任 志，馬振增 (蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，安徽 蚌埠 233000)

由于缺乏典型的臨床癥狀和特異性的早期診斷標(biāo)志物，大部分胃癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，該時(shí)期的胃癌患者缺乏有效的治療手段，預(yù)后極差[1-2]。因此研究胃癌早期診斷的特異性標(biāo)志物及其治療靶點(diǎn)，對(duì)胃癌的早期診斷、判斷預(yù)后進(jìn)而早期治療具有重要的臨床及科研意義。Y-box結(jié)合蛋白1(YB-1) 是冷休克蛋白超家族的一員,是從細(xì)菌到人類的細(xì)胞中均廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子， 包含一個(gè)進(jìn)化高度保守的冷休克域(CSD)，可與DNA及RNA結(jié)合[3]。YB-1作為轉(zhuǎn)錄和翻譯因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及應(yīng)激反應(yīng)等方面具有重要作用[4]。文獻(xiàn)報(bào)道它是一種與腫瘤的生長(zhǎng)、增殖及耐藥性密切相關(guān)的多功能蛋白，參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、RNA剪切、mRNA 翻譯、DNA損傷修復(fù)、 細(xì)胞增殖和再生調(diào)節(jié)等多種過程[5]。大量文獻(xiàn)中研究發(fā)現(xiàn)YB-1在胰腺癌、淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、骨肉瘤等腫瘤中呈高表達(dá)[6-8]，其表達(dá)水平與腫瘤的進(jìn)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、 化療耐受及預(yù)后不良相關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)YB-1在人體胃癌標(biāo)本中呈過表達(dá)狀態(tài)[9]，但YB-1促進(jìn)胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不明確以及是否與胃癌患者預(yù)后相關(guān)的研究較少。

生物信息分析是利用信息技術(shù)進(jìn)行基因生物學(xué)分析的有效方法，可以分析各個(gè)系統(tǒng)腫瘤特殊臨床表現(xiàn)與分子生物學(xué)的關(guān)系，通過對(duì)胃癌及YB-1的相關(guān)分析，可以分析兩者的相互關(guān)系，為研究胃癌及評(píng)估胃癌患者預(yù)后提供一定的生物基因相關(guān)的證據(jù)，以提供新的診治胃癌的技術(shù)及方法。因此，本研究將通過生物信息學(xué)分析YB-1在胃癌組織表達(dá)水平與相關(guān)凋亡基因中的關(guān)聯(lián)，同時(shí)在胃癌細(xì)胞中分析兩者間調(diào)控關(guān)系，揭示YB-1在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1 材料與方法

1.1材料：MKN-47胃癌細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生物細(xì)胞研究所；Annexin V-APC/7-AAD凋亡試劑盒(AP105)購自上海聯(lián)科生物；siRNA-YB-1和si-RNA-NC由上海生工設(shè)計(jì)并合成；LipofectamineTM3000 Transfection Reagent(Invitrogen，USA)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清FBS購自Gibco公司。

1.2方法

1.2.1生物信息學(xué)分析YB-1在多個(gè)類型腫瘤中的表達(dá)水平及與胃癌的預(yù)后生存狀態(tài)：通過Oncomine腫瘤數(shù)據(jù)庫在線分析YB-1在多個(gè)類型腫瘤組織中的表達(dá)水平，選擇腫瘤類型后，在Primary filters輸入檢索基因YB-1，其判斷標(biāo)準(zhǔn)為癌組織/正常組織中的YB-1水平>2倍且P<0.05。除此之外，利用該數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因表達(dá)與生存狀態(tài)的關(guān)聯(lián)分析。

1.2.2生物信息學(xué)分析胃癌中與YB-1共表達(dá)的基因：同樣通過Oncomine腫瘤數(shù)據(jù)庫在線分析胃癌中與YB-1共表達(dá)的基因，其操作如下：在Search欄輸入YB-1，在Primary filters里依次選擇Analysis Type → Coexpression Analysis，在Cancer Type里選擇Gastric Carcinoma，頁面刷新后進(jìn)行Coexpression分析。

1.2.3siRNA靶向抑制MKN-45胃癌細(xì)胞中YB-1：siRNA-YB-1和siRNA-NC序列參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)，由上海生工公司進(jìn)行合成。接種適量的MKN-45胃癌細(xì)胞到六孔板中，使第2天細(xì)胞融合度為50%～70%時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。按每個(gè)孔250 μl Opti-MEM培養(yǎng)基含有2.5 μg siRNA與3.75 μl Lipofectamine 3000充分混勻并靜置5 min以上之后加入到六孔板，并補(bǔ)充2 ml無血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染6 h后，更換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞做后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4Western印跡分析siRNA抑制YB-1效果：收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，加入IP細(xì)胞裂解液提取蛋白并經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒定量。按每孔30 μg 總蛋白的量進(jìn)行上樣，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜并用脫脂牛奶室溫封閉2 h后，孵育一抗YB-1(ab76149，1∶1 000稀釋)，4℃搖床過夜。第2天，TBST洗滌之后，加入二抗室溫孵育1 h，然后用TBST洗滌3次，5 min/次，進(jìn)行顯影。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)siRNA靶向抑制YB-1后MKN-45胃癌細(xì)胞的凋亡水平：收集經(jīng)上述驗(yàn)證后的MKN-45細(xì)胞，參照試劑盒說明書進(jìn)行凋亡染色，具體步驟如下：按說明書設(shè)計(jì)單和雙染管進(jìn)行儀器參數(shù)調(diào)節(jié)。收集1×106～3×106個(gè)細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌2次，加入稀釋好的1×結(jié)合緩沖液進(jìn)行重懸，往上述沒管細(xì)胞懸液加入5 μl Annexin V-APC和10 μl 7-AAD，輕微混勻，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

2 結(jié)果

2.1生物信息學(xué)分析YB-1在多個(gè)類型腫瘤中的表達(dá)水平及與胃癌的預(yù)后生存狀態(tài)：如圖1所示，經(jīng)數(shù)據(jù)庫搜索分析發(fā)現(xiàn)，YB-1在多個(gè)腫瘤類型中均呈過度表達(dá)狀態(tài)，包括胃癌，提示YB-1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演著重要地位。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，YB-1過表達(dá)與胃癌患者的不良預(yù)后存在關(guān)系，即YB-1過表達(dá)患者的生存時(shí)間更短，見圖2。

圖1 YB-1在多個(gè)類型腫瘤中的表達(dá)水平

圖2 YB-1過表達(dá)與胃癌的預(yù)后生存狀態(tài)

2.2生物信息學(xué)分析胃癌中與YB-1共表達(dá)的基因：如圖3A所示，通過CCLE數(shù)據(jù)庫中的胃癌數(shù)據(jù)對(duì)YB-1基因的共表達(dá)基因進(jìn)行分析，結(jié)果顯示YB-1與YBX1B10、SF3A3、PPIH、NASP、UTP11L、NDUFS5、STK25等多個(gè)基因共表達(dá)，且與NASP存在正相關(guān)關(guān)系。如圖3B所示，共表達(dá)基因YBX1B10、SF3A3、PPIH和NASP與YB-1均存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。

圖3 胃癌中與YB-1共表達(dá)的基因

2.3siRNA靶向抑制MKN-45胃癌細(xì)胞中YB-1：人正常胃黏膜細(xì)胞GES-1與胃癌細(xì)胞MKN-45中YB-1的表達(dá)水平比較，如圖4所示，胃癌細(xì)胞MKN-45中YB-1的表達(dá)水平顯著高于GES-1細(xì)胞，經(jīng)siRNA-YB-1轉(zhuǎn)染后可顯著降低MKN-45細(xì)胞中YB-1的表達(dá)水平，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

與GES-1細(xì)胞比較，①P<0.01；與NC組比較，②P<0.01圖4 siRNA靶向抑制MKN-45胃癌細(xì)胞中YB-1

2.4siRNA靶向抑制MKN-45胃癌細(xì)胞中YB-1后細(xì)胞增殖、凋亡水平改變：如圖5A所示，經(jīng)siRNA-YB-1轉(zhuǎn)染抑制YB-1，用CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖水平，在第3天開始，siRNA-YB-1組細(xì)胞的增殖速度顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。如圖5B所示，經(jīng)siRNA-YB-1轉(zhuǎn)染抑制YB-1，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平，結(jié)果顯示siRNA-YB-1組細(xì)胞的凋亡水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

A；細(xì)胞增殖試驗(yàn)；B；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，與siRNA-YB-1比較，①P<0.01圖5 siRNA靶向抑制MKN-45胃癌細(xì)胞中YB-1后細(xì)胞增殖、凋亡水平改變

3 討論

胃癌是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因，也是2018年全球第六大最常見的癌癥[10]。在上消化道腫瘤中，胃癌在東亞國家尤為常見。因此對(duì)胃癌的早期診斷、判斷預(yù)后進(jìn)而早期治療具有重要的臨床及科研意義。眾多文獻(xiàn)報(bào)道YB-1可參與腫瘤的生長(zhǎng)、增殖及耐藥性密切相關(guān)的多功能蛋白，參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、RNA剪切、mRNA 翻譯、DNA損傷修復(fù)、 細(xì)胞增殖和再生調(diào)節(jié)等多種過程[11-12]。研究表明，YB-1參與胃黏膜上皮內(nèi)瘤變進(jìn)展、癌變及轉(zhuǎn)移過程，然而關(guān)于利用數(shù)據(jù)庫分析YB-1在多個(gè)腫瘤組織的表達(dá)水平與預(yù)后狀態(tài)，同時(shí)結(jié)合分子生物實(shí)驗(yàn)闡述YB-1在該過程的發(fā)生發(fā)展還尚未研究[13]。在本研究中，通過Oncomine腫瘤數(shù)據(jù)庫分析YB-1在多種腫瘤類型中的表達(dá)水平，并發(fā)現(xiàn)YB-1在胃癌中呈過度表達(dá)狀態(tài)，同時(shí)其過度表達(dá)與胃癌患者的不良預(yù)后存在相關(guān)關(guān)系，提示YB-1在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。同時(shí)本文利用CCLE數(shù)據(jù)庫中的胃癌數(shù)據(jù)對(duì)YBX1基因的共表達(dá)基因進(jìn)行分析，結(jié)果顯示YBX1與YBX1P10、YBX1P1、YBX1P2、SF3A3、PPIH、NASP、UTP11L、NDUFS5、STK25等多個(gè)基因共表達(dá)，說明YB-1與多個(gè)基因水平有著密切關(guān)系。而這里面的基因，如NASP可參與細(xì)胞的增殖，調(diào)控細(xì)胞周期[11]。因此YB-1可能影響這些基因起到促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。

接下來分析了YB-1在人正常胃黏膜細(xì)胞GES-1與胃癌細(xì)胞MKN-45的表達(dá)水平，其結(jié)果顯示MKN-45細(xì)胞YB-1的表達(dá)水平顯著高于GES-1細(xì)胞，與前人報(bào)道的一致。除此之外，本文進(jìn)一步通過siRNA抑制MKN-45細(xì)胞YB-1的表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn)，其細(xì)胞增殖水平降低和凋亡率增加，提示減少YB-1可抑制胃癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。這暗示著YB-1有望作為一個(gè)治療靶點(diǎn)進(jìn)行胃癌的治療。