高星熠，丁召亮，顏 恒，張 偉，朱曼玲

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100；3.山東東阿黑毛驢牧業(yè)科技有限公司，山東東阿 252200；4.章丘區(qū)相公街道畜牧獸醫(yī)站，山東濟(jì)南 250203；5.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽生物組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100）

近年來，隨著驢的勞動(dòng)功能向肉、皮、奶轉(zhuǎn)移，我國的驢養(yǎng)殖數(shù)量也不斷增加，現(xiàn)代大規(guī)模、集約化驢養(yǎng)殖場越來越多。但在一些地區(qū)，驢和牛、羊一起飼養(yǎng)，且飼養(yǎng)家畜頻繁異地采購，跨區(qū)域運(yùn)輸，大大增加了疾病暴發(fā)和流行風(fēng)險(xiǎn)。目前，驢疫病的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究薄弱，驢疫病病原體變異和傳播的風(fēng)險(xiǎn)評估體系尚未建立，驢疫病綜合防控服務(wù)體系不健全。對驢的呼吸系統(tǒng)疾病、感染性腹瀉和流產(chǎn)的綜合防治研究滯后，迫切需要一套完善的健康養(yǎng)殖保健技術(shù)規(guī)范，為驢養(yǎng)殖的產(chǎn)業(yè)化和可持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)支持。目前國內(nèi)尚未大規(guī)模開展規(guī)?；H場疫病種類及其流行情況的流行病學(xué)調(diào)查，缺乏驢疫病流行病學(xué)數(shù)據(jù)，這對制定馬屬動(dòng)物疫病防控策略造成了障礙。

近年來，山東省建立了200 多個(gè)規(guī)?；B(yǎng)驢場和扶貧驢場。在驢養(yǎng)殖密度越來越高、流動(dòng)更為頻繁的背景下，一旦發(fā)生疫病，將會(huì)給養(yǎng)驢產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。為了解山東省驢群中流行的主要病原，2019—2021 年在山東省驢養(yǎng)殖密集區(qū)的9個(gè)規(guī)?；H場，對引發(fā)腹瀉、肺炎和流產(chǎn)的主要病原[1]感染情況進(jìn)行了調(diào)查，以期豐富山東省驢疫病的流行病學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

1.1.1 樣品采集 2019—2021 年，從聊城、德州、濱州等地的9個(gè)規(guī)?；H場（繁殖母驢100頭以上），無菌采集表現(xiàn)不同癥狀病死驢（駒）的心、肝、脾、肺、腸、腎等臟器病料共計(jì)742 份（表1）；隨機(jī)采集臨床健康驢血液樣品296 份，頸靜脈無菌采血，每頭驢采血量不少于 3 mL，裝入滅菌瓶中，帶回實(shí)驗(yàn)室分離血清。

表1 不同臨床癥狀的病料組織樣品采集情況 單位：份

1.1.2 主要試劑耗材 PBS 緩沖液、2×TaqPCR Master Mix、ddH2O、DL-2 000 DNA Marker，均購自北京天根生化科技有限公司；EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit 柱 式DNA/RNA 共提取試劑盒、M-MLV（H-）Reverse Transcriptase 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；虎紅試劑以及布魯氏菌陰陽性對照血清，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 檢測方法

1.2.1 樣品處理 臟器病料組織勻漿：稱取0.2～0.5 g 病料組織塊，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗后，放入離心管中，用小剪子剪碎；加入組織研磨專用鋼珠和預(yù)冷的生理鹽水，用高通量組織研磨器10 000～15 000 r/min 研磨制成10%組織勻漿，-80 ℃保存，用于提取樣品的RNA 和 DNA。腹瀉癥狀樣品檢測大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和輪狀病毒，肺炎癥狀樣品檢測大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、馬鏈球菌、金黃色葡萄球菌、馬流感病毒和馬皰疹病毒，流產(chǎn)癥狀樣品檢測大腸桿菌、沙門氏菌、馬皰疹病毒和馬動(dòng)脈炎病毒。血清制備：將非抗凝血液，室溫或37 ℃環(huán)境下傾斜放置，待血液凝固后，3 000 r/min 離心 5～10 min，上清液即為血清，小心將上清吸出，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品DNA 提取 按照EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit 試劑盒說明書，進(jìn)行病料組織勻漿的DNA 提取。

1.2.3 樣品PCR 檢測 以提取的樣品DNA 為模板，以大腸桿菌、沙門氏菌、馬鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌的特異性引物（表2）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系（25.0 μL）：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.0 μL，上下游引物各（10 mmol/L）1.0 μL，模板1.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性40 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

表2 細(xì)菌鑒定引物信息

1.2.4 樣品RNA 提取 按照FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit 柱式DNA/RNA 共提取試劑盒說明書，進(jìn)行病料組織勻漿的DNA/RNA 共提取。

1.2.5 RT-PCR 檢測 按照M-MLV（H-）Reverse Transcriptase 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，對馬皰疹病毒、馬流感病毒和馬動(dòng)脈炎病毒和輪狀病毒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。引物序列見表3[2-5]。

表3 病毒鑒定引物信息

1.2.6 血清樣品檢測 按照虎紅平板凝集試驗(yàn)說明書，對樣品血清進(jìn)行虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT），檢測布魯氏菌感染抗體。在陰、陽性對照血清成立時(shí)，方可進(jìn)行樣品血清的結(jié)果判定。血清在5 min內(nèi)出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，判定為陽性（+），無凝集現(xiàn)象，呈均勻一致粉紅色，判定為陰性（-）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病料樣品PCR 檢測

3 年的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表4）顯示：在腹瀉癥狀樣品中，檢出大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和輪狀病毒，檢出率分別為48.89%、21.85%、11.48%和10.37%；在肺炎癥狀樣品中，檢出肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌、馬鏈球菌、金黃色葡萄球菌、馬流感病毒和馬皰疹病毒，檢出率分別為29.82%、24.10%、22.29%、2.41%、12.65% 和1.81%；在流產(chǎn)癥狀樣品中，檢出沙門氏菌、大腸桿菌和馬皰疹病毒，檢出率分別為44.29%、18.57%和3.57%。所有流產(chǎn)臨床癥狀樣品中均未檢出馬動(dòng)脈炎病毒。

表4 不同病原的陽性檢出率 %

2.2 混合感染結(jié)果統(tǒng)計(jì)

檢測發(fā)現(xiàn)，同一樣品中存在混合感染情況（表5），主要表現(xiàn)為大腸桿菌與其他病原的混合感染。

表5 混合感染陽性檢出率 %

2.3 血液樣品布魯氏菌抗體檢測

對296 份血液樣品進(jìn)行布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(yàn)，未檢出抗體陽性。

3 討論

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，目前危害山東省驢場生產(chǎn)的最主要疫病是細(xì)菌病，而條件性致病菌是主要病原，其發(fā)生率多數(shù)與驢舍環(huán)境、養(yǎng)殖密度、飼料質(zhì)量和管理水平等有直接關(guān)系。細(xì)菌病給驢的規(guī)模化養(yǎng)殖帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失，因此規(guī)模化養(yǎng)殖條件下如何科學(xué)防控細(xì)菌病值得關(guān)注[6-11]。細(xì)菌性病原導(dǎo)致的腹瀉在驢養(yǎng)殖場普遍發(fā)生，主要致病菌是大腸桿菌。大腸桿菌不僅是引起腸炎和敗血癥的主要病原，也是引起驢駒嚴(yán)重腹瀉、肺炎，造成驢駒大量死亡的病因，病死率為15%～20%[12]。1982 年，河南省發(fā)生了大規(guī)模馬屬動(dòng)物腹瀉疫情，41 374 只馬屬動(dòng)物中，有437 只發(fā)病，發(fā)病率為1.1%，死亡319 只，死亡率為73%，疫情的發(fā)生與飼養(yǎng)管理?xiàng)l件差密切相關(guān)，加上天氣變化導(dǎo)致消化道內(nèi)菌系失調(diào)，致病性大腸桿菌急劇增殖產(chǎn)生大量毒素，最終因敗血癥而死亡[13]。2015—2018 年研究[12]發(fā)現(xiàn)，位于山東、新疆、遼寧和內(nèi)蒙古的49 個(gè)規(guī)模驢場4 755頭驢駒的腹瀉發(fā)病率為67.3%，病原為大腸桿菌。這與本調(diào)查得出的大腸桿菌為腹瀉主要病原的結(jié)果一致。

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在流產(chǎn)癥狀樣品中，最主要的致病菌是沙門氏菌。研究[14]發(fā)現(xiàn)，造成2013—2014年新疆地區(qū)2 768 匹馬發(fā)生流產(chǎn)的主要病原也是馬流產(chǎn)沙門氏菌。近年來，歐美國家由于嚴(yán)格的養(yǎng)殖衛(wèi)生政策，馬流產(chǎn)沙門氏菌病發(fā)生率得到了很好的控制，但是該疾病在非洲和亞洲國家的馬屬動(dòng)物中很常見，仍然是一個(gè)急需解決的問題[15-19]。

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同癥狀樣品中存在一定的病原混合感染，主要為大腸桿菌與其他病原的雙重混合感染?；旌细腥究梢约又夭∏?，并導(dǎo)致出現(xiàn)復(fù)雜臨床癥狀，這給疾病防治增加了困難。

本調(diào)查未檢測出布魯氏菌陽性抗體，表明山東省規(guī)?；H場布魯氏菌流行率較低，同時(shí)也說明布魯氏菌并非導(dǎo)致驢流產(chǎn)的主要病原。

當(dāng)前，對細(xì)菌病的預(yù)防與治療更應(yīng)注重科學(xué)[20-23]。對于細(xì)菌病的預(yù)防，必須加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，保證驢舍良好的環(huán)境條件，同時(shí)也可以通過接種疫苗來降低疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。在治療方面，細(xì)菌病主要通過抗生素藥物進(jìn)行治療，但細(xì)菌極易產(chǎn)生耐藥性，因此需要科學(xué)合理用藥。在臨床治療中，建議用藥前通過藥敏試驗(yàn)篩選敏感抗生素類藥物，同時(shí)配合中藥以及噬菌體和益生菌等進(jìn)行輔助治療[24-28]。

4 結(jié)論

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致山東省規(guī)模驢場發(fā)生腹瀉、肺炎和流產(chǎn)的主要是條件性致病菌，其中導(dǎo)致腹瀉的主要是大腸桿菌，肺炎的主要是大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和馬鏈球菌，流產(chǎn)的主要是沙門氏菌。因此，規(guī)?；H場應(yīng)通過加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，提高養(yǎng)殖舍衛(wèi)生水平，科學(xué)使用抗生素等措施，控制細(xì)菌性疫病流行。