姚 博，張晉豪，何依璐，梁旭清，崔興國(guó)，榮浪飛，周星海，魏方俊，何祖雷，姬廣海*，魏蘭芳?

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)省部共建云南生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)科基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，昆明 650201；3.曲靖佳沃現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司，曲靖 655000）

藍(lán)莓作為一種高經(jīng)濟(jì)價(jià)值，營(yíng)養(yǎng)豐富且具有保健功能的小漿果，其發(fā)展前景廣闊[1]。藍(lán)莓根癌?。˙lueberry crown gall disease）是由根癌土壤桿菌Agrobacteriumtumefaciens引起的一種藍(lán)莓根部病害[2]。隨著我國(guó)藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，目已成為藍(lán)莓生產(chǎn)中的主要病害，極大地限制著藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3]。由于藍(lán)莓根癌病主要發(fā)生于根部，從侵染到地上部分表現(xiàn)出癥狀需要漫長(zhǎng)過程，一旦發(fā)病樹勢(shì)會(huì)逐年變?nèi)?，造成減產(chǎn)和果品下降，直接帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。目前關(guān)于藍(lán)莓根癌病的防治報(bào)道較少，主要集中在化學(xué)防治，常用藥劑有噻霉酮[2]、硫酸銅[4]等，但是長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑會(huì)導(dǎo)致環(huán)境污染和影響藍(lán)莓品質(zhì)，因此尋找藍(lán)莓根癌病安全有效的防治方法具有重要意義。

目前認(rèn)為生物防治是控制根癌病最有效的方法之一[5]。世界范圍內(nèi)最早用于防治根癌病的菌株為放射形土壤桿菌AgrobacteriumradiobacterK84，其作用機(jī)理為搶占果樹傷口定殖和產(chǎn)生農(nóng)桿菌素，阻止病原菌侵入和生長(zhǎng)[6]。放射形土壤桿菌A.radiobacterK84及其遺傳改造菌株K1026，被研制成商品制劑Nogall[7]，并成功用于核果類果樹根癌病的防治，為最早的根癌病生物防治商品。解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciens32a、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌Bacillusmethylotrophicus39b都產(chǎn)生拮抗根癌土壤桿菌的脂肽類物質(zhì)，活體條件下抑制根癌土壤桿菌引起的番茄冠癭瘤[8,9]。貝萊斯芽胞桿菌BacillusvelezensisCLA178菌株產(chǎn)生的macrolactin類化合物對(duì)根癌土壤桿菌C58菌株有抑制活性[10]。近年來，國(guó)內(nèi)陸續(xù)也有根癌病生物防治的報(bào)道：高之蕾等[11]分離的糞產(chǎn)堿菌Alcaligenesfaecalis51-A和51-B對(duì)根癌土壤桿菌引起的番茄冠癭瘤有強(qiáng)烈抑制作用，但機(jī)理不明；張錫唐等[12]分離的瓦雷茲芽胞桿菌BacillusvelezensisJK-XZ8對(duì)櫻花根癌病具有良好田間防效，其作用機(jī)理可能是JK-XZ8產(chǎn)生抑制病原菌的活性物質(zhì)。李昱佳等[5]報(bào)道的泛菌Pantoea deleyi和腸桿菌Enterobactercowanii能夠在番茄根細(xì)胞間隙定殖，且顯著抑制根癌土壤桿菌引起的向日葵冠癭瘤，作用機(jī)理尚不明確。葡萄土壤桿菌AgrobacteriumvitisE26通過產(chǎn)生對(duì)葡萄根癌病菌A.vitis有抑制作用的土壤桿菌素E26達(dá)到生防的目的[13]。綜上所述，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于根癌病生物防治機(jī)理主要為生防菌產(chǎn)生對(duì)病原菌有抑制作用的物質(zhì)和搶占傷口或侵入位點(diǎn)，但是藍(lán)莓根癌病生物防治的研究還未見報(bào)道。

本課題組從200余株藍(lán)莓根內(nèi)生細(xì)菌中篩選得到一株對(duì)藍(lán)莓根癌病菌有較強(qiáng)拮抗作用，且對(duì)藍(lán)莓根癌病有良好田間防效的解淀粉芽胞桿菌JK10。本研究通過分析菌株JK10產(chǎn)生的活性物質(zhì)，定殖情況和施入菌株JK10后藍(lán)莓根內(nèi)生細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)變化，揭示解淀粉芽胞桿菌JK10的生防機(jī)理，為藍(lán)莓根癌病的生物防治提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

本研究于2020年5月至2021年9月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)和曲靖佳沃現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司藍(lán)莓基地內(nèi)完成。

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 解淀粉芽胞桿菌JK10（16S rDNA GenBank登錄號(hào)：OL825023），健康藍(lán)莓根組織內(nèi)生細(xì)菌，對(duì)藍(lán)莓根癌土壤桿菌有良好的拮抗效果；根癌土壤桿菌 L-11（16S rDNA GenBank登錄號(hào)：MK910214.1），分離自藍(lán)莓根癌病冠癭瘤組織[2]。

1.1.2 供試植株 番茄（中蔬4號(hào)）從市場(chǎng)購(gòu)買；藍(lán)莓苗品種為“Jewelry”，1年組培苗，由曲靖佳沃現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司惠贈(zèng)。

1.1.3 質(zhì)粒 質(zhì)粒EC135-PGFP4412由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院惠贈(zèng)，該穿梭質(zhì)粒攜帶有綠色熒光蛋白編碼基因GFPmut3a（717 bp）。

1.2 培養(yǎng)基

解淀粉芽胞桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基參考劉京蘭等[14]的配方，主要考慮抑菌活性和活菌量?jī)蓚€(gè)指標(biāo)，使用單因素變量篩選優(yōu)化，改良后培養(yǎng)基命名為BA培養(yǎng)基（1 L）：工業(yè)蛋白胨11.25 g、酵母浸粉3.75 g、工業(yè)蔗糖5 g、馬鈴薯淀粉5 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、NaCl 1 g，蒸餾水定容至1 L，1 mol/L的NaOH溶液將pH調(diào)至7.0，分裝后滅菌備用；YEM培養(yǎng)基（1 L）：甘露醇10 g、酵母膏3 g、NaCl 0.2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、K2HPO4·3H2O 0.5 g、瓊脂20 g、使用1 mol/L的NaOH溶液將pH調(diào)至7.0，分裝后滅菌備用；不加瓊脂為YEB培養(yǎng)基。生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基、電擊轉(zhuǎn)化緩沖液、復(fù)蘇培養(yǎng)基均參考文獻(xiàn)[15]。

1.3 菌株JK10活性物質(zhì)提取與分析

1.3.1 菌株JK10 發(fā)酵液 JK10于LB平板上純化后挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min過夜培養(yǎng)，次日按照1%的比例接種至BA培養(yǎng)基，裝液量為500 mL/瓶，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)36 h用于田間試驗(yàn)及活性物質(zhì)分析試驗(yàn)。

1.3.2 菌株JK10發(fā)酵液中活性物質(zhì)的分離 將1.3.1中搖床培養(yǎng)36 h的菌液于50 mL無菌離心管中10000 r/min離心20 min，得到無菌上清液。收集上清液到干凈無菌的三角瓶中，每瓶500 mL備用。

酸沉淀法[16]。使用6 mol/L HCl將上述上清液pH調(diào)至2.0后置于4 ℃冰箱過夜，12000 r/min離心10 min收集沉淀。沉淀于超凈工作臺(tái)中吹干，使用適量分析純甲醇對(duì)沉淀充分抽提，合并抽提液后使用濾紙過濾，然后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去甲醇溶劑，稱重，得到脂肽類粗提物。

硫酸銨沉淀法[17]。上述上清液中加入分析純硫酸銨，使硫酸銨溶解度為30%，硫酸銨震蕩溶解后于4 ℃冰箱放置2 h后離心，收集沉淀后放到超凈工作臺(tái)中吹干，使用分析純甲醇溶解沉淀并使用濾紙過濾溶液，然后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸至干并稱重，得到抑菌蛋白類粗提物。

乙酸乙酯萃取法[18]。取上述無菌上清液500 mL于分液漏斗中，加入等體積的乙酸乙酯充分震蕩后靜置使其分層，收集上層有機(jī)相。重復(fù)萃取一次后，合并兩次萃取得到的乙酸乙酯溶液，并往溶液中加入 20 g無水硫酸鈉除去水分，濾紙過濾后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸至干，稱重備用。

大孔樹脂吸附法。參照林寶妹等[19]的方法對(duì)大孔樹脂進(jìn)行預(yù)處理。稱取預(yù)處理好的大孔吸附樹脂20 g加入到上述上清液中，置于恒溫振蕩器中30 ℃、160 r/min吸附24 h。無菌水超純水清洗兩遍樹脂顆粒后過4層紗布，收集樹脂顆粒，樹脂顆粒自然風(fēng)干后置于100 mL三角瓶中，加入50 mL甲醇，30 ℃、160 r/min恒溫振蕩器中解吸附2 h，而后將甲醇濾出，加入50 mL甲醇重復(fù)解吸附2次，將3次得到的甲醇溶液合并后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸至干，稱重。

1.3.3 粗提物活性檢測(cè) 以根癌土壤桿菌L-11為靶標(biāo)菌株，將4種方法得到的粗提物均使用甲醇溶解后稀釋到10 mg/mL，過0.22 μm有機(jī)相濾膜除菌。將在YEM平板上生長(zhǎng)的L-11挑取單菌落至無菌離心管中，使用無菌水稀釋成OD600=0.3的菌懸液后吸取100 μL到新的YEM平板上并涂布均勻，將滅菌后的濾紙片均勻放置在離培養(yǎng)皿中心25 mm的位置上，每皿3片（濾紙片直徑為6 mm），每個(gè)濾紙片滴加10 μL粗提物，以無菌甲醇作為對(duì)照。滴加粗提物后平板置于4 ℃冰箱2 h，使粗提物充分分散到平板中[20]，然后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，36 h后觀察記錄抑菌圈大小，以此評(píng)價(jià)四種粗提物的活性，每個(gè)處理重復(fù)3皿。

1.3.4 菌株 JK10活性物質(zhì)種類分析 基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）使用Shimadzu AXIMA Performance質(zhì)譜儀，采用α-氰-4-羥肉桂（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid）為基質(zhì)，三氟乙酸鈉為離子源，按照線性、正離子模式測(cè)試，使用337 nm氮激光源解吸附和電離，具體方法參照 Ongena等[21]。將提取的粗提物母液（10 mg/mL）用無水甲醇稀釋50倍后置于儀器離子源進(jìn)行測(cè)定，質(zhì)量掃描范圍為100～3000 Da。

1.4 菌株JK10綠色熒光蛋白標(biāo)記及其生物學(xué)特性測(cè)定

1.4.1 菌株JK10感受態(tài)細(xì)胞制備 參考康星星[15]的方法，JK10于LB培養(yǎng)基連續(xù)劃線純化2次后，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)中，搖床160 r/min、30 ℃過夜培養(yǎng)，作為種子液。將種子液按照1%的接種量接入到生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，搖床160 r/min、30 ℃培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期OD600=0.6～0.8，使用電擊轉(zhuǎn)化緩沖液將離心得到的JK10細(xì)胞洗滌4次后加入1 mL電擊轉(zhuǎn)化緩沖液重新懸浮，無菌離心管每管100 μL分裝后使用液氮速凍，放置于-80 ℃冰箱備用。

1.4.2 質(zhì)粒EC135-PGFP4412提取 宿主菌EC135在LB抗生素（卡那霉素濃度為25 μg/mL）培養(yǎng)基上劃線純化后，挑取紫外光下發(fā)出強(qiáng)烈綠色熒光的單菌落接種LB抗生素（卡那霉素濃度為12.5 μg/mL）液體培養(yǎng)基中，搖床160 r/min、30 ℃培養(yǎng)24 h，使用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 電擊轉(zhuǎn)化 將100 μL JK10感受態(tài)細(xì)胞與10 μL（500 ng/μL）EC135-PGFP4412質(zhì)粒加到1 mm電擊杯中混合均，電擊轉(zhuǎn)化（電壓為1800 V，電阻為200 Ω，電容為25 μF）。電擊轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞立即轉(zhuǎn)移至900 μL復(fù)蘇培養(yǎng)基中，搖床160 r/min、37 ℃復(fù)蘇培養(yǎng)4 h，復(fù)蘇培養(yǎng)后離心除去多余培養(yǎng)基，濃縮至400 μL，吸取100 μL均勻涂布到LB抗生素（卡那霉素濃度為25 μg/mL）培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。1～2 d后在紫外光下觀察，挑取發(fā)出綠色熒光的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，劃線純化后保存，綠色熒光蛋白標(biāo)記的菌株命名為JK10-GFP。

1.4.4 標(biāo)記菌株與原始菌株的生物學(xué)比較 標(biāo)記菌株JK10-GFP與原始菌株JK10生長(zhǎng)曲線及穩(wěn)定性測(cè)定參考文獻(xiàn)[22,23]，培養(yǎng)條件均為培養(yǎng)條件為160 r/min、30 ℃。JK10-GFP培養(yǎng)至指數(shù)期，以1%的接種量每隔12 h連續(xù)轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基中，直至第5 d，轉(zhuǎn)接的同時(shí)吸取JK10-GFP菌液稀釋后涂布到LB培養(yǎng)基和LB抗生素（卡那霉素濃度為25 μg/mL）培養(yǎng)基中，觀察總的菌落數(shù)量及發(fā)出熒光的菌落數(shù)；JK10與JK10-GFP分別挑取單菌落接至LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，次日將JK10、JK10-GFP使用無菌水調(diào)至相同濃度OD600=1，然后按照1%的接種量接種至LB液體培養(yǎng)基中，每隔3 h測(cè)定兩株菌液OD600值并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.4.5 抑菌活性及溫室防效比較 JK10、JK10-GFP活化后，分別挑取單菌落接種于BA培養(yǎng)基，L-11活化后挑取單菌落接種于YEB培養(yǎng)基，三株菌于28 ℃、150 r/min搖床內(nèi)培養(yǎng)24 h。使用無菌水將L-11菌液稀釋成OD600=0.3的菌懸液，吸取100 μL均勻涂布到Y(jié)EM平板上。距離平板中心2 cm的位置均勻放置3只牛津杯，無菌水作為對(duì)照，處理中分別加入100 μL JK10、100 μL JK10-GFP菌液，重復(fù)3皿，36 h后測(cè)量?jī)芍昃囊志?，以此評(píng)價(jià)兩株菌的抑菌活性。溫室盆栽番茄苗，40 d后使用針刺接種法評(píng)[24]價(jià)JK10與JK10-GFP的對(duì)L-11致瘤的影響。將上述培養(yǎng)的JK10、JK10-GFP菌液和無菌水各吸取500 μL至無菌離心管中，再分別加入500 μL L-11菌液，搖晃均勻，用1 mL無菌注射器分別注射到番茄莖基部，每處注射100 μL，每棵番茄苗接種兩處（間隔5 cm）。接種30 d后將瘤狀組織用鋒利小刀切下后稱重，以此評(píng)價(jià)菌株JK10，菌株JK10-GFP對(duì)L-11起瘤的抑制作用，無菌水作為對(duì)照。

1.5 菌株JK10綠色蛋白標(biāo)記菌株定殖情況

1.5.1 菌株JK10-GFP溫室盆栽定殖試驗(yàn) 參考李昱佳等[5]的方法將純化后的菌株JK10-GFP、L-11分別接種于BA、YEB培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)36 h。培養(yǎng)結(jié)束，菌株JK10-GFP菌量為5×1010cfu/mL，L-11菌量為 2×109cfu/mL。然后將兩種菌液灌根接種于藍(lán)莓苗根際土中，使 JK10-GFP初始接種濃度為1×108cfu/g，L-11的初始菌量為1×107cfu/g，以只接種L-11不接種JK10-GFP作為對(duì)照。從接種后第1、3、5、7 d取1次藍(lán)莓根際土與藍(lán)莓葉片組織，從第7 d開始每隔7 d取一次。盆栽藍(lán)莓苗所用基質(zhì)為草炭與珍珠巖，比例為8:2（V:V）。

1.5.2 標(biāo)記菌株在藍(lán)莓根際土和葉片中的存活情況 將1.5.1中采集的藍(lán)莓根際土、藍(lán)莓葉片組織（剪碎）稱取0.1 g置于無菌離心管中，加入900 μL無菌水充分磨碎后于恒溫震蕩器中震蕩30 min，此為10-1濃度，然后再依次稀釋105或106倍后吸取100 μL均勻涂布于LB抗生素（卡那霉素濃度為25 μg/mL）平板上，48 h后在紫外光下觀察并計(jì)數(shù)發(fā)出綠色熒光的菌落，每次重復(fù)3皿。

1.5.3 標(biāo)記菌株在藍(lán)莓組織內(nèi)的定殖觀察 將施入JK10-GFP菌株1、7、21 d的藍(lán)莓根使用冷凍切片技術(shù)切成20 μm的薄片，分別使用萊卡熒光顯微鏡（德國(guó)萊卡公司，型號(hào)：DM2000）和激光共聚焦掃描顯微鏡（德國(guó)萊卡公司，型號(hào)：Leica SP5 II）觀察標(biāo)記菌株在藍(lán)莓根組織內(nèi)的定殖情況[25]。

1.6 菌株JK10對(duì)藍(lán)莓內(nèi)生細(xì)菌的影響

1.6.1 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本部分試驗(yàn)于曲靖佳沃現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司藍(lán)莓基地園區(qū)內(nèi)進(jìn)行。選取藍(lán)莓根癌病發(fā)病程度中等的片區(qū)（發(fā)病率為38.4%），將1壟連續(xù)的90棵藍(lán)莓苗劃分為3組即DT、HT、CT，每組中都包含發(fā)病植株和健康植株，DT組（30棵）和HT組（30棵）作為對(duì)照，CT組灌根JK10菌懸液。2021年1月10日開始，每隔15 d，CT灌根一次JK10發(fā)酵液50倍液（菌量為1×109cfu/mL），每棵藍(lán)莓苗灌2 L，連續(xù)灌根3次。DT與HT每棵每次灌根2 L清水。2021年7月1日在DT組隨機(jī)選取3株藍(lán)莓根癌病株采集冠癭瘤組織，HT組隨機(jī)取3株健康藍(lán)莓采集健康根組織，CT組隨機(jī)取3棵藍(lán)莓根癌病株采集冠癭瘤組織，樣品采集后立即放到干冰中。到實(shí)驗(yàn)室后用自來水將3組樣品的根組織沖洗干凈，再浸泡在5%次氯酸鈉中消毒5 min，使用無菌手術(shù)刀小心將根表面和小側(cè)根刮除干凈[26]。將處理好的樣品放置于干冰盒中，寄送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的高通量測(cè)序。

1.6.2 細(xì)菌基因組DNA提取、擴(kuò)增、純化和測(cè)序 采用CTAB或SDS方法[27]對(duì)樣本的基因組 DNA進(jìn)行提取，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度，取適量樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物，New England Biolabs公司的Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，和高效高保真酶進(jìn)行PCR，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。

1.6.3 Alpha Diversity分析 使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計(jì)算simpson，Chao1，Shannon指數(shù)，使用R軟件（Version 2.15.3）進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析。通過分析3組樣本內(nèi)Alpha多樣性以反映樣本內(nèi)的微生物群落的豐富度和多樣性，評(píng)估其豐富度和多樣性的差異[28]。

1.6.4 Beta Diversity分析 用Qiime軟件（Version 1.9.1）計(jì)算Unifrac距離、構(gòu)建UPGMA樣本聚類樹。使用R軟件（Version 2.15.3，WGCNA，stats和ggplot2軟件包）繪制并分析PCoA圖。使用R軟件進(jìn)行Beta多樣性指數(shù)組間差異分析，分別進(jìn)行有參數(shù)檢驗(yàn)和非參數(shù)檢驗(yàn)。

1.6.5 JK10對(duì)藍(lán)莓根內(nèi)生細(xì)菌的影響 利用Uparse軟件（Uparse v7.0.1001）對(duì)所有樣本的全部 Effective Tags進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為OTUs，同時(shí)會(huì)選取OTUs的代表性序列，依據(jù)其算法原則，篩選OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。對(duì)OTUs序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur方法[29]與SILVA138的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.8～1），獲得分類學(xué)信息并分別在各個(gè)分類水平：kingdom（界），phylum（門），class（綱），order（目），family（科），genus（屬），species（種）統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。使用MUSCLE（Version 3.8.31）軟件進(jìn)行快速多序列比對(duì)，得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系[30]。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8和Excel 2016軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株JK10活性物質(zhì)分析

2.1.1 四種方法提取的活性物質(zhì)的抑菌活性及產(chǎn)率 4種粗提物對(duì)L-11均有明顯的抑制效果。表1所示，大孔樹脂吸附法得到的粗提物抑菌活性最強(qiáng)且產(chǎn)率最高，酸沉淀法得到的粗提物抑菌活性最低，乙酸乙酯萃取法得到的粗提物產(chǎn)率最低。

表1 4種方法粗提物的抑菌活性及產(chǎn)率Table 1 Antibacterial activity and yield of crude extracts of four methods

2.1.2 大孔樹脂提取物MALDI-TOF-MS分析 對(duì)于產(chǎn)率和活性均最高的大孔樹脂吸附法得到的粗提物進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時(shí)間質(zhì)譜分析。MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析結(jié)果顯示：JK10在m/z值（圖1A）為550.3512離子峰對(duì)應(yīng)于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素Divergolide D的質(zhì)量[31]；在m/z值為581.0817處有離子峰（簇）出現(xiàn)，這個(gè)離子峰對(duì)應(yīng)于Bacillaene[32]的質(zhì)量。菌株JK10發(fā)酵液在m/z值（圖1B）1030.4344、1044.4754和1058.5153處有離子峰（簇）出現(xiàn)，這3個(gè)離子峰分別對(duì)應(yīng) C14-C16 bacillomycin D的質(zhì)量；在m/z值（圖1C）為1449.6271、1463.6456處有離子峰（簇）出現(xiàn)，這兩個(gè)離子峰分別對(duì)應(yīng)fengycinA、fengycinB的質(zhì)量；MALDI-TOF-MS分析表明，菌株JK10發(fā)酵液中含有脂肽類化合物fengycinA、fengycinB、C14-C16 bacillomycin D；可能含有大環(huán)內(nèi)酯類抗生素Divergolide D，聚酮類化合物Bacillaene。

圖1 菌株JK10活性物質(zhì) MALDI-TOF-MS分析Fig.1 MALDI-TOF-MS analysis of active substance of biocontrol strain JK10

2.2 標(biāo)記菌株的生物學(xué)特性

2.2.1 標(biāo)記菌株生物學(xué)特性 連續(xù)轉(zhuǎn)接 10次后，無論是抗性平板還是非抗性平板上生長(zhǎng)的所有菌落都仍然保持均勻而且強(qiáng)烈的綠色熒光，說明標(biāo)記基因在JK10中能夠穩(wěn)定遺傳，轉(zhuǎn)接至第5 d熒光穩(wěn)定性還保持在100%。由圖2可知JK10與JK10-GFP菌株的生長(zhǎng)曲線，在3～12 h為生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，兩株菌生長(zhǎng)曲線基本重合，說明外源質(zhì)粒的存在和GFP的表達(dá)未對(duì)JK10的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯不利影響。

圖2 菌株JK10與JK10-GFP生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of biocontrol strains JK10 and JK10-GFP

2.2.2 標(biāo)記菌株抑菌活性檢測(cè) 圖3A所示，室內(nèi)拮抗試驗(yàn)中JK10，JK10-GFP對(duì)L-11均有明顯的抑菌圈，抑菌圈直徑分別為（24.15±0.31）和（23.63±0.24）mm，兩者無顯著差異（P＞0.05）。模式植株番茄活體針刺接種試驗(yàn)表明，野生型菌株JK10與標(biāo)記菌株JK10-GFP對(duì)L-11的致瘤均有強(qiáng)烈抑制作用，兩株菌處理過的番茄莖部都幾乎不起瘤，二者瘤重?zé)o顯著差異（P＞0.05），且抑制率均在 90%以上（圖3B）。證明外源質(zhì)粒的存在及GFP的表達(dá)未對(duì)菌株JK10的生理代謝、生防功能產(chǎn)生明顯的不利影響，JK10-GFP可替代JK10用作生防試驗(yàn)。

圖3 抑菌活性及抑制番茄起瘤效果Fig.3 Antibacterial activity and inhibiting effect on tomato tumor formation of biocontrol strain

2.3 標(biāo)記菌株的定殖能力

2.3.1 標(biāo)記菌株在藍(lán)莓根際土和葉片中存活能力檢測(cè) 平板計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，標(biāo)記菌株可以在藍(lán)莓根際土和藍(lán)莓葉片中穩(wěn)定存活3個(gè)月以上（圖4）。在整個(gè)觀測(cè)期間（0～91 d），藍(lán)莓根際土壤和藍(lán)莓葉片中均能分離得到帶有熒光標(biāo)記的菌株，而對(duì)照組根際土與葉片中均未見發(fā)出熒光的菌株。JK10- GFP在藍(lán)莓根際土壤中呈現(xiàn)先快速下降后穩(wěn)定的趨勢(shì)，0～7 d藍(lán)莓根際土壤中的標(biāo)記菌株數(shù)量下降了一個(gè)數(shù)量級(jí)，之后下降速度減慢，直至35 d左右菌量穩(wěn)定在1×106cfu/g；JK10-GFP在藍(lán)莓葉片組織中的含量在0～7 d從無到有并達(dá)到了103cfu/g以上，之后上升速率有所減慢，35 d后逐漸穩(wěn)定在4.0×105cfu/g。

圖4 菌株JK10-GFP在藍(lán)莓根際土及藍(lán)莓葉片中的存活量Fig.4 Colonization ability of JK10-GFP in blueberry rhizosphere soil and blueberry leaves

2.3.2 標(biāo)記菌株在藍(lán)莓根部的定殖觀察 圖5所示，JK10-GFP灌根1 d后即可在藍(lán)莓根縱切面的邊緣觀察到強(qiáng)烈的熒光，說明標(biāo)記菌株灌根處理1 d內(nèi)，即可在藍(lán)莓根表面富集，之后再通過傳導(dǎo)系統(tǒng)進(jìn)入藍(lán)莓組織內(nèi)部，而對(duì)照均未觀察到熒光，表明未經(jīng)處理的藍(lán)莓根組織無熒光背景。

圖5 熒光顯微鏡觀察JK10-GFP在藍(lán)莓表面聚集Fig.5 Fluorescence microscope observation for colonization ability of JK10-GFP on the surface of blueberries root

使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察JK10-GFP灌根處理7、21 d的藍(lán)莓根組織縱切面，結(jié)果如圖6所示。JK10-GFP處理7 d后，標(biāo)記菌株主要聚集在藍(lán)莓根的表面，且土壤中的標(biāo)記菌株較多，對(duì)觀察影響較大；處理21 d后，標(biāo)記菌株在藍(lán)莓根組織細(xì)胞間隙內(nèi)分布均勻，含量較7 d的藍(lán)莓根組織明顯增多。說明灌根處理藍(lán)莓后，標(biāo)記菌株是從藍(lán)莓根際土中進(jìn)入到藍(lán)莓根組織中。

圖6 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察JK10在藍(lán)莓根組織內(nèi)的定殖情況Fig.6 Observation of the colonization ability of JK10 in blueberry root tissue by laser scanning confocal microscope

2.4 JK10對(duì)藍(lán)莓根組織內(nèi)生細(xì)菌群落的影響

2.4.1 JK10三組樣品組內(nèi)物種豐富度比較 HT、DT、CT內(nèi)生細(xì)菌α多樣性指數(shù)如圖7所示，可以看出經(jīng)過JK10處理的CT內(nèi)生細(xì)菌的Observed_species、simpson、Chao1 指數(shù)、Shannon指數(shù)均明顯高于未經(jīng)處理的藍(lán)莓冠癭瘤組織DT，說明通過JK10灌根處理藍(lán)莓根癌病冠癭瘤組織內(nèi)部的微生物群落的豐富度和多樣性顯著增加。

圖7 三組樣品內(nèi)生細(xì)菌alpha多樣性指數(shù)Fig.7 Boxplot showing bacterial alpha diversity indexes of three groups

2.4.2 JK10對(duì)藍(lán)莓根內(nèi)生細(xì)菌組間的差異影響 基于Weighted Unifrac距離和 Unweighted Unifrac距離的PCoA分析，樣本距離越接近表示物種組成結(jié)構(gòu)越相似，群落差異很大的樣本則會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)分開。由圖8可知，兩種分析方法都表明健康藍(lán)莓根組織內(nèi)生細(xì)菌與根癌病藍(lán)莓根組織內(nèi)生菌差異較大，而經(jīng)過JK10灌根處理的CT，3個(gè)樣本散落在不同的象限，且距離HT比距離DT明顯更近。

圖8 基于Weighted Unifrac距離（A）與 Unweighted Unifrac 距離（B）的PCoA分析Fig.8 PCoA analysis based on Weighted Unifrac distance (A) and Unweighted Unifrac distance (B) for diversity analysis

以 Weighted Unifrac 和 Unweighted Unifrac 距離繪制的Heatmap結(jié)果用以表示HT、DT、CT之間的相異系數(shù)，其值越小，表示兩個(gè)樣本在物種多樣性方面存在的差異越小，由圖9可知CT與HT之間的相異系數(shù)顯著低于CT與DT之間的相異系數(shù)。說明經(jīng)過JK10處理，CT的內(nèi)生細(xì)菌群落相較于沒有處理的發(fā)病藍(lán)莓根癌病根組織，其物種結(jié)構(gòu)更接近于健康藍(lán)莓根。

圖9 基于Weighted Unifrac距離（A）與 Unweighted Unifrac 距離（B）的矩陣熱圖Fig.9 Distance heatmap graph based on Weighted Unifrac distance (A) and Unweighted Unifrac distance (B) for bacterial communities analysis

2.4.3 藍(lán)莓根內(nèi)生細(xì)菌門級(jí)物種比較 圖10所示，在門水平上發(fā)現(xiàn)HT內(nèi)生細(xì)菌占主導(dǎo)地位的物種包括：藍(lán)藻門 Cyanobacteria、放線菌門 Actinobacteria、變形菌門 Proteobacteria、酸桿菌門 Acidobacteriota；DT內(nèi)生細(xì)菌門水平占主導(dǎo)地位的物種包括藍(lán)藻門 Cyanobacteria、放線菌門 Actinobacteria、酸桿菌門Acidobacteriota、變形菌門Proteobacteria；CT內(nèi)生細(xì)菌門水平占主導(dǎo)地位的物種包括藍(lán)藻門Cyanobacteria、放線菌門Actinobacteria、擬桿菌門Firmicutes、變形菌門Proteobacteria。

圖10 三組樣品內(nèi)生細(xì)菌在門水平的分布Fig.10 Relative abundance at phylum level based on the species annotation results for top 10 phyla in all groups

2.4.4 藍(lán)莓根內(nèi)生細(xì)菌屬水平物種比較 根據(jù)所有樣本在屬水平的物種注釋及豐度信息，選取豐度排名前35的屬，根據(jù)其在每個(gè)樣本中的豐度信息，從物種和樣本兩個(gè)層面進(jìn)行聚類，繪制成熱圖（圖11）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HT富集較多的內(nèi)生細(xì)菌屬有諾卡氏菌屬Nocardia、熱酸菌屬Acidothermus、Conexibacter、分枝桿菌屬M(fèi)ycobacterium、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas；DT中優(yōu)勢(shì)根內(nèi)生菌屬有諾卡氏菌Nocardia、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas、熱酸菌屬Acidothermus、分枝桿菌屬M(fèi)ycobacterium、新鞘氨醇菌屬Novosphingobium；CT中優(yōu)勢(shì)根內(nèi)生菌屬有諾卡氏菌屬Nocardia、芽胞桿菌屬Bacillus、異樣根瘤菌屬Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、新鞘氨醇菌屬Novosphingobium、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas。綜合3組樣品發(fā)現(xiàn)諾卡氏菌屬、鞘氨醇單胞菌屬在3組樣品中均為優(yōu)勢(shì)物種，且相對(duì)豐度較高。CT內(nèi)生細(xì)菌中芽胞桿菌屬相對(duì)豐度明顯升高，可能是因?yàn)镴K10處理的藍(lán)莓根組織招募了更多的芽胞桿菌屬細(xì)菌或者是JK10能夠在藍(lán)莓根內(nèi)定殖。

圖11 藍(lán)莓根內(nèi)生細(xì)菌物種在屬水平聚類圖Fig.11 Cluster map heatmap representing the relative abundance of top 35 bacterial genera

3 討論

解淀粉芽胞桿菌具有廣譜抑菌活性，可產(chǎn)生多種拮抗真菌和細(xì)菌的活性物質(zhì)。桑建偉等[33]研究表明解淀粉芽胞桿菌BEB17產(chǎn)生多種脂肽類和聚酮類物質(zhì)，其粗提物對(duì)香蕉枯萎病菌Fusariumoxysporum具有較好的抑制作用。向亞萍等[34]研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌B1619分泌的3類脂肽類抗生素中對(duì)番茄枯萎病菌Fusariumoxysporum生長(zhǎng)有抑制作用的抗生素是bacillomycin L和fengycins。楊橋等[35]從深海泥中分離得到的一株解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生一種新型的大環(huán)內(nèi)酯抗生素macrolactin對(duì)大腸埃希菌Escherichiacoli、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus都有抑制作用。解淀粉芽胞桿菌防治真菌病害的報(bào)道較多，防治細(xì)菌病害的報(bào)道較少，目前被廣泛認(rèn)可的對(duì)細(xì)菌有拮抗作用的化合物有 surfactin、Bacillibactin、Difficidin 和Bacillaene，拮抗機(jī)理主要有改變細(xì)菌的表面疏水性，破壞生物膜完整性等[36,37]。本研究證明，解淀粉芽胞桿菌 JK10的發(fā)酵液中含有 bacillomycin D、fengycin兩類脂肽類化合物可能含有大環(huán)內(nèi)酯類抗生素Divergolide D、聚酮類化合物Bacillaene。具體哪種是抑制根癌土壤桿菌的主要物質(zhì)還需要對(duì)粗提物進(jìn)一步純化和鑒定。

對(duì)于土傳病害來說，生防菌株能否穩(wěn)定定殖是其發(fā)揮生防功能的關(guān)鍵[38]。張楠等[39]使用 GFP標(biāo)記解淀粉芽胞桿菌 SQR9，并證明其在水培和土培條件下均能穩(wěn)定定殖在香蕉根表，對(duì)香蕉枯枯萎病有良好的防治前景。高競(jìng)等[40]使用GFP標(biāo)記的解淀粉芽胞桿菌GFP-WK1有較強(qiáng)的移動(dòng)性，無論是通過根系澆灌、葉面噴施還是樹干滴注其都能夠在山核桃的根、莖、葉中穩(wěn)定定殖，對(duì)山核桃干腐病有良好的應(yīng)用前景。李昱佳等[5]使用GFP標(biāo)記的泛菌P.deleyi和腸桿菌E.cowanii對(duì)根癌土壤桿菌引起的向日葵冠癭瘤有明顯的抑制效果，并且可以定殖在番茄根部細(xì)胞間隙中，有良好防治桃樹根癌病前景。本研究直接使用藍(lán)莓作為研究對(duì)象，模擬實(shí)際生產(chǎn)中的情況，使用草炭和珍珠巖作為藍(lán)莓苗栽培基質(zhì)，接種生防菌的同時(shí)接種藍(lán)莓根癌病病原菌，明確了 JK10不僅可以穩(wěn)定定殖在藍(lán)莓根際土和藍(lán)莓根部，由于其具有良好的移動(dòng)性，還能在藍(lán)莓的葉片組織中定殖。由于JK10產(chǎn)生抑制真菌的fengycin、bacillomycin D，這使得其對(duì)藍(lán)莓主要葉部病害，如藍(lán)莓葉斑病，藍(lán)莓灰霉病可能也有一定的生防價(jià)值。

根癌土壤桿菌與植物內(nèi)生細(xì)菌互作關(guān)系已成為研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，也是根癌病生物防治的重要切入點(diǎn)。桃樹抗/感根癌病品種內(nèi)生細(xì)菌群落差異研究證實(shí)，抗病品種的內(nèi)生細(xì)菌群落與可培養(yǎng)細(xì)菌豐度高于感病品種，根部的根癌拮抗菌假單胞菌屬Pseudomonas、鏈霉菌屬Streptomyces和枝條中的根瘤菌屬Rhizobium等細(xì)菌在抗病植株中分布頻率高，可作為生防菌應(yīng)用[41]；李昱佳等[5]研究表明在接種根癌土壤桿菌后桃枝條內(nèi)生細(xì)菌中，腸桿菌屬Enterobacter、泛菌屬Pantoea和根瘤菌屬Rhizobium數(shù)量顯著上升。尹丹韓[42]研究表明施入生防菌哈茨木霉菌 T4后木霉對(duì)黃瓜根圍土壤細(xì)菌群落產(chǎn)生顯著影響，對(duì)一些不可培養(yǎng)細(xì)菌的有效抑制作用，對(duì)芽胞桿菌、土壤桿菌、芽單胞菌有明顯促進(jìn)作用。陳勝菊等[43]研究表明生防熒光假單胞菌Pseudomonasfluorescens定殖后對(duì)土壤中可培養(yǎng)的真菌數(shù)量上有抑制作用。本研究證明施入解淀粉芽胞桿菌JK10之后藍(lán)莓根癌病根內(nèi)生細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，其中芽胞桿菌屬Bacillus、異樣根瘤菌Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、新鞘氨醇菌屬Novosphingobium、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas含量均上升，其中芽胞桿菌屬Bacillus作為生防細(xì)菌的應(yīng)用是最廣泛和成熟的，鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas某些菌株具有降解高分子有機(jī)污染物的能力[44,45]。通過Beta多樣性分析證明JK10灌根處理后的藍(lán)莓根癌病植株冠癭瘤內(nèi)生細(xì)菌的群落組成，相較于未處理的藍(lán)莓根癌冠癭瘤組織內(nèi)生細(xì)菌更趨向于健康藍(lán)莓根組織內(nèi)生細(xì)菌，但關(guān)于這些增加的細(xì)菌的功能還有待研究。