多年生灌木，多棘刺和分枝，無主枝。主要分布于我國西北荒漠地區(qū)[27]。黑果枸杞具有耐干旱、抗鹽堿的生物學特性，是改良荒漠化土壤的優(yōu)良植物[28]，同時也是荒漠區(qū)特有的先鋒植物，具有較高的經(jīng)濟和營養(yǎng)價值[29-30]。目前已從擬南芥[7](9個)、水稻[31](12個)、白菜[32](BrassicacampestrisL.)(17個)、玉米[12](14個)、煙草[33](25個)和番茄[17](Solanumlycopersicum)(13個)等多種植物中鑒定了GRF轉(zhuǎn)錄因子家族，但對黑果枸杞中的GRF基因仍缺乏系統(tǒng)的報道。因此本研究基于黑果枸杞在不同濃度NaCl脅迫下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過生物信息學的方法系統(tǒng)鑒定了黑果枸杞GRF基因家族成員，并進行序列比對，MEME分析，構(gòu)建進化樹及表達譜分析，為深入研究GRF基因在黑果枸杞抗鹽性方面所發(fā)揮的作用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取甘肅農(nóng)業(yè)大學林學組培實驗室保存的黑果枸杞組培苗為實驗材料。培養(yǎng)條件為：白天溫度(22±2)℃，夜晚溫度(20±2)℃，光照時間16 h·d-1，相對濕度約65%，光照強度約700 μmol·m-2·s-1。1/2MS培養(yǎng)基配方為：1/2MS培養(yǎng)基2.47 g·L-1，蔗糖20 g·L-1，瓊脂5 g·L-1，NAA 0.2 mg·L-1，IBA 0.2 mg·L-1。2周后，選擇生長健康、長勢一致的黑果枸杞組培苗，開蓋煉苗5 d后，將樣品移栽到1/2Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)。1/2 Hoagland營養(yǎng)液配方(pH=5.7)為：2 mmol·L-1KNO3，0.5 mmol·L-1KH2PO4，0.5 mmol·L-1MgSO4·7H2O，0.5 mmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O,50 μmol·L-1H3BO3，10 μmol·L-1MnCl2·4H2O,1.6 μmol·L-1ZnSO4·7H2O,0.6 μmol·L-1CuSO4,0.05 μmol·L-1Na2MoO4·2H2O,0.06 μmol·L-1Fe-citrate·2H2O[34]。2周后，在1/2 Hoagland營養(yǎng)液中加入50 mM和250 mM NaCl進行鹽脅迫處理，然后分別在處理后0，1和12 h取樣，并將未經(jīng)任何鹽處理的樣品作為對照組。每處理每時間3個生物學重復，分別取根、莖和葉各0.1 g，立即在液氮中冷凍，并在-80℃下儲存，直到用于總RNA分離。

1.2 方法

1.2.1鹽脅迫下黑果枸杞GRF基因家族的篩選及理化性質(zhì)分析 在轉(zhuǎn)錄組測序的NR、KOG和Swiss-Prot 3個數(shù)據(jù)庫進行注釋，篩選出的候選基因的蛋白序列導入NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)逐個進行蛋白序列預測，利用Pfam和NCBI的CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)進行保守結(jié)構(gòu)域分析后進入Intreproscan再次進行驗證，剔除不含有GRF蛋白保守結(jié)構(gòu)域的序列，最終得到黑果枸杞GRF蛋白序列。在線軟件ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)用于GRF轉(zhuǎn)錄因子家族的氨基酸大小、分子量、脂肪系數(shù)、不穩(wěn)定數(shù)和等電點等的預測。用統(tǒng)一的前綴“Lr”對黑果枸杞中的GRF成員進行排序。

1.2.2鹽脅迫下黑果枸杞GRF基因家族保守域驗證與基序分析 利用開放閱讀框(ORF)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)預測LrGRFs基因的氨基酸序列。利用DNAMAN8.0軟件對LrGRFs基因的氨基酸序列進行多序列比對并繪制多序列比對圖。通過在線工具MEME(https://meme.nbcr.net./meme/tools/meme)對黑果枸杞GRF基因保守結(jié)構(gòu)域元件(Motif)進行分析，根據(jù)Bailey[35]描述的方法，最佳圖案寬度為5～50，最大圖案數(shù)為5。通過TBtools(https://github.com/CJ-Chen/TBtools)軟件對導出的MEME文本結(jié)果進行保守基序圖的繪制。

1.2.3鹽脅迫下黑果枸杞GRF系統(tǒng)發(fā)育和表達譜分析 運用MEGA-X軟件(10.0.2版)對擬南芥、水稻、黑果枸杞、番茄和玉米進行了系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。從TAIR(http://www.arabidopsis.org/)和UniPort(https://www.uniprot.org)中下載擬南芥、水稻、玉米和番茄的序列。利用最大似然算法ML，Piosson model，bootstrap1000，進行進化分析。進化樹結(jié)果則用在線軟件iTOL(http://itol.embl.de/)進行美化。利用TBtools軟件的Heatmapper程序，構(gòu)建LrGRF基因的根部與葉部組織的表達譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫下黑果枸杞GRF基因篩選

利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選并剔除冗雜序列得到25條GRF轉(zhuǎn)錄組序列，進一步利用Pfam和NCBI的CDD篩選出具有QLQ或WRC結(jié)構(gòu)域的蛋白序列，最終檢索到14個LrGRFs轉(zhuǎn)錄因子家族成員，并將其命名為LrGRF1～LrGRF14(表1)。利用在線工具ExPASy對得到的14個LrGRFs氨基酸序列進行預測分析(表1)，結(jié)果顯示不同GRF轉(zhuǎn)錄因子的蛋白序列存在較大差異,預測的氨基酸數(shù)目在136(LrGRF14)～585 aa(LrGRF2)之間；分子量在14.566 97(LrGRF14)～62.986 65 kDa(LrGRF2)之間；理論等電點介于5.58(LrGRF14)～9.33(LrGRF3)之間，其中有3個酸性蛋白和11個堿性蛋白。蛋白質(zhì)穩(wěn)定性均高于40。脂肪系數(shù)結(jié)果顯示14個LrGRFs均為親水性蛋白。

表1 黑果枸杞GRF轉(zhuǎn)錄因子的理化性質(zhì)Table 1 The physicochemical properties of GRF transcription factors in L.ruthenicum

表2 模式植物基因ID號Table 2 Gene ID of model plant

2.2 黑果枸杞GRF基因家族保守域驗證與基序分析

為了了解LrGRF結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特征，對14個LrGRFs蛋白序列做多序列比對。由圖1可知，具有QLQ和WRC保守結(jié)構(gòu)域的LrGRFs蛋白序列有10個，其中LrGRF7，LrGRF10和LrGRF11基因僅包含1個WRC，LrGRF14基因僅含有QLQ。QLQ結(jié)構(gòu)域由19～159個氨基酸組成，WRC結(jié)構(gòu)域由38～234個氨基酸組成，在兩個結(jié)構(gòu)域中均有多個保守不變的氨基酸位點，分別為QX3LX2Q和CX9CX10CX2H(圖1)。

圖1 黑果枸杞GRF轉(zhuǎn)錄因子的多序列對比Fig.1 Multiple sequence alignment of GRF transcription factors in L.ruthenicum

為了更好地了解不同LrGRF中Motif的相似性和多樣性，通過MEME軟件對黑果枸杞GRF家族成員進行保守序列分析。結(jié)果如圖2，黑果枸杞GRF家族含有5個保守基序，依次命名為Motif1～Motif5；通過CDD數(shù)據(jù)庫驗證，Motif 1對應WRC結(jié)構(gòu)域，Motif 2對應QLQ結(jié)構(gòu)域，Motif4對應FFD結(jié)構(gòu)域；基序的長度從18個aa(motif 4)到49個aa(motif 3)；LrGRF中含Motif 1基序的有13個，含Motif 2基序的有10個，只含Motif 3基序的有4個，含Motif 4基序的有10個，含Motif 5基序的有4個。除了LrGRF14僅含有1個Motif 2基序外，其余的成員均含有2個以上的基序。由圖2可知，Motif 1和Motif 2的氨基酸序列比其他基序的保守性高，與結(jié)構(gòu)域的保守性一致。

圖2 黑果枸杞GRF轉(zhuǎn)錄因子的蛋白保守基序Fig.2 The protein conserved motif of LrGRF transcription factor in L.ruthenicum注：使用MEME程序鑒定的LrGRF家族蛋白中的保守基序Note：LrGRF family proteins identified using the MEME program

2.2 LrGRF的系統(tǒng)進化樹分析

為了更好地了解黑果枸杞GRF基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，選擇黑果枸杞的14個LrGRFs基因，擬南芥的9個GRFs蛋白，水稻的12個GRFs蛋白，玉米的14個GRFs蛋白和番茄的13個GRFs蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果表明(圖3)，14個LrGRFs被分成 7個亞族(Ⅰ～Ⅶ)，Ⅰ亞族含有LrGRF1和LrGRF5，Ⅱ亞族含有LrGRF9，Ⅲ亞族沒有含有LrGRF基因，Ⅳ亞族含有LrGRF4，LrGRF7，LrGRF11和LrGRF13，Ⅴ亞族含有LrGRF3和LrGRF12，Ⅵ亞族含有LrGRF8，LrGRF10和LrGRF14，Ⅶ亞族含有LrGRF2和LrGRF6。同時還表明IV亞族和Ⅶ亞族的GRF蛋白數(shù)量較多，分別有15和13名成員，沒有水稻和玉米GRF蛋白則被歸入Ⅰ，Ⅴ和Ⅵ亞族。此外，在系統(tǒng)發(fā)育樹中，一些GRF基因形成相關(guān)姐妹對，如LrGRF4和7，LrGRF8和14，OsGRF10和12，ZmGRF4和10，ZmGRF3和9，ZmGRF5和6，ZmGRF8和13，ZmGRF12和14，AtGRF1和2，AtGRF3和4，AtGRF5和6等(圖3)。綜上所述，不同植物的GRF家族成員經(jīng)歷了不同的進化過程，且與其他模式植物相比，LrGRF蛋白與SlGRF蛋白的關(guān)系更加密切。

2.3 不同鹽脅迫下LrGRF基因的表達譜分析

為初步分析黑果枸杞GRF基因的功能，在NaCl處理下對葉和根不同組織器官的14個LrGRFs基因表達情況進行分析。結(jié)果表明，不同LrGRF基因在不同組織器官中的表達量存在明顯差異。在葉部組織中多數(shù)基因在鹽脅迫下表達較為活躍，其中LrGRF9和LrGRF4表達量較低，屬于鹽脅迫誘導下調(diào)的基因，推測這兩個基因可能受到鹽脅迫的抑制；在根部組織中LrGRF6，LrGRF10，LrGRF12和LrGRF14在鹽處理不同時段下表達量較高，屬于脅迫誘導上調(diào)的基因，LrGRF2和LrGRF3在無鹽脅迫時根部的FPKM值較高，在L50-1 h的根部FPKM值降低，屬于鹽脅迫誘導下調(diào)的基因，在L250-1 h的根部FPKM值接近于對照，屬于高鹽脅迫下表達無差異的基因，LrGRF1，LrGRF4，LrGRF7，LrGRF9，LrGRF11和LrGRF13在鹽脅迫下降低，屬于鹽脅迫誘導下調(diào)的基因(圖4)。LrGRF2和LrGRF12在葉部組織中總體呈升高趨勢，在根部中表達量呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢；說明LrGRF2和LrGRF12在黑果枸杞的葉部組織的鹽脅迫過程中可能起到重要作用(圖5)。綜上所述，與對照相比，黑果枸杞中LrGRF2，LrGRF6，LrGRF10和LrGRF12表達量高，揭示它們在響應黑果枸杞鹽脅迫的過程中發(fā)揮重要的功能。

圖4 LrGRF基因在黑果枸杞不同組織中的表達模式Fig.4 Expression patterns of LrGRF gene in different tissues of L.ruthenicum注：L=leaf;R=root。R50-1=50 mmol·L-1NaCl處理下1小時所取根樣；L50-1=50 mmol·L-1 NaCl處理下1小時所取葉樣；R250-1=250 mmol·L-1 NaCl處理下1小時所取根樣；L250-1=250 mmol·L-1NaCl處理下1小時所取葉樣；R50-12=50 mmol·L-1 NaCl處理下12小時所取根樣；L50-12=50 mmol·L-1NaCl處理下12小時所取葉樣；R250-12=250 mmol·L-1NaCl處理下12小時所取根樣；L250-12=250 mmol·L-1NaCl處理下12小時所取葉樣，R0=CK根；F0=CK葉Note:R50-1=50 mmol·L-1of NaCl treatment 1 hour root sample;L50-1=50 mmol·L-1of NaCl treatment 1 hour leaf sample;R250-1=250 mmol·L-1NaCl treatment 1 hour root sample;L250-1=250 mmol·L-1NaCl reatment 1 hour leaf sample;R50-12=50 mmol·L-1NaCl treatment 12 hours root sample;L50-12=50 mmol·L-1L NaCl treatment 12 hours leaf sample;R250-12=250 mmol·L-1NaCl treatment 12 hours root sample;L250-12=250 mmol·L-1NaCl treatment 12 hours leaf sample;R=root treatment control;L0:leaf treatment control

圖5 LrGRF基因響應鹽處理的表達分析Fig.5 Expression analysis of LrGRF gene in response to salt treatment

3 討論

GRF轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育過程中起著重要作用[36]。近年來，不同植物的GRF轉(zhuǎn)錄因子成員及遺傳功能已經(jīng)得到了鑒定。但黑果枸杞GRF轉(zhuǎn)錄因子的研究還鮮有報道。本研究利用現(xiàn)有的黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定了14個GRF，并對其家族成員特征進行了系統(tǒng)的分析。為進一步研究黑果枸杞GRF家族成員的功能提供了豐富的理論基礎(chǔ)。

保守結(jié)構(gòu)域的驗證是基因家族的核心，在基因中具有重要功能。通過多序列比對與保守基序分析，除LrGRF14基因，其余LrGRFs基因至少含有兩個或兩個以上的motif；LrGRF14僅含QLQ結(jié)構(gòu)域，其他家族成員含有WRC結(jié)構(gòu)域和其他結(jié)構(gòu)域，由此推測這13個蛋白質(zhì)功能具有多樣性。LrGRFs蛋白序列含有QLQ與WRC保守結(jié)構(gòu)域，這與擬南芥[37]、水稻[38]、油菜[39]等蛋白序列結(jié)構(gòu)高度相似，且在黑果枸杞中，WRC結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性更高一些。結(jié)合進化樹分析，同一亞族的LrGRFs基因具有非常相似的保守基序，這表明黑果枸杞GRF基因具有高度保守的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。這進一步驗證了LrGRFs各序列之間的保守性和進化樹亞族分類的精準度，有利于進一步分析黑果枸杞中GRF家族功能。同時在黑果枸杞中發(fā)現(xiàn)有兩個基因包含兩個WRC結(jié)構(gòu)域是LrGRF2和LrGRF9，這在擬南芥、油菜和番茄中也有發(fā)現(xiàn)[7,17,39]，同時LrGRF4，LrGRF5和LrGRF7包含2個FFD結(jié)構(gòu)域。此外，位于同一亞族的LrGRFs基因其Motif組成及排列順序基本相同，這與香蕉[40](Musaparadisiaca)、葡萄[41](VitisviniferaL.)和番茄[17](SolanumLycopersicum)等GRF轉(zhuǎn)錄因子中的結(jié)果類似。這意味著LrGRFs的分類得到了保守基序的進一步支持，同時也說明了亞族成員間序列的高度保守性。

通過系統(tǒng)發(fā)育分析將14個LrGRFs分為7個亞族(圖3)，這與GRF家族中其他高等植物的分類結(jié)果一致，如番茄[17]和棉屬[42](Gossypium)等。除Ⅲ亞族外，其余亞族含有擬南芥、番茄與水稻的GRF基因家族成員，表明黑果枸杞與擬南芥、番茄之間可能具有類似的進化軌跡，且在對比五種不同的植物GRF基因家族進化分析，結(jié)果顯示黑果枸杞與番茄的同源性最高，表明黑果枸杞與番茄在進化中有相近的起源關(guān)系。但黑果枸杞GRF基因在進化上又表現(xiàn)出差異性，暗示了其基因功能的多樣性。通常，位于同一亞族的基因可能具有相似的功能，因此可以通過基因家族成員的亞族分類來預測同一分支上其他基因的功能。基因表達譜可以幫助研究人員進一步探索植物物種的生物學特性(抗逆性、發(fā)育調(diào)控和亞族組織特異性)，為后續(xù)的功能研究奠定基礎(chǔ)[43-44]。

從結(jié)果分析來看，黑果枸杞中大部分LrGRF的表達量與對照組相比在鹽脅迫下有所提高，且在根部組織和葉部組織有不同的表達模式。其中LrGRF6、LrGRF10和LrGRF12在根中高表達，而LrGRF2，LrGRF6和LrGRF10在葉中表現(xiàn)為高表達。在番茄中SlGRF2和SlGRF3基因在鹽脅迫顯著上調(diào)，表明其參與鹽脅迫的調(diào)控過程[17]，因此推測黑果枸杞的LrGRF2，LrGRF8和LrGRF14參與鹽脅迫的調(diào)控。AtGRF7與LrGRF10位于同一亞族的分支，推測LrGRF10可能參與對NaCl脅迫抗性的負調(diào)控過程[15]。在番茄中SlGRF4在處理后3 h顯著上調(diào)從而參與鹽脅迫的過程[17]，推測黑果枸杞的LrGRF6基因有相同的作用。因此，這些LrGRFs可以作為提高作物抗鹽性的候選基因，但還需要進一步的研究來揭示LrGRF在鹽脅迫下的分子機制。

4 結(jié)論

綜上所述，黑果枸杞在鹽脅迫下的轉(zhuǎn)錄組中篩選出14個LrGRF家族基因，并進一步分析了理化性質(zhì)、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和表達譜模式，以預測它們可能的生物學功能。多序列比對發(fā)現(xiàn)基因家族成員含有QLQ和WRC保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析顯示LrGRF可以分為7個亞族。LrGRFs基因的組織表達譜中LrGRF6、LrGRF10和LrGRF12在根中高表達，而LrGRF2，LrGRF6和LrGRF10在葉中表現(xiàn)為高表達，揭示它們在黑果枸杞組織中的生物學功能。該結(jié)果為進一步研究黑果枸杞及GRF家族成員的潛在功能提供參考。