路 暢，劉麗婭，馬曉菁，葉 鋒，谷文喜，努爾巴哈提·努爾旦，易新萍

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊 830011）

萊姆?。↙yme disease）是由伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi）感染引起的一種自然疫源性傳染病，也是以蜱為傳播媒介，野生動(dòng)物及家畜動(dòng)物為保菌宿主的人獸共患病[1]，主要經(jīng)蜱叮咬傳播，可導(dǎo)致人體多系統(tǒng)和器官的損害，嚴(yán)重者終生致殘甚至死亡[2-3]。該病于1992 年被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為重點(diǎn)防治的研究對(duì)象[4]。伯氏疏螺旋體在自然界的存活依賴于其在媒介與宿主動(dòng)物間的相互傳播，主要通過硬蜱屬中某些蜱的吸血活動(dòng)在動(dòng)物宿主間以及動(dòng)物宿主和人之間傳播[5]。

伯氏疏螺旋體宿主多、范圍廣，涉及大、中、小型野生哺乳動(dòng)物以及鳥類、爬行動(dòng)物、家畜及蜱類，其中作為貯存宿主的嚙齒類動(dòng)物就有10 余種[6]。嚙齒類動(dòng)物分布廣、數(shù)量多，是伯氏疏螺旋體的主要傳染源，也是伯氏疏螺旋體的重要宿主[7]。為了解新疆地區(qū)鼠類萊姆病流行情況，認(rèn)識(shí)萊姆病病原體傳播媒介及其與動(dòng)物儲(chǔ)存宿主間的關(guān)聯(lián)性，本研究對(duì)新疆北疆部分地區(qū)鼠類中的伯氏疏螺旋體攜帶情況及其基因型進(jìn)行調(diào)查，以期為預(yù)測(cè)新疆地區(qū)人萊姆病的潛在流行風(fēng)險(xiǎn)及其防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2021 年1—9 月在新疆昌吉州吉木薩爾縣、伊犁哈薩克自治州新源縣、塔城地區(qū)烏蘇市巴音溝，采用布籠法采集147 只野生鼠類，在實(shí)驗(yàn)室取其腎臟和膀胱組織樣，凍存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA 模板制備

將采集的野鼠用75%乙醇浸泡10 min，無菌操作收集腎臟和膀胱，取黃豆大小的組織，置于含300 μL 生理鹽水的2 mL 離心管中；加入2 顆鋼珠，組織研磨4 000 次/min，震蕩20 s 勻漿；沸水浴8 min，12 000 r/min 離心1 min；取上清用作PCR 反應(yīng)模板，-20 ℃保存?zhèn)溆?。?biāo)準(zhǔn)伯氏疏螺旋體B31 株（ATCC 35210）基因組DNA，使用常規(guī)DNA 試劑盒提取。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

依據(jù)文獻(xiàn)[8] 中的伯氏疏螺旋體16S rRNA 基 因（GenBank N0.NC.018747.1）序列設(shè)計(jì)引物及探針（上游引物：5'-ACCCTTTACGCCCAATAATCCC-3'；下游引物：5'-AGGAAATGACAAAGTGATGACG-3'；探 針：5'-FAM-AACAACGCTCGCCC-3'-MGB），委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

Real-time PCR 反應(yīng)體系總體積20.0 μL：2×Super Real PreMix 10.0 μL，上游和下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，F(xiàn)AM-MGB 探針（10 μmol/L）0.4 μL，DNA 模板2.0 μL，ddH2O補(bǔ)至20.0 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 15 min；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，共45 個(gè)循環(huán)。結(jié)果判定：在陽性對(duì)照和陰性對(duì)照均成立的前提下，曲線光滑，有明顯指數(shù)擴(kuò)增期，且Ct ≤40 的樣本判為陽性。

1.4 巢式PCR 擴(kuò)增

以文獻(xiàn)[9]中的伯氏疏螺旋體5S—23S rRNA間隔區(qū)序列為參照，設(shè)計(jì)巢式PCR 引物（表1）。

表1 巢式PCR 引物序列

每輪反應(yīng)體系：2×UTaqPCR Mix 7.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，DNA 模板1.0 μL，補(bǔ)水至15.0 μL。第1 輪程序：94 ℃10 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，16 ℃終止反應(yīng)。第2 輪程序：94 ℃ 10 min；94 ℃ 45 s，62 ℃ 45 s，72 ℃1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，16 ℃終止反應(yīng)。

1.5 測(cè)序及序列分析

將基于伯氏疏螺旋體5S—23S 間隔序列的巢式PCR 陽性產(chǎn)物回收純化后送至生物公司測(cè)序，將獲得的序列信息通過NCBI 網(wǎng)上BLAST 工具與GenBank 中注冊(cè)的基因序列進(jìn)行比對(duì)，確定伯氏疏螺旋體基因型。

1.6 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

應(yīng)用MEGA7 軟件構(gòu)建伯氏疏螺旋體5S—23S間隔序列片段的系統(tǒng)發(fā)育樹，分析其進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)

應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法，對(duì)鼠類腎臟和膀胱組織DNA 樣本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果（圖1）顯示：空白對(duì)照（H2O）樣本無擴(kuò)增曲線，伯氏疏螺旋體標(biāo)準(zhǔn)株B31 出現(xiàn)了擴(kuò)增曲線，Ct 為28.91；147 份鼠類腎臟和膀胱組織DNA 樣本中，檢出11 份伯氏疏螺旋體陽性樣本，陽性率為7.48%（11/147）。

2.2 巢式PCR 檢測(cè)

應(yīng)用巢式PCR 檢測(cè)147 份鼠類腎臟和膀胱組織DNA 樣本，以伯氏疏螺旋體標(biāo)準(zhǔn)株B31 基因組DNA（陽性對(duì)照）為參照。結(jié)果（表2、圖2）顯示：有13 份樣品擴(kuò)增出225 bp 大小的目的片段，說明新疆這3 個(gè)地區(qū)的鼠類中均存在伯氏疏螺旋體攜帶狀況，陽性率為8.84%（13/147）。

表2 鼠類攜帶伯氏疏螺旋體檢測(cè)結(jié)果

2.3 基因分型鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

對(duì)13 份巢式PCR 陽性產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)得的序列在NCBI 上進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析。結(jié)果顯示：有6 份樣品未測(cè)出有效序列，其中3 份為假陽性，3 份出現(xiàn)重疊峰，可能存在多種基因型混合感染；7 份樣本獲得有效產(chǎn)物序列（YL1、JMSE1、WS1—WS5），分屬于3 種伯氏疏螺旋體基因型，其中編號(hào)YL1（伊犁）、JMSE1（吉木薩爾）、WS2（烏蘇）3 份樣本為Borreliella garinii基因型，WS1（烏蘇）為Borreliella bavariensis基因型，WS3—WS5（烏蘇）不能明確基因型。

將7 份樣本序列采用NJ 算法（Bootstrap 為1 000）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從構(gòu)建的伯氏疏螺旋體系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）可以看出，新疆地區(qū)鼠類攜帶的伯氏疏螺旋體主要分屬于2 個(gè)大分支，其中4 株伯氏疏螺旋體（YL1、JMSE1、WS1、WS2）聚集在其中一個(gè)大分支上，包含B.garinii基因型和B.bavariensis基因型，其余3 株（WS3—WS5）聚集于另一個(gè)大分支，與B.garinii基因型進(jìn)化關(guān)系接近。

3 討論

近年來，萊姆病在國內(nèi)的發(fā)病區(qū)域和發(fā)病率分別呈迅速擴(kuò)大和上升趨勢(shì)，對(duì)國民健康有著較大影響[10]。新疆地處歐亞大陸腹地，四周高山環(huán)繞，地域遼闊，地理地貌和氣候環(huán)境復(fù)雜多樣，因而孕育了多樣的植被類型和野生動(dòng)物群，同時(shí)也為自然疫源地的形成和發(fā)展提供了有利條件。新疆地區(qū)的萊姆病病原學(xué)和人畜血清流行病學(xué)調(diào)查研究證實(shí)了新疆多個(gè)地區(qū)為萊姆病自然疫源地[11-13]。

本調(diào)查于2021 年1—9 月在新疆3 個(gè)地區(qū)（昌吉州吉木薩爾縣、伊犁哈薩克自治州新源縣、烏蘇市巴音溝）采集鼠類147 只，分別用巢式PCR 和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 兩種方法檢測(cè)鼠類攜帶伯氏疏螺旋體陽性率。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法檢出的新疆地區(qū)鼠類伯氏疏螺旋體陽性率為7.48%（11/147），巢式PCR 方法為8.84%（13/147）。兩種方法檢測(cè)的鼠類伯氏疏螺旋體陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.369，P＞0.05）。兩種方法所用的基因不同，因此同時(shí)采用兩種方法可以提高伯氏疏螺旋體檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、全面性，若要進(jìn)行基因分型鑒定，則以巢式PCR 方法檢測(cè)結(jié)果為準(zhǔn)。

研究[14]表明，目前世界范圍內(nèi)的伯氏疏螺旋體至少有20 種基因型，其中5 種基因型具有致病性。我國常見的有B.garinii、B.afzelii、B.burgdorferi sensu stricto3 種致病基因型[15]。我國北方以B.garinii基因型為主[16]，南方以B.burgdorferi sensu stricto基因型為主[17]。本調(diào)查發(fā)現(xiàn)，鼠類攜帶的伯氏疏螺旋體B.garinii基因型占42.9%，B.bavariensis基因型占14.3%。而B.bavariensis基因型為B.garinii基因型的亞種，在歐洲和亞洲廣泛存在，主要以嚙齒類動(dòng)物為儲(chǔ)存宿主[18]，目前國內(nèi)還未見該基因型的相關(guān)報(bào)道。B.garinii基因型主要與神經(jīng)系統(tǒng)癥狀有關(guān)，可引起人類精神異常，對(duì)人群危害嚴(yán)重[19]。

將7 條伯氏疏螺旋體與GenBank 中已公開發(fā)表的7 條不同基因型序列，應(yīng)用MEGA7 軟件構(gòu)建伯氏疏螺旋體5S—23S 間隔序列片段系統(tǒng)發(fā)育樹。從該系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，新疆地區(qū)鼠類攜帶的伯氏疏螺旋體主要分屬于2 個(gè)大分支，其中4條序列聚集在一個(gè)大分支上，包含B.garinii基因型和B.bavariensis基因型，與來自西伯利亞B.bavariensis和我國臺(tái)灣B.garinii基因型進(jìn)化關(guān)系接近；其余3 條聚集于B.burgdorferi另一個(gè)大分支上，與我國東北B.garinii mgds分離株遺傳進(jìn)化關(guān)系接近，但也有差別。這提示新疆地區(qū)伯氏疏螺旋體具有豐富的遺傳多樣性。聚集在B.garinii mgds這一分支上的B.burgdorferi基因型是否為我國或新疆特有的獨(dú)立基因型還有待進(jìn)一步分析。