陳其桂 李大文** 成俊萍 何泳志 龐太森 黃泰帥

1.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)與遺傳中心（南寧 530021）；2.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院生殖中心（南寧 530003）

目前，在體外受精-胚胎移植（in vitro fertilizationembryo transfer,IVF-ET）助孕中，有70-80%受精率，但在精液參數(shù)分析正常的患者中，仍有一定概率遇到完全受精失?。╰otal fertilization failure,TFF）或部分受精失?。╬artial fertilization failure,PFF）的狀況[1]，這既對(duì)病人精神及經(jīng)濟(jì)造成損傷，也令醫(yī)生沮喪與困擾。多種因素均可導(dǎo)致受精失敗，如體內(nèi)激素水平、卵母細(xì)胞質(zhì)量、精子質(zhì)量異常、減數(shù)分裂異常和精卵結(jié)合異常等[2，3]。在這些因素中，主要緣由可能是精卵結(jié)合異常。

一些研究[4-6]表明，精子正常形態(tài)率（Normal sperm morphology rate，NSMR）是導(dǎo)致男性生育力下降、常規(guī)IVF失敗的重要原因。鑒于近年來(lái)生殖學(xué)者們報(bào)道的有關(guān)精子形態(tài)對(duì)于體外受精結(jié)局的重要預(yù)測(cè)價(jià)值，畸形精子癥（簡(jiǎn)稱(chēng)畸精癥）的定義一直被世衛(wèi)組織所修正，1992年參考數(shù)值為＜30%，1999年為＜14%，2010年下調(diào)至＜4%[7]。此研究中，我們將NSMR＜4%定義為畸精癥。為了能夠挽救IVF周期，學(xué)者們提出了補(bǔ)救ICSI（rescue intracytoplasmic sperm injection,R-ICSI），此方法由Nagy ZP等在1993年提出并報(bào)道,目前已被廣泛應(yīng)用并取得成功[8]。然而，關(guān)于NSMR是否會(huì)影響R-ICSI治療結(jié)局目前尚不清楚。為此，本研究旨在探討精子正常形態(tài)率對(duì)R-ICSI助孕結(jié)局的影響，評(píng)估NSMR在預(yù)測(cè)R-ICSI臨床結(jié)局中的作用。同時(shí)，回顧性分析IVF完全受精失敗或部分受精失敗下R-ICSI的治療情況，以探討臨床可行性及價(jià)值。

資料和方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2014年1月-2019年12月在廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)與遺傳中心接受R-ICSI的137對(duì)不孕夫婦，女方基礎(chǔ)性激素水平及B超檢查示卵巢功能正常。

R-ICSI適應(yīng)癥及治療：以第二極體作為早期受精的判斷標(biāo)準(zhǔn)，若授精6小時(shí)觀察所有成熟卵子中出現(xiàn)明確第二極體的比例＜30%，建議行R-ICSI。對(duì)未排出第二極體的卵母細(xì)胞，在授精后6-8小時(shí)行R-ICSI治療。

入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）女方年齡小于38歲；（2）精子來(lái)源均為丈夫且通過(guò)手淫獲??；（3）所有患者染色體核型檢查正常；（4）超排卵用藥方案為長(zhǎng)方案；（5）新鮮移植周期的胚胎均來(lái)自R-ICSI。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）男方服用影響精子質(zhì)量的藥物；（2）女方子宮腺肌癥、子宮內(nèi)膜異位癥、多囊卵巢綜合征；（3）夫婦雙方生殖器發(fā)育異常、生殖系統(tǒng)感染等。

根據(jù)常規(guī)IVF受精情況及不同精子正常形態(tài)率進(jìn)行分組：

常規(guī)IVF完全受精失敗行R-ICSI：NSMR＜4%組（n=41）和NSMR≥4%組（n=34）；

常規(guī)IVF部分受精失敗行R-ICSI：NSMR＜4%組（n=37）及NSMR≥4%組（n=25）。

二、研究方法

（一）促排卵方案

采用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（達(dá)菲林，益普生公司）/促卵泡生成素（果納芬，瑞士雪蘭諾）和（或）人絕經(jīng)期促性腺激素（HMG，珠海麗珠制藥）/人絨毛膜促性腺激素（HCG，瑞士雪蘭諾）長(zhǎng)方案促排卵。自用促性腺激素4d后開(kāi)始B超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育，當(dāng)有2個(gè)卵泡直徑＞18mm時(shí)，于當(dāng)晚21:00左右予HCG 10000IU肌肉注射，給藥36h于手術(shù)室在陰道B超引導(dǎo)下行經(jīng)陰道超聲穿刺取卵。

（二）精液采集

男性患者禁欲2～7天，采用手淫法取精液置于干燥消毒量杯內(nèi)，標(biāo)本維持20～37℃轉(zhuǎn)送至實(shí)驗(yàn)室，置于37℃恒溫箱內(nèi)液化。

（三）精子正常形態(tài)率

采用WHO推薦的Diff-Quik快速染色方法精液涂片進(jìn)行染色。精子形態(tài)評(píng)估：評(píng)估精子形態(tài)時(shí)采用嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)，只有精子頭、頸、中段和尾部均正常的精子才認(rèn)為是正常精子。染色后，至少計(jì)數(shù)200個(gè)精子，確定正常精子的形態(tài)率?！度祟?lèi)精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第5版關(guān)于精子形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)：（1）精子頭部外形上應(yīng)光滑、規(guī)則，大體上呈橢圓形；頂體界限清晰，占頭部的40%-70%，（2）中段應(yīng)細(xì)、規(guī)則，大約與頭部長(zhǎng)度相等，并且主軸與頭部長(zhǎng)軸一致，（3）主段應(yīng)是直的，均一的，比中段細(xì)，長(zhǎng)約45um?！度祟?lèi)精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第5版標(biāo)準(zhǔn)：精子正常形態(tài)率正常參考值≥4%。

（四）受精、卵裂、胚胎移植及妊娠情況

R-ICSI后第1天觀察卵子受精情況，以雙原核（2PN）卵子作為正常受精卵。受精后培養(yǎng)3天觀察胚胎狀況，根據(jù)胚胎的卵裂球數(shù)目、胚胎碎片及卵裂球大小的均一度三方面綜合評(píng)估[9]，選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植，移植胚胎數(shù)≤3個(gè)，剩余Ⅲ級(jí)以上胚胎冷凍保存，并同時(shí)予黃體支持。

（五）妊娠判定及隨訪(fǎng)

移植術(shù)后14天檢測(cè)血β-HCG水平，陽(yáng)性則確立生化妊娠，于4～6周行B超檢查，若B超見(jiàn)宮腔內(nèi)孕囊及心管搏動(dòng)則確立臨床妊娠。我科相關(guān)人員電話(huà)隨訪(fǎng)并記錄最終結(jié)局。

三、計(jì)算指標(biāo)

（一）受精率=受精卵子數(shù)/MII卵子數(shù)

（二）正常受精率=2PN卵子數(shù)/MII卵子數(shù)

（三）卵裂率=卵裂數(shù)/受精卵子數(shù)

（四）優(yōu)胚率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/2PN卵裂數(shù)

（五）種植率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)

（六）臨床妊娠率=臨床妊娠例數(shù)/移植周期例數(shù)

（七）活產(chǎn)率=活嬰分娩數(shù)/移植周期例數(shù)

（八）流產(chǎn)率=臨床流產(chǎn)例數(shù)/臨床妊娠例數(shù)

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料滿(mǎn)足正態(tài)分布，以（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；如不符合正態(tài)分布則以中位數(shù)（最小值，最大值）[M（min，max）]表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用[n（%）]進(jìn)行表示，使用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行差異比較。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、NSMR＜4%組與NSMR≥4%組一般情況比較（TFF）

兩組患者不育年限、男方年齡、女方年齡、基礎(chǔ)FSH值、基礎(chǔ)LH值、竇卵泡數(shù)、HCG日子宮內(nèi)膜厚度、獲卵數(shù)均無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 R-ICSI周期NSMR＜4%組與NSMR≥4%組一般情況比較（TFF）

二、NSMR＜4%組與NSMR≥4%組結(jié)局比較（TFF）

兩組患者行R-ICSI時(shí)受精率、正常受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、種植率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率及流產(chǎn)率均無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)表2。

三、NSMR＜4%組與NSMR≥4%組一般情況比較（PFF）

兩組患者不育年限、男方年齡、女方年齡、基礎(chǔ)FSH值、基礎(chǔ)LH值、竇卵泡數(shù)、HCG日子宮內(nèi)膜厚度、獲卵數(shù)均無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3 R-ICSI周期NSMR＜4%組與NSMR≥4%組一般情況比較（PFF）

四、NSMR＜4%組與NSMR≥4%組結(jié)局比較（PFF）

兩組患者受精率的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但是，兩組患者正常受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、種植率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率及流產(chǎn)率均無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)表4。

表4 R-ICSI周期NSMR＜4%組與NSMR≥4%組結(jié)局比較（PFF）

五、R-ICSI周期（TFF或PFF）胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局

（一）常規(guī)IVF完全受精失敗的R-ICSI周期（新鮮移植周期的胚胎來(lái)源均為R-ICSI）：共75個(gè)新鮮周期，53個(gè)新鮮移植周期，22個(gè)取消周期，共722個(gè)未受精卵，545個(gè)MII期卵子行補(bǔ)救ICSI，卵子再利用率為75.48%（545/722），70.67%（53/75）周期獲得移植。受精卵子數(shù)為449個(gè)，2PN受精卵子數(shù)為406個(gè)，卵裂數(shù)為440個(gè)，2PN卵裂數(shù)為397個(gè)，優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)為162個(gè)。受精率為82.39%（449/545），正常受精率為74.50%（406/545），卵裂率為98.00%（440/449），優(yōu)胚率為40.81%（162/397）?？偣惨浦?00枚胚胎，孕囊數(shù)32個(gè)，種植率為32.00%（32/100）。臨床妊娠24例，共22位患者分娩，29個(gè)活產(chǎn)兒（單胎15個(gè)，雙胎7個(gè)），20個(gè)足月產(chǎn)，2個(gè)早產(chǎn)，2例流產(chǎn)。

（二）常規(guī)IVF部分受精失敗的R-ICSI周期（新鮮移植周期的胚胎來(lái)源均為R-ICSI）：共62個(gè)新鮮周期，32個(gè)新鮮移植周期，30個(gè)取消周期，共709個(gè)未受精卵，549個(gè)MII期卵子行補(bǔ)救ICSI，卵子再利用率為77.43%（549/709），51.61%（32/62）周期獲得移植。受精卵子數(shù)為467個(gè)，2PN受精卵子數(shù)為389個(gè)，卵裂數(shù)為456個(gè)，2PN卵裂數(shù)為382個(gè)，優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)為166個(gè)。受精率為85.06%（467/549），正常受精率為70.86%（389/549），卵裂率為97.64%（456/467），優(yōu)胚率為43.46%（166/382）?？偣惨浦?1枚胚胎，孕囊數(shù)16個(gè)，種植率為26.23%（16/61）。臨床妊娠15例，共11位患者分娩，12個(gè)活產(chǎn)兒（單胎10個(gè)，雙胎1個(gè)），10個(gè)足月產(chǎn)，1個(gè)早產(chǎn)，2例流產(chǎn)，2例異位妊娠。

討 論

發(fā)生IVF受精失敗，會(huì)帶來(lái)沮喪感及繁重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。受精是一個(gè)復(fù)雜的進(jìn)程，據(jù)報(bào)道，在常規(guī)IVF周期中，約3%-5%有受精失敗的風(fēng)險(xiǎn)[10]。據(jù)研究報(bào)道[11]，發(fā)生受精失敗的其中一個(gè)原因是由于精子未能與透明帶成功結(jié)合或未能穿越透明帶。R-ICSI可以通過(guò)機(jī)械穿透卵細(xì)胞膜而繞過(guò)生物學(xué)障礙，增加患者受孕機(jī)會(huì)，故在未取消該周期的情況下實(shí)施R-ICSI是一種值得嘗試的方法。另一種方案是取消當(dāng)前IVF周期。相關(guān)研究表明[12，13]，與取消周期的方法相比，早R-ICSI是值得應(yīng)用的補(bǔ)救方案，可獲得不錯(cuò)的臨床妊娠結(jié)局。

高質(zhì)量胚胎的產(chǎn)生需要高質(zhì)量的配子，精子形態(tài)一直是生殖醫(yī)師評(píng)估男性生育力的重要實(shí)驗(yàn)室參數(shù)，對(duì)成功受精具有重要影響。各種負(fù)面環(huán)境因素或內(nèi)在因素都可能會(huì)影響精子形態(tài)，造成頭部、中段或尾部缺陷。學(xué)者們已對(duì)精子形態(tài)與IVF/ICSI結(jié)局的關(guān)系進(jìn)行了大量的研究。史軼超等[14]研究發(fā)現(xiàn)精子形態(tài)完整性與IVF受精率、正常受精率、可移植胚胎率有關(guān)，但與活產(chǎn)率、流產(chǎn)率關(guān)系仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。另一項(xiàng)研究[15]也提到，IVF受精率可因精子頭部畸形而下降。當(dāng)NSMR≤4%時(shí)，IVF總體受精率降低，當(dāng)NSMR≤3%時(shí)，IVF正常受精率下降。Li B等[7]則探討了不同精子形態(tài)在體外受精選擇方式上的作用，發(fā)現(xiàn)NSMR與胚胎發(fā)育潛能呈顯著正相關(guān)，認(rèn)為當(dāng)NSMR＜4%時(shí)，應(yīng)首選ICSI進(jìn)行輔助生殖助孕，而當(dāng)NSMR≥4%，常規(guī)IVF助孕方案應(yīng)優(yōu)先選擇。Zahiri Z等[16]學(xué)者研究指出，在ICSI周期中，不同的精子形態(tài)（如大、小和無(wú)頂體）影響染色質(zhì)的完整性及其凝聚，并降低精子的生育潛能及妊娠率。而一項(xiàng)關(guān)于2202個(gè)IVF周期和2574個(gè)ICSI周期的研究指出，在IVF/ICSI周期中，畸形精子癥對(duì)妊娠結(jié)局的影響是有限的，此外，IVF/ICSI出生缺陷風(fēng)險(xiǎn)沒(méi)有增加[17]。

然而，目前關(guān)于精子正常形態(tài)率對(duì)R-ICSI治療結(jié)局影響的研究，國(guó)內(nèi)外鮮有文獻(xiàn)報(bào)道，且納入及排除標(biāo)準(zhǔn)不一。為此，本研究根據(jù)IVF受精失敗情況分為RICSI（TFF）及R-ICSI（PFF），再分別比較NSMR＜4%和NSMR≥4%的胚胎發(fā)育情況及臨床結(jié)局。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在R-ICSI（TFF）中，NSMR＜4%組與NSMR≥4%組的基本資料、胚胎發(fā)育情況及臨床結(jié)局均無(wú)顯著性差異。這與Li M等[18]學(xué)者研究報(bào)道一致，畸精癥對(duì)R-ICSI患者的臨床結(jié)局沒(méi)有影響。分析原因可能為：受精過(guò)程涉及到一系列蛋白反應(yīng)和蛋白相互作用，精卵異常及二者之間相互作用蛋白的缺失或功能異常，均可導(dǎo)致受精失敗[19]。Anifandis G等[20]學(xué)者研究報(bào)道，與ICSI受精失敗相關(guān)的一個(gè)已知因素是卵母細(xì)胞激活缺陷，而精子磷脂酶Cζ亞型（phospholipase Cζ，PLCζ）蛋白缺失使它不足以產(chǎn)生鈣離子振蕩以激活卵母細(xì)胞。受精失敗的發(fā)生，還可能與精子、卵子自身功能缺陷有關(guān)，如精卵膜識(shí)別障礙、精卵膜融合缺陷、卵母細(xì)胞核成熟度及卵母細(xì)胞質(zhì)缺陷等[21，22]。以上因素就有可能使原核形成失敗，從而導(dǎo)致受精失敗，與精子形態(tài)無(wú)顯著關(guān)系。另外，也可能是由于樣本量不足或受其他因素影響，如精子DNA損傷、卵子質(zhì)量、活性氧水平及不良生活習(xí)慣等。

在R-ICSI（PFF）研究中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NSMR≥4%組受精率大于NSMR＜4%組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（89.77%vs 82.04%）。這可能是因?yàn)榫有螒B(tài)正常時(shí)，頂體更完整，精子整體質(zhì)量更好，受精過(guò)程更容易發(fā)生，受精率提高[23]。有研究[24]指出精子頂體反應(yīng)是膜融合、水解酶以及基質(zhì)蛋白釋放的生理分泌過(guò)程，使精子能夠穿透卵子透明帶。頂體內(nèi)含透明質(zhì)酸酶、頂體蛋白酶等與受精發(fā)生相關(guān)的水解酶，對(duì)精子穿透能力及受精能力有著關(guān)鍵影響作用。肖鑫等[25]探討精液質(zhì)量對(duì)IVF與R-ICSI兩種輔助生殖方式的影響，指出當(dāng)精子正常形態(tài)率＜1.4%，并結(jié)合DNA斷裂率、頂體完整性及頂體反應(yīng)率等指標(biāo)時(shí)可優(yōu)先選擇行R-ICSI助孕，相較于IVF具有更好的臨床結(jié)局。何泳志等[26]研究指出精子頂體完整率高更有益于R-ICSI妊娠結(jié)局。頂體是精子的重要組成部分，存在異常形態(tài)結(jié)構(gòu)時(shí)，易致頂體反應(yīng)發(fā)生障礙而使男性不育，影響精卵相互作用[27]。同時(shí)，雖然R-ICSI可人為挑選相對(duì)正常形態(tài)的精子進(jìn)行治療，但仍會(huì)不可避免的受到畸形精子的影響，這種“畸形”不僅存在于精子形態(tài)上，更體現(xiàn)在人為不能及時(shí)評(píng)估的“畸形”上，如內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)的損傷、染色體微缺失等，而正是由于精子形態(tài)的正常性，使遺傳物質(zhì)及頂體的完整性得以有效保障，降低精卵識(shí)別失敗率，從而改善了助孕結(jié)局。

常規(guī)IVF受精失敗后行R-ICSI治療，在生殖臨床中已被廣泛應(yīng)用。它不僅給患者再次受精的希望，而且妊娠結(jié)局情況更可為生殖醫(yī)師給患者制定下一周期的診療方案提供建設(shè)性意見(jiàn)。為探討R-ICSI臨床應(yīng)用價(jià)值，本研究對(duì)IVF完全受精失敗或部分受精失敗兩種情況進(jìn)行分類(lèi)統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)在兩種情況下，R-ICSI均可獲得不錯(cuò)的妊娠結(jié)局，避免IVF周期取消。這與既往學(xué)者研究所得結(jié)論相一致。如鄭娟等[28]學(xué)者、Huang B等[29]學(xué)者均指出R-ICSI在IVF完全受精失敗中具有巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值，是一種安全的補(bǔ)救方法，臨床結(jié)局與常規(guī)ICSI無(wú)明顯差異。Cao S等[30]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)IVF受精率小于25%時(shí)行R-ICSI更值得推薦。Xiong F等[31]分析比較早期R-ICSI與常規(guī)ICSI妊娠結(jié)局和新生兒結(jié)局，發(fā)現(xiàn)并無(wú)顯著差別，R-ICSI提供了一種安全有效的替代方案。羅平等[32]學(xué)者對(duì)IVF完全不受精或低受精行早期R-ICSI進(jìn)行研究，指出補(bǔ)救ICSI在兩種情況下，均值得臨床應(yīng)用推薦，是一種較好的補(bǔ)救措施。而本研究在數(shù)據(jù)更充足的前提下，詳細(xì)對(duì)比分析了多種臨床結(jié)局指標(biāo)，在既往研究的基礎(chǔ)上更明確了無(wú)論在何種情況下（TFF/PFF），補(bǔ)救ICSI均值得推薦使用，可避免無(wú)胚胎可移。綜上，筆者認(rèn)為精子正常形態(tài)率是評(píng)估男性生育力不可忽視的重要因素，可在一定程度上影響早期胚胎發(fā)育，R-ICSI是解決IVF受精失敗的良策，可優(yōu)先選擇ICSI作為補(bǔ)救方案。