張 震，邱海萍，柴榮耀，郝中娜，王教瑜，王艷麗，孫國(guó)昌

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所/省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江省國(guó)家農(nóng)作物品種抗性鑒定試驗(yàn)站，杭州 310021）

赤霉病是我國(guó)長(zhǎng)江中下游流域小麥生產(chǎn)上最為主要的病害之一，由其造成的產(chǎn)量損失一般在 10%～15%，大流行年份甚至可以達(dá)50%以上[1]。發(fā)病麥粒粗蛋白質(zhì)含量低，出粉率低，失去種用和工業(yè)用價(jià)值[2]。病麥粒還含有病菌產(chǎn)生的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）和玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）等毒素，人畜食用后易對(duì)健康造成嚴(yán)重威脅。

小麥赤霉病主要由禾谷鐮刀菌Fusariumgraminearum侵染所致，其防控措施目前仍以小麥揚(yáng)花初期的化學(xué)防治為主，防治藥劑主要是多菌靈、戊唑醇和氰烯菌酯等單劑或相關(guān)復(fù)配劑?；瘜W(xué)藥劑長(zhǎng)期的不合理使用，不僅使得環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留超標(biāo)等問(wèn)題日趨嚴(yán)重，也易衍生出諸多生態(tài)和社會(huì)問(wèn)題。小麥赤霉病防治中，單一化學(xué)藥劑的長(zhǎng)期使用，使得部分麥區(qū)禾谷鐮刀菌已產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性[3]。為順應(yīng)我國(guó)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展，生防菌因其環(huán)境友好性，相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)與應(yīng)用在化學(xué)藥劑減量的大背景下日益受到重視[4]。迄今，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)篩選到許多對(duì)禾谷鐮刀菌具有生防活性的菌株，包括芽胞桿菌Bacillusspp.、假單胞菌Pseudomonasspp.和鏈霉菌Streptomycesspp.等，它們通常通過(guò)分泌具有抑菌活性的次生代謝物、營(yíng)養(yǎng)或生態(tài)位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)、誘導(dǎo)小麥抗病性等方式抑制禾谷鐮刀菌的為害[5,6]。但是基于菌劑的小麥赤霉病生防應(yīng)用大多仍處于實(shí)驗(yàn)室階段，少有商業(yè)化應(yīng)用產(chǎn)品轉(zhuǎn)化開(kāi)發(fā)[6]。截止2020年5月，我國(guó)赤霉病防治登記菌劑僅包括枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis、蠟質(zhì)芽胞桿菌Bacilluscereus和多粘類(lèi)芽胞桿菌Bacilluspolymyxa等5個(gè)產(chǎn)品[7]，而且相關(guān)產(chǎn)品的推廣還常受到活菌制劑見(jiàn)效慢及農(nóng)戶盲目應(yīng)用防效差等因素制約[4]。因此，篩選高效生防菌并配套適宜的應(yīng)用技術(shù)或許為解決赤霉病生物菌劑開(kāi)發(fā)和商業(yè)化應(yīng)用遲滯等問(wèn)題提供契機(jī)。

本研究評(píng)價(jià)了1株分離自稻茬的細(xì)菌對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌活性，并采用16S rDNA和gyrB基因序列對(duì)其進(jìn)行種屬鑒定；開(kāi)展了這個(gè)菌株對(duì)小麥赤霉病的田間防治效果試驗(yàn)和潛在應(yīng)用方法的探索；通過(guò)對(duì)其基因組的檢測(cè)初步分析了其潛在的生防機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株與培養(yǎng)基：菌株hzq1601，分離自冬閑田稻茬并由本實(shí)驗(yàn)室保存；禾谷鐮刀菌菌株Fg1706，由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存。供試培養(yǎng)基：細(xì)菌培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基和NA培養(yǎng)基；抑菌試驗(yàn)采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）；芽胞桿菌生化鑒定管，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。供試藥劑：50%多菌靈可濕性粉劑，由四川國(guó)光農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 菌株hzq1601對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌活性

將保存的菌株hzq1601于LB平板培養(yǎng)基活化，28 ℃培養(yǎng)1～2 d后用接種環(huán)挑取1個(gè)單菌落接種至裝有10 mL LB液體培養(yǎng)基的50 mL 離心管中，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)16 h，此時(shí)含菌量約2×107cfu/mL；取直徑0.5 cm的無(wú)菌濾紙碟于菌液中浸泡5 min后至超凈工作臺(tái)涼干；將帶菌紙碟與禾谷鐮刀菌進(jìn)行平板對(duì)峙培養(yǎng)，以未處理紙碟為對(duì)照。另取上述過(guò)夜培養(yǎng)的菌液1 mL接種至裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)72 h后，10000 r/min離心10 min，取上清經(jīng)0.22 μm一次性無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾除菌獲得無(wú)菌濾液，并與未凝固的PDA培養(yǎng)基按1/20（v/v）的比例均勻混合后制成平板，用于測(cè)定無(wú)菌濾液對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌效果。

1.3 菌株hzq1601的鑒定

1.3.1 菌體形態(tài)、培養(yǎng)特征觀察及生理生化指標(biāo)測(cè)定 挑取菌株hzq1601單菌落于NA平板上劃線，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，觀察其菌落顏色和形態(tài)。參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》的方法，進(jìn)行革蘭氏染色、厭氧生長(zhǎng)、V-P反應(yīng)、檸檬酸鹽利用、丙酸鹽利用、D-木糖利用、L-阿拉伯糖利用、D-甘露醇利用、明膠液化、7%氯化鈉生長(zhǎng)、pH 5.7生長(zhǎng)、硝酸鹽還原、淀粉水解等生理生化試驗(yàn)。

1.3.2 菌株多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 取方法1.2中hzq1601菌液2 mL，5000 r/min離心10 min收集菌體，采用天根生化科技有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。16S rDNA序列擴(kuò)增采用通用引物27F和1492R[8]。gyrB基因片段擴(kuò)增采用引物UP2r和UP1[9]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳切膠回收后進(jìn)行DNA測(cè)序。引物合成及DNA測(cè)序均由北京擎科生物技術(shù)有限公司完成。測(cè)序所得序列通過(guò)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行 BLAST 比對(duì)，并通過(guò) MEGA 軟件對(duì)供試菌株與模式菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。系統(tǒng)發(fā)育分析所用DNA序列均來(lái)源于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，所用菌株16S rDNA序列Genbank登錄號(hào)分別是解淀粉芽胞桿菌BacillusamyloliquefaciensFZB42（NR_075005）、DSM7（NR_118950）、枯草芽胞桿菌 168（NR_102783）、萎縮芽胞桿菌Bacillusatrophaeus1942（MF101172）、地衣芽胞桿菌BacilluslicheniformisATCC 14580（NR_074923）、BacilluspumilusSAFR-032（AY167879）和蠟質(zhì)芽胞桿菌 ATCC 14579（NR_074540）。gyrB基因序列Genbank登錄號(hào)分別是解淀粉芽胞桿菌FZB42（CP000560；4871-6787），解淀粉芽胞桿菌DSM7（FN597644；4871-6793）、枯草芽胞桿菌 168（CP010052；4867-6783）、萎縮芽胞桿菌 1942（CP002207；3633334-3635250）、地衣芽胞桿菌 ATCC 14580（CP000002；4986-6905）、短小芽胞桿菌B.pumilusSAFR-032（AY167871）和蠟質(zhì)芽胞桿菌 ATCC 14579（AB190226）。

1.4 解淀粉芽胞桿菌hzq1601與多菌靈兼容性分析

取方法1.2中菌株hzq1601的培養(yǎng)液2 mL至100 mL LB培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取10 mL菌液5000 r/min離心10 min收集菌體，用無(wú)菌去離子水洗滌菌體3次后，將菌體重懸于10 mL無(wú)菌去離子水中待用。稱(chēng)取適量多菌靈可濕性粉劑用無(wú)菌去離子水配置成2000 mg/L的多菌靈母液，待用。在15 mL離心管中加入上述菌懸液和多菌靈母液，用無(wú)菌去離子水分別配置成多菌靈濃度為1000、500、250和0 mg/L的菌藥混合液10 mL。菌藥混合液振蕩混勻后，經(jīng)LB平板涂板測(cè)定初始活菌量。菌藥混合液室溫放置并間有振蕩混勻，分別于放置1、2、4和8 d后取適量菌液檢測(cè)存活菌量。

1.5 菌株hzq1601對(duì)小麥赤霉病的田間防效

取方法1.2中hzq1601菌液8 mL至裝有400 mL LB培養(yǎng)液的1 L三角瓶中振蕩培養(yǎng)72 h后（含菌量約1.6×108cfu/mL），菌液直接用于田間防效試驗(yàn)。試驗(yàn)共設(shè)7個(gè)處理：T1：50%多菌靈可濕性粉劑100 g/667m2； T2：50%多菌靈可濕性粉劑80 g/667m2；T3：50%多菌靈可濕性粉劑70 g/667m2； T4：50%多菌靈可濕性粉劑80 g/667 m2+上述hzq1601培養(yǎng)液4 L/667 m2； T5：50%多菌靈可濕性粉劑70 g/667 m2+上述hzq1601培養(yǎng)液4 L/667 m2；T6：上述hzq1601培養(yǎng)液4 L/667 m2；T7：清水對(duì)照。試驗(yàn)田塊種植小麥品種為金運(yùn)麥1號(hào)，種植方式為稻田免耕直播。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，小區(qū)面積30 m2，小區(qū)隨機(jī)區(qū)組排列。試驗(yàn)共施藥處理2次，分別于小麥?zhǔn)蓟ㄆ诤偷?次藥后7 d，噴霧采用3WBD-16型背負(fù)式電動(dòng)噴霧器（臺(tái)州市黃巖綠野噴霧器廠），每667m2用水量30 kg。至小麥乳熟后，按每小區(qū)棋盤(pán)式 5點(diǎn)進(jìn)行病害調(diào)查，每點(diǎn)調(diào)查麥穗不少于100穗。赤霉病病級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)和病情指數(shù)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)按國(guó)標(biāo)GB/T 15769-2011。防治效果計(jì)算方法：防治效果（%）＝（對(duì)照區(qū)藥后病情指數(shù)—處理區(qū)藥后病情指數(shù)）/對(duì)照區(qū)藥后病情指數(shù)×100。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS 17.10軟件進(jìn)行Duncan新復(fù)極差法分析。

1.6 基因組的測(cè)序及生防機(jī)制分析

取方法1.2中hzq1601菌液以3%（v/v）接種量于100 mL LB液中28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)6 h后，以5000 r/min 離心10 min收集菌體，并將菌體置于干冰中送上海歐易生物有限公司進(jìn)行基因組測(cè)序。建庫(kù)測(cè)序、基因組組裝及基因組特征分析均由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇分析采用antiSMASH（http://antismash.secondarymetabolites.org/）軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株hzq1601對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果

經(jīng)平皿對(duì)峙培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)分離自稻茬的細(xì)菌 hzq1601對(duì)禾谷鐮刀菌具有良好的拮抗效果（圖 1A），表明菌株hzq1601可分泌抑菌活性物質(zhì)。將菌株hzq1601在LB培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)72 h后過(guò)濾除菌后用于抑菌效果測(cè)定，結(jié)果顯示禾谷鐮刀菌在含5% hzq1601無(wú)菌濾液的PDA平板上生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，相對(duì)生長(zhǎng)抑菌率達(dá)到85.8%（圖1B）。

圖1 菌株hzq1601抑菌效果測(cè)定Fig.1 Detection of antagonistic activity of the strain hzq1601

2.2 菌株hzq1601鑒定

2.2.1 菌株hzq1601生理生化指標(biāo)測(cè)定 菌株hzq1601在NA平板30 ℃培養(yǎng)24 h后，菌落形態(tài)都呈灰白色不透明，菌落表面隆起似毛玻璃狀，邊緣整齊（圖2A）。菌株hzq1601為革蘭氏陽(yáng)性菌（圖2B），在NaCl含量7%、pH 5.7和厭氧條件下均能生長(zhǎng)。V-P反應(yīng)、檸檬酸鹽利用、D-木糖利用、明膠液化、硝酸鹽還原、淀粉水解為陽(yáng)性；丙酸鹽利用、L-阿拉伯糖利用、D-甘露醇利用等為陰性（表1）。

表1 菌株hzq1601生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characters of strain hzq1601

圖2 菌株hzq1601菌落形態(tài)和革蘭氏染色Fig.2 Colony morphology and Gram staining of the strain hzq1601

2.2.2 16S rDNA和gyrB基因序列擴(kuò)增與分析 提取菌株hzq1601的基因組 DNA，以其為模板分別擴(kuò)增16S rDNA和gyrB基因片段，電泳結(jié)果顯示分別擴(kuò)增到大小約1500和1200 bp的特征性條帶。經(jīng)切膠回收后送公司測(cè)序，將結(jié)果序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)分別獲得登錄號(hào)OM108303和OM303790，并在 NCBI 網(wǎng)站用 BLAST 程序進(jìn)行檢索，結(jié)果顯示菌株hzq1601的16S rDNA序列與解淀粉芽胞桿菌BA31相似性為99%，gyrB基因序列與解淀粉芽胞桿菌CAUB946相似性100%。基于16S rDNA 和gyrB基因序列，應(yīng)用MEGA 10軟件與解淀粉芽胞桿菌FZB42、DSM7、B.subtilis168、B.atrophaeus1942、B.licheniformisATCC 14580、B.pumilusSAFR-032和B.cereusATCC 14579等菌株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示菌株hzq1601與模式菌株解淀粉芽胞桿菌親緣關(guān)系最近（圖3，4）。由此，將菌株hzq1601鑒定為解淀粉芽胞桿菌。

圖3 基于16S rDNA序列構(gòu)建菌株hzq1601系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of the strain hzq1601 based on 16S rDNA sequence

圖4 基于gyrB基因序列構(gòu)建菌株hzq1601系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of the strain hzq1601 based on gyrB gene sequence

2.3 菌株hzq1601與多菌靈相容性分析

為了明確多菌靈是否對(duì)生防細(xì)菌的存活存在影響，將菌株hzq1601與多菌靈配制成菌藥混合液，靜置處理1、2、4和8 d后，分別檢測(cè)菌藥混合液中細(xì)菌存活數(shù)量。結(jié)果顯示，與去離子水處理對(duì)照相比較，菌藥混合液靜置處理1 d后，多菌靈的存在使得菌株hzq1601存活率下降27.6%～35.8%；但含多菌靈的處理間菌株hzq1601的存活情況無(wú)明顯差異。當(dāng)菌藥?kù)o置處理2、4和8 d后，含多菌靈各處理與清水對(duì)照相比菌株hzq1601存活率也無(wú)明顯差異，且各樣品中菌株 hzq1601活菌量均在 105cfu/mL以上（圖5）。結(jié)果表明，當(dāng)多菌靈劑量在低于1000 mg/L的條件下，菌株hzq1601與藥液相容性較好。

圖5 菌株hzq1601與多菌靈的相容性Fig.5 Compatibility of the strain hzq1601 with fungicide carbendazim

2.4 菌株hzq1601對(duì)小麥赤霉病的田間防治效果

以108cfu/mL的hzq1601培養(yǎng)液和50%多菌靈可濕性粉劑協(xié)同，設(shè)計(jì)了7個(gè)處理進(jìn)行小麥赤霉病田間防治試驗(yàn)，結(jié)果顯示50%多菌靈可濕性粉劑（100 g/667 m2）進(jìn)行2次噴霧處理防效在85.1%；菌株hzq1601培養(yǎng)液對(duì)小麥赤霉病防效為55.6%（表2）。菌株hzq1601分別與50%多菌靈可濕性粉劑80 g/667 m2或70 g/667 m2協(xié)同施用，對(duì)赤霉病防效分別在87.5%和81.0%，均顯著高于相應(yīng)的單獨(dú)使用多菌靈的處理，且與50%多菌靈可濕性粉劑（100 g/667 m2）處理無(wú)顯著性差異。

表2 菌株hzq1601與多菌靈協(xié)同對(duì)小麥赤霉病的防效Table 2 Control effect of the strain hzq1601 combined application of carbendazim on wheat fusarium head blight

2.5 基因組組裝及抑菌機(jī)制分析

菌株hzq1601基因組測(cè)序結(jié)果顯示，其含有1條4290856 bp大小的染色體，與其他已知芽胞桿菌基因組數(shù)據(jù)相比，略大于B.amyloliquefaciensFZB42基因組（3918589 bp），與B.subtilis168基因組（4214630 bp）相當(dāng)（表3）。編碼基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，菌株hzq1601基因組共編碼基因 4231個(gè)，其中3個(gè)菌株共有的基因2889個(gè)。以蛋白編碼基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，解淀粉芽胞桿菌hzq1601與解淀粉芽胞桿菌FZB42的親緣關(guān)系較近。

表3 菌株hzq1601基因組特征及與其他芽胞桿菌基因組序列比較Table 3 Genomic features of the strain hzq1601 genome and comparison with genomes of other Bacillus spp.

為了揭示解淀粉芽胞桿菌 hzq1601是否存在具有抑菌活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，將基因組序列提交antiSMASH平臺(tái)，進(jìn)行代謝產(chǎn)物編碼基因的同源性分析，結(jié)果（表4）顯示菌株hzq1601攜有13個(gè)次生代謝產(chǎn)物合成基因簇，其中8個(gè)能找到已鑒定的基因簇，100%相似的有bacilysin、bacillibactin、difficidin、fengycin、bacillaene和macrolactinH等合成基因簇；另外2個(gè)為surfactin編碼基因簇和bustirosin編碼基因簇，但相似度分別僅為 82%和7%。其他5個(gè)編碼未知次生代謝產(chǎn)物的基因簇，初步預(yù)測(cè)為2 種萜烯類(lèi)物質(zhì)、2種硫肽類(lèi)物質(zhì)和1個(gè)T3PKS合成途徑產(chǎn)物。

表4 菌株hzq1601次生代謝產(chǎn)物合成區(qū)域鑒定結(jié)果Table 4 Identified secondary metabolite regions in the strain hzq1601 genome

3 討論

植物病害生防菌因其高度的環(huán)境友好性而具有良好的應(yīng)用前景。以枯草芽胞桿菌、蠟質(zhì)芽胞桿菌和多粘類(lèi)芽胞桿菌為主要成分的生防菌劑已經(jīng)在小麥赤霉病防治應(yīng)用中取得了一定的效果[10,11]，但是面對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展的新要求，高效生防菌劑和配套應(yīng)用技術(shù)的研發(fā)仍然是當(dāng)前小麥赤霉病綠色防控的迫切需求和長(zhǎng)遠(yuǎn)需要。篩選對(duì)赤霉病菌具有高生防活性的微生物是生防菌劑開(kāi)發(fā)的前提。解淀粉芽胞桿菌分布廣泛，因其可產(chǎn)生豐富的具有生防活性的次生代謝物、植物促生作用和環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，極具生防菌劑開(kāi)發(fā)潛力[12-14]。近年來(lái)。國(guó)內(nèi)學(xué)者從土壤、小麥、中草藥植株等材料中篩選出對(duì)小麥赤霉病具有生物活性的解淀粉芽胞桿菌菌株[15-18]，鑒定出對(duì)禾谷鐮刀菌有效的拮抗物質(zhì)macrolactin A和subtilisin等[17,19]。本研究獲得的解淀粉芽胞桿菌hzq1601對(duì)禾谷鐮刀菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，基因組含有6種已知的次生代謝產(chǎn)物合成基因簇，這些次生代謝產(chǎn)物已經(jīng)被證明具有拮抗植物病原菌、誘導(dǎo)抗病性、促進(jìn)生物膜形成等功能[20-26]，但在菌株hzq1601中這些物質(zhì)是否與其對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌活性有關(guān)仍需驗(yàn)證。多種次生代謝產(chǎn)物合成基因簇在菌株hzq1601中出現(xiàn)，也說(shuō)明其可能存在較寬的抑菌譜，在植物病害防控中也將有更為廣泛的應(yīng)用前景。

由于自然環(huán)境的不可控性，生物菌劑田間使用時(shí)對(duì)病害的防治效果易受環(huán)境影響。研究發(fā)現(xiàn)生防菌劑與化學(xué)藥劑協(xié)同可有效提高生防菌的防治效果[27-31]，這可能與部分化學(xué)殺菌劑可通過(guò)弱化病菌而間接正向調(diào)控生防菌的原因有關(guān)[32]。但是，生防菌劑與化學(xué)藥劑混用并不總是產(chǎn)生正向效果，生防菌的存活或者其生物活性也可能受化學(xué)藥劑的負(fù)面影響。因此，如果能正確地篩選出生防菌與化學(xué)藥劑協(xié)同組合，不僅可以發(fā)揮生防菌防病效果，也可有效減少化學(xué)藥劑的用量。本研究結(jié)果顯示菌株hzq1601與多菌靈具有較好的相容性，田間防效也顯示菌株hzq1601與多菌靈協(xié)同使用在確保防效的前提下可大幅降低了多菌靈的用量。考慮到后續(xù)菌劑研發(fā)和應(yīng)用，菌株hzq1601與多菌靈復(fù)配將能更好發(fā)揮其對(duì)小麥赤霉病的生防功效。