寇美玲，謝佳芮，苗海生

（云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650224）

阿卡斑病毒（Akabane virus，AKAV）屬于布尼亞病毒科（Bunyaviridae）正布尼亞病毒屬（Orthobunyavirus）辛波（Simbu）血清群，是一種通過(guò)庫(kù)蠓、蚊蟲等節(jié)肢動(dòng)物傳播的蟲媒病原，最易感染妊娠期的牛和羊，也可感染馬、豬和駱駝[1-5]，廣泛流行于亞洲、大洋洲和非洲的熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)[6]，可導(dǎo)致妊娠母畜流產(chǎn)、早產(chǎn)，產(chǎn)死胎，并可通過(guò)胎盤垂直傳播，侵害胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致新生牛羊出現(xiàn)積水性無(wú)腦癥和先天性關(guān)節(jié)彎曲等癥狀，對(duì)牛羊養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展構(gòu)成較大威脅。1959 年AKAV 首次在日本群馬縣赤羽村被發(fā)現(xiàn)，隨后在澳大利亞、韓國(guó)、南非和以色列等國(guó)家被相繼報(bào)道發(fā)現(xiàn)[4-5，7-8]。近年來(lái)，我國(guó)云南、廣西、廣東、貴州、四川等?。ㄗ灾螀^(qū)）也有AKAV 相關(guān)血清學(xué)調(diào)查、病毒核酸檢測(cè)的報(bào)道，提示這些地區(qū)的家畜中可能有AKAV 流行[9-12]。

云南省位于我國(guó)西南部，有多個(gè)縣市與老撾、緬甸、越南等國(guó)家接壤且缺乏自然屏障，接壤縣市之間貿(mào)易往來(lái)頻繁，每年有大量家畜通過(guò)邊境縣市進(jìn)入我國(guó)境內(nèi)，且邊境縣市大多屬于熱帶、亞熱帶氣候，溫差小，雨量充沛，適宜媒介昆蟲的生長(zhǎng)繁殖，更有利于AKAV 傳播，因此防控邊境地區(qū)AKAV感染對(duì)于保障云南省家畜養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。為了解云南省邊境地區(qū)牛群的AKAV 感染情況，本研究采用C-ELISA 方法對(duì)采自云南省邊境縣市的牛血清樣品進(jìn)行AKAV 抗體檢測(cè)，并對(duì)不同來(lái)源、不同年份、不同品種、不同地區(qū)、不同飼養(yǎng)方式牛群的抗體陽(yáng)性率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，初步評(píng)估云南省邊境地區(qū)牛群AKAV 流行風(fēng)險(xiǎn)，以期為云南省邊境地區(qū)AKAV 感染相關(guān)防控政策的研究與制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

2019—2020 年，每年的1—9 月從云南省邊境地區(qū)10 個(gè)縣市（芒市、瑞麗、景洪、勐海、勐臘、富寧、孟連、西盟、江城、滄源）197 個(gè)場(chǎng)點(diǎn)采集牛血清樣品4 437 份，其中入境牛2 644 份、本地牛610份，其余1 183份背景信息不詳。在每個(gè)縣市，按照采樣點(diǎn)所屬地理位置劃定區(qū)域，將區(qū)域內(nèi)養(yǎng)殖場(chǎng)、活畜交易市場(chǎng)和散養(yǎng)戶編號(hào)，根據(jù)所在區(qū)域?qū)嶋H情況，按比例隨機(jī)抽取養(yǎng)殖場(chǎng)1～4 個(gè)、活畜交易市場(chǎng)1～2 個(gè)、散養(yǎng)戶1～20 個(gè)；場(chǎng)戶內(nèi)根據(jù)存欄量，以頸靜脈采血方式，按比例隨機(jī)采集牛血清樣品。采樣地點(diǎn)選擇雨量多、日照長(zhǎng)、濕度大，適于媒介昆蟲生長(zhǎng)和繁殖的熱帶、亞熱帶地區(qū)。具體采樣信息見(jiàn)表1。

表1 2019—2020 年云南省邊境地區(qū)10 個(gè)縣市采樣場(chǎng)戶數(shù)

1.2 主要試劑

AKAV C-ELISA 檢測(cè)試劑盒[13]、PBSTM（磷酸鹽緩沖液+Tween 20+脫脂奶粉），為云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備；脫脂奶粉，購(gòu)自BD difco 公司；PBS 干粉、Tween 20，均購(gòu)自云南豐科生物科技有限公司。

1.3 血清抗體檢測(cè)

利用云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研制的AKAV C-ELISA 檢測(cè)試劑盒，對(duì)樣品進(jìn)行血清抗體檢測(cè)。取出試劑盒提供的ELISA 板，各加入12 μL 待檢血清以及陰陽(yáng)性對(duì)照血清到相應(yīng)檢測(cè)孔和對(duì)照孔，每孔加入50 μL 1/100 稀釋的豚鼠競(jìng)爭(zhēng)抗體，震蕩混勻，37 ℃溫育1 h；PBST 洗板3 次，吸水紙上拍干；每孔加入50 μL 1/1 000 稀釋的兔抗豚鼠HPR，37 ℃溫育30 min；洗板5～6次拍干，加入TMB 顯色液50 μL/孔，37 ℃避光溫育10 min；加入終止液50 μL/孔，用ELISA 讀板儀450 nm 波長(zhǎng)測(cè)定樣本和對(duì)照的吸光值A(chǔ)450。試劑盒質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔A450≥0.8，兩個(gè)陰性對(duì)照孔A450≤0.3。判定標(biāo)準(zhǔn)：按照抑制率（PI）=（1-樣品血清A450/陰性對(duì)照A450平均值）×100%；抑制率≥40% 時(shí)判為陽(yáng)性，＜40%時(shí)判為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

將各地檢測(cè)的AKAV 抗體陽(yáng)性率，采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 地區(qū)分布

地區(qū)統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表2）顯示：在邊境地區(qū)10 個(gè)縣市采集的4 437 份牛血清樣品中，共檢出1 367 份抗體陽(yáng)性血清樣品，平均抗體陽(yáng)性率為30.81%；10 個(gè)縣市均檢測(cè)到抗體陽(yáng)性樣品，其中勐臘、滄源、富寧、江城、景洪等縣市抗體陽(yáng)性率較高，每年的抗體陽(yáng)性率和場(chǎng)戶陽(yáng)性率均在30%以上，而瑞麗、西盟較低，均在25%以下，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明，云南省邊境地區(qū)存在一定范圍的牛AKAV 感染，且地區(qū)間存在一定差異。

2.2 時(shí)間分布

2019 年平均抗體陽(yáng)性率為27.88%，2020 年為32.14%，呈現(xiàn)增高趨勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05），每個(gè)地區(qū)的抗體陽(yáng)性率均呈現(xiàn)增高趨勢(shì)（表2），但除富寧縣2019、2020 年抗體陽(yáng)性率差異顯著（P＜0.05）外，其余縣市差異均不顯著（P＞0.05）。2019 年平均場(chǎng)戶陽(yáng)性率為38.81%，2020年為36.92%，呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05），大多數(shù)縣市的場(chǎng)戶陽(yáng)性率也表現(xiàn)降低趨勢(shì)。

2.3 群間分布

2.3.1 不同來(lái)源 不同來(lái)源樣品統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表3）顯示：每年的入境?？贵w陽(yáng)性率均顯著高于本地牛（P＜0.05），且入境牛、本地牛以及來(lái)源不詳牛的抗體陽(yáng)性率均呈增加趨勢(shì)。

表3 不同來(lái)源牛AKAV 血清抗體檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.3.2 不同場(chǎng)戶 不同場(chǎng)點(diǎn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表4）顯示：每年的養(yǎng)殖場(chǎng)抗體陽(yáng)性率均高于散養(yǎng)戶和交易市場(chǎng)，但差異不顯著（P＞0.05）；每年均從3 個(gè)活畜交易市場(chǎng)中檢出陽(yáng)性樣品，場(chǎng)戶陽(yáng)性率均為100%，與養(yǎng)殖場(chǎng)和散養(yǎng)戶差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 不同場(chǎng)點(diǎn)AKAV 血清抗體檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.3.3 不同飼養(yǎng)方式 不同飼養(yǎng)方式的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表5）顯示：舍飼牛群的AKAV 抗體陽(yáng)性率最高，系牧飼養(yǎng)次之，半放牧半舍飼最低；舍飼與其他飼養(yǎng)方式相比，抗體陽(yáng)性率差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表5 不同飼養(yǎng)方式牛群的AKAV 抗體檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.3.4 不同品種 不同品種的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表6）顯示：不同品種牛均可感染AKAV，2019、2020 年黃?？贵w陽(yáng)性率分別為30.03%，34.03%，水牛分別為10.89%、17.20%，黃牛顯著高于水牛（P＜0.05）。

表6 不同品種牛的AKAV 抗體檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3 討論

AKAV 是一種通過(guò)媒介昆蟲傳播的病毒，主要造成反芻動(dòng)物繁殖障礙和先天性畸形。1998 年李其平等[14]從上海市采集蚊、蠓等標(biāo)本，首次分離到AKAV；2007 年Wang 等[15]對(duì)我國(guó)24 個(gè)?。ㄖ陛犑校?006—2015 年的血清樣品進(jìn)行AKAV中和試驗(yàn)，結(jié)果在23 個(gè)?。ㄖ陛犑校z測(cè)到抗體，牛陽(yáng)性率為21.3%，羊?yàn)?2.0%，說(shuō)明我國(guó)牛羊中存在一定的AKAV 感染。我國(guó)近年來(lái)仍不斷有分離到AKAV 的報(bào)道[9-11]。到目前為止，針對(duì)AKAV感染沒(méi)有有效治療方法，因此開(kāi)展AKAV 血清學(xué)調(diào)查對(duì)其流行的控制極為重要。

本研究所選的10 個(gè)縣市與老撾、越南、緬甸接壤，均處于亞熱帶、熱帶地區(qū)，平均氣溫高，降雨多，適宜蚊、蠓等媒介昆蟲生長(zhǎng)繁殖，利于AKAV 傳播，具有地域代表性。由于國(guó)內(nèi)牛、羊等易感動(dòng)物目前均未接種AKAV 疫苗，田間動(dòng)物沒(méi)有疫苗接種干擾，因此血清學(xué)方法對(duì)于AKAV 感染的流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。對(duì)比常用的血清學(xué)方法，中和試驗(yàn)重復(fù)性誤差大，血凝抑制、瓊脂擴(kuò)散和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)敏感性低[16-17]，而ELISA 方法檢測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確。本研究對(duì)云南省邊境地區(qū)10 個(gè)縣市牛群進(jìn)行AKAV 血清學(xué)調(diào)查，初步摸清了這些地區(qū)的AKAV 流行本底，揭示了云南省邊境地區(qū)牛群存在不同程度的AKAV 感染。10 個(gè)邊境縣市的AKAV 抗體陽(yáng)性率存在一定差異，也可能與采集血清樣品的時(shí)間、樣本數(shù)量及場(chǎng)戶等差異有關(guān)。對(duì)本地和入境牛的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，入境牛AKAV 抗體陽(yáng)性率明顯高于本地牛，提示與其接壤國(guó)家的邊境地區(qū)AKAV 流行可能較為嚴(yán)重，對(duì)我國(guó)本地牛群威脅較大。因此，應(yīng)加強(qiáng)海關(guān)檢疫，在鄰近地帶，定期進(jìn)行防蟲、殺蟲，切斷AKAV 傳播途徑。

養(yǎng)殖場(chǎng)的抗體陽(yáng)性率高于散養(yǎng)戶和交易市場(chǎng)，這可能與大部分養(yǎng)殖場(chǎng)采取舍飼的飼養(yǎng)方式有關(guān)?；钚蠼灰资袌?chǎng)兩年內(nèi)均檢測(cè)到抗體陽(yáng)性，場(chǎng)戶陽(yáng)性率達(dá)到100%，病毒擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)較高，因此應(yīng)加強(qiáng)流通監(jiān)管。舍飼牛群抗體陽(yáng)性率明顯高于半放牧半舍飼和系牧飼養(yǎng)方式牛群，其原因可能是密集型飼養(yǎng)更易于牛群間相互感染，且舍飼下牛群運(yùn)動(dòng)相對(duì)較少，對(duì)病毒的抵抗力較弱。黃牛和水牛均可感染AKAV，但黃牛的抗體陽(yáng)性率明顯高于水牛，但由于水牛樣品采集數(shù)量相對(duì)較少，牛品種與AKAV感染之間的關(guān)聯(lián)性需要進(jìn)一步加大樣本量來(lái)驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn)，AKAV 感染有加重的趨勢(shì)，需要加強(qiáng)監(jiān)測(cè)和控制。

本研究對(duì)云南省邊境地區(qū)進(jìn)行了牛AKAV 血清學(xué)調(diào)查，初步探究了邊境地區(qū)牛群AKAV 感染的分布情況及其特點(diǎn)，為今后本病防控提供了重要的流行病學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

對(duì)云南省10 個(gè)邊境地區(qū)進(jìn)行牛AKAV 血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，云南省邊境地區(qū)存在一定的AKAV 感染且有加重趨勢(shì)，入境牛感染顯著高于本地牛。提示相關(guān)部門需重視對(duì)邊境地區(qū)AKAV流行的控制，持續(xù)開(kāi)展血清學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)，加強(qiáng)境外牛群入境檢疫，降低AKAV 從邊境地區(qū)向內(nèi)地?cái)U(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。