李曉芳,趙 敏,肖 芳,張?jiān)妳R (.承德醫(yī)學(xué)院研究生院,河北 承德 067000；.秦皇島市第一醫(yī)院,河北 秦皇島 066000)

食管癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)食管癌的患病人數(shù)從1990 年的254 169例增加至498 410例，食管癌新發(fā)病人數(shù)從 1990 年的173 687例增加至2019年278 121例[1]。食管癌的病理分型主要分為鱗狀細(xì)胞癌和腺癌，其中以鱗狀細(xì)胞癌最常見(jiàn)。食管癌患者早期多無(wú)明顯癥狀，晚期可表現(xiàn)為進(jìn)行性吞咽困難。近年來(lái)，隨著胃鏡發(fā)展，使得食管癌早期診斷率有所提高，使患者得以早發(fā)現(xiàn)早治療。食管癌治療以手術(shù)切除為主，輔以化療、放療及多學(xué)科聯(lián)合治療等，但患者的5年生存率仍僅為20%～30%[2]。因此，深入研究食管癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，探索新的相關(guān)分子標(biāo)志物，對(duì)食管癌的防治及預(yù)后具有重要意義。

Six1是同源盒基因Six家族的一員，是發(fā)育的主要調(diào)控因子，對(duì)正常組織和器官發(fā)育至關(guān)重要[3]。在胚胎發(fā)育早期，Six1在很多組織和器官，如肌肉、腦、腎臟等組織和器官?gòu)V泛表達(dá)。近年來(lái)研究表明，在人類多種腫瘤中如胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胰腺癌等存在Six1的異常表達(dá)，并通過(guò)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲遷移能力等參與惡性腫瘤發(fā)展進(jìn)程[4-7]。目前關(guān)于Six1在食管鱗狀細(xì)胞癌中的研究較少，本研究通過(guò)檢測(cè)Six1在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)以及其與臨床病理特征的關(guān)系，探討Six1在食管癌發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。

1 材料與方法

1.1材料：回顧性分析2016年1月～2020年10月秦皇島市第一院病理科確診的食管鱗狀細(xì)胞癌56例，食管高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變47例，食管低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變39例，正常食管黏膜組織61例。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他組織學(xué)類型食管癌；②患者術(shù)前經(jīng)過(guò)放療或者化療；③患者患有其他惡性腫瘤、重大臟器疾病或嚴(yán)重免疫系統(tǒng)疾病;④臨床資料不全。Six1(C104244,工作濃度1∶150)抗體購(gòu)自SIGMA公司。

1.2方法：免疫組化所有入選標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色。免疫組化采用Elivision兩步法染色，切片常規(guī)脫蠟至水，EDTA(pH 8.0)抗原修復(fù)液高壓修復(fù)1.5 min，0.3% H2O2封閉10 min，一抗4℃過(guò)夜，用PBS代替一抗做陰性對(duì)照，二抗室溫30 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后蘇木素復(fù)染，樹(shù)膠封片。本次研究經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.3結(jié)果判讀：所有病例的HE切片及免疫組化染色結(jié)果均經(jīng)科內(nèi)2位以上高年資主任醫(yī)師獨(dú)立判讀。免疫組化染色結(jié)果的判讀采用雙評(píng)分半定量法：染色強(qiáng)度無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色或棕褐色為2分；陽(yáng)性細(xì)胞百分比<5%時(shí)，記為0分；陽(yáng)性細(xì)胞百分比為5%～25%時(shí)，記為1分；陽(yáng)性細(xì)胞百分比為25%～50%時(shí)，記為2分，陽(yáng)性細(xì)胞百分比為50%～75%時(shí)，記為3分；當(dāng)陽(yáng)性細(xì)胞百分比>75%時(shí)，記為4分。當(dāng)染色強(qiáng)度評(píng)分×陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分≥5分時(shí)，為免疫反應(yīng)(+)，否則為(-)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩個(gè)/多個(gè)樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Six1的表達(dá)：Six1表達(dá)于細(xì)胞核，正常食管黏膜組織中基底細(xì)胞陽(yáng)性。上皮內(nèi)瘤變組織中基底層至全層Six1散在陽(yáng)性。食管癌組織中，Six1在腫瘤細(xì)胞中彌漫強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。正常食管黏膜(15/61)陽(yáng)性、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變(23/39)陽(yáng)性、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變(36/47)陽(yáng)性、食管癌(44/56)陽(yáng)性。食管癌組織中Six1陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常食管黏膜及上皮內(nèi)瘤變組織(P<0.05)。見(jiàn)圖1～4,表1。且從正常黏膜到癌組織，陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高。

2.2食管癌中Six1的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系：食管癌中Sxi1的表達(dá)與患者性別、年齡、腫物最大徑無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與分化程度、浸潤(rùn)深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

圖1 正常食管黏膜組織中基底細(xì)胞Six1陽(yáng)性(×100)

圖2 低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織中上皮層Six1散在陽(yáng)性(×100)

圖3 低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織中上皮層Six1散在陽(yáng)性(×40)

圖4 食管癌組織中Six1彌漫強(qiáng)陽(yáng)性(×100)

表1 Six1在不同食管組織中的表達(dá)(n)

表2 食管癌中Six1表達(dá)與其臨床病理特征的關(guān)系(n)

3 討論

同源盒基因Six1，屬Six轉(zhuǎn)錄因子家族。Six蛋白最早發(fā)現(xiàn)于果蠅復(fù)眼，從無(wú)脊椎動(dòng)物到人類高度保守。在脊椎動(dòng)物中，Six家族可分為三個(gè)亞組:Six1/Siχ2(So)、Six3/Six6(Optix)和Six4/Six5(Dsix4)。Six1定位于人染色體14q23上，其Six同源結(jié)構(gòu)域(HD， 60個(gè)氨基酸)和Six結(jié)構(gòu)域(SD，110～115個(gè)氨基酸)高度保守[8]。Six1是發(fā)育的主要調(diào)控因子，對(duì)正常組織和器官發(fā)育至關(guān)重要，如肌肉、腎、聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)，感覺(jué)器官和顱面結(jié)構(gòu)等。在胚胎發(fā)育早期，Six1在多種組織和器官，如肌肉、腦、腎臟等組織和器官?gòu)V泛表達(dá)，待發(fā)育成熟后，Six1表達(dá)降低或消失。在胚胎發(fā)育初期，Six1丟失或表達(dá)異常，可引起各個(gè)器官的發(fā)育異常，如人鰓-耳-腎綜合征(BOR)，目前普遍認(rèn)為是由于Six1突變，導(dǎo)致EYA1-Six1-DNA復(fù)合物形成障礙所致[9]。

近年來(lái)，在人類多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)Six1的異常表達(dá)，Six1在接受其上游基因調(diào)控的同時(shí)也調(diào)節(jié)其下游靶基因，參與多種通路、機(jī)制來(lái)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展。曹燕飛等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miR-185 可以靶向Six1基因，進(jìn)而促進(jìn)肺癌細(xì)胞EMT。早在2006年，Ng等[11]就發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞癌(HCC)組織中，Six1過(guò)表達(dá)，且其與靜脈浸潤(rùn)、晚期病理腫瘤轉(zhuǎn)移(pTNM)期和較差的總生存率相關(guān)。在其接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，又進(jìn)一步證實(shí)在HCC中，shRNA抑制Six1表達(dá)可抑制MHCC97L細(xì)胞的增殖及侵襲能力、降低F-actin聚合，并在G2/M期調(diào)控中發(fā)揮作用，從而抑制肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[12]。

本研究中提示Six1在食管癌的發(fā)生過(guò)程中起到一定作用。進(jìn)一步分析食管癌組織中Six1陽(yáng)性表達(dá)與食管癌的臨床病理特征的關(guān)系。提示Six1參與食管癌的進(jìn)展過(guò)程，且初步證明Six1與食管癌的侵襲與轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究結(jié)果與上述Six1在其他腫瘤中的表達(dá)有相似之處，總的來(lái)說(shuō)，Six1在腫瘤組織中過(guò)表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。但是本研究仍存在不足，在接下來(lái)的研究中，將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)，在定性的基礎(chǔ)上進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)，逐步深入其致癌機(jī)制的研究。

綜上所述，Six1可能參與并促進(jìn)食管癌的發(fā)生與進(jìn)展，此后，將逐步深入探討其相關(guān)機(jī)制，希望為食管癌的防治提供新的可能分子機(jī)制。