李旎，陳撫州

南昌結(jié)石病?？漆t(yī)院，江西 南昌 330001

醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑，是我國衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)的特色之一，是醫(yī)院藥學(xué)和藥學(xué)服務(wù)的重要組成部分［1］。醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥制劑是中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)積累的特殊產(chǎn)物,加強(qiáng)中藥制劑質(zhì)量管理，為醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑臨床療效、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、制劑安全使用等研究提供了有效的技術(shù)支撐［2］。

利膽排石糖漿為純中藥制劑，是由茵陳、虎杖、人工牛黃、枳殼等制成的糖漿劑，為南昌結(jié)石病?？漆t(yī)院制劑（贛藥制字Z20090054）。具清熱除濕、消炎利膽的功效，用于肝膽管結(jié)石、膽囊結(jié)石、甲肝黃疸等，經(jīng)過幾十年的臨床應(yīng)用，安全穩(wěn)定，療效確切。制劑原標(biāo)準(zhǔn)以虎杖藥材中大黃素的薄層色譜鑒別及制劑通則中糖漿劑要求為主，為更好地控制制劑質(zhì)量，現(xiàn)增加對(duì)人工牛黃、枳殼藥材的薄層色譜鑒別及制劑中綠原酸的含量測(cè)定。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT 型液相色譜儀；島津ODS-3 C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；超聲波清洗器；分析天平；三用紫外線分析儀；臺(tái)式高速離心機(jī)。

1.2 試劑與試藥

對(duì)照品：膽酸（10078-201415）；新橙皮苷（111857-201804，99.4 %）；柚皮苷（110722-201815，91.7 %）；綠原酸（110753-201817，96.1 %）均來自中國食品藥品檢定研究院。甲醇（20115029），乙腈（21015166）均為色譜純；其他試劑均為分析純。利膽排石糖漿（201111、201112、210623、210624、210625）。

2 薄層色譜鑒別方法與結(jié)果

2.1 人工牛黃

用10 mL 量筒量取10 mL 樣品，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入30 mL 乙醇，密塞，搖勻，放入超聲儀內(nèi)，超聲處理30 min，冷卻后搖勻，離心，取上清液作為供試品溶液。采用同法對(duì)未添加人工牛黃的樣品進(jìn)行處理，得陰性對(duì)照液。稱取適量的膽酸對(duì)照品，加入甲醇，制得濃度為每l mL 含l mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取以上三種溶液各5 μL，點(diǎn)樣于同一硅膠G 薄層板上，以正已烷-乙酸乙酯-甲醇-醋酸（20∶25∶3∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，用10 %磷鉬酸乙醇溶液做顯色劑，均勻噴灑，放入恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，于105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰，在日光下觀察色譜情況［3］。色譜圖可見清晰的膽酸斑點(diǎn)，且分離度好，陰性無干擾，見圖1。

圖1 人工牛黃薄層色譜圖：1～3.三批供試品；4.膽酸對(duì)照品；5.陰性樣品

2.2 枳殼

用25 mL 量筒量取20 mL 樣品，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL 95%乙醇，密塞，搖勻，放入超聲儀內(nèi)，超聲處理30 min，冷卻后搖勻，離心，取上清液作為供試品溶液。采用同法對(duì)未添加枳殼藥材的樣品進(jìn)行處理，制得陰性對(duì)照液。稱取適量的新橙皮苷、柚皮苷的對(duì)照品，加入甲醇，得濃度為每l mL 各含l mg 的混合溶液，作為混合對(duì)照品溶液。分別吸取供上述三種溶液各3 μL，點(diǎn)于同一塊硅膠G 薄層板上，展開劑為三氯甲烷-甲醇-水（35∶17∶5）于10 ℃以下放置過夜的下層溶液，展開，取出晾干，均勻噴灑3%三氯化鋁乙醇溶液，放入恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，在100～105 ℃下加熱數(shù)分鐘后，于365 nm 紫外燈下觀察色譜情況［4］。在色譜圖中，可見清晰且分離度好的新橙皮苷和柚皮苷的斑點(diǎn)，陰性無干擾，見圖2。

圖2 枳殼薄層色譜圖：1.陰性樣品；2.新橙皮苷和柚皮苷混合對(duì)照溶液；3～5.三批供試品

3 含量測(cè)定方法與結(jié)果

3.1 色譜條件

色譜柱：島津ODS-3 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A 為乙腈，流動(dòng)相B 為0.1 %磷酸溶液，梯度洗脫，見表1；檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣為10 μL。

表1 洗脫程序

3.2 溶液制備

3.2.1 對(duì)照品溶液配制 取適量綠原酸對(duì)照品，精密稱定，加入50 %甲醇，制成濃度為每1 mL 含綠原酸40 μg 的對(duì)照品溶液。

3.2.2 供試品溶液配制 取樣品約5 g，精密稱定，置50 mL 棕色容量瓶中，加入約40 mL 的50 %甲醇，密塞，超聲處理30 min，放冷后，再用50 %甲醇溶液定容至刻度，搖勻后過濾，取續(xù)濾液為供試品溶液。

3.2.3 陰性對(duì)照溶液配制 照利膽排石糖漿制劑工藝，制備未添加茵陳藥材的陰性樣品，采用“3.2.2”項(xiàng)下方法處理，得陰性對(duì)照溶液。

3.3 專屬性試驗(yàn)

按“3.1”項(xiàng)下色譜條件，分析供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液的測(cè)定結(jié)果，圖譜表明方法專屬性良好，見圖3。

圖3 綠原酸HPLC色譜圖：A為對(duì)照品；B為供試品；C為陰性對(duì)照

3.4 線性試驗(yàn)

以甲醇為稀釋劑對(duì)綠原酸對(duì)照品儲(chǔ)備液（0.409 8 mg/mL）進(jìn)行稀釋，分別得濃度為：409.8 μg/mL、81.96 μg/mL、40.98 μg/mL、16.39 μg/mL、8.196 μg/mL 的對(duì)照品溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。得峰面積（Y）-濃度（X，μg/mL）的回歸方程Y=3.275 24×10-3X-29 311.4，r=0.999 9。表明綠原酸在8.196 μg/mL～409.8 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，線性良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“3.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0 h、2 h、5 h、10 h、12 h、24 h 對(duì)同一供試品溶液進(jìn)樣分析，各時(shí)間段綠原酸峰面積RSD 為0.39%。結(jié)果可知，24 h內(nèi)溶液穩(wěn)定性良好。

3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

采用“3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，對(duì)樣品（批號(hào)210625）進(jìn)行前處理，共制備6 份，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，測(cè)得樣品中綠原酸的平均含量為0.269 5 mg/g，RSD 為2.44 %，重復(fù)性符合要求。

3.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號(hào)210625）6 份各約5 g，精密稱定，分別加入2 mL 濃度為0.658 5 mg/mL 的綠原酸對(duì)照品溶液,采用“3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

3.8 樣品的含量測(cè)定

采用“3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，分別將5 批利膽排石糖漿樣品制成供試品溶液，測(cè)定制劑中綠原酸的含量，5 批樣品的綠原酸含量范圍為0.269 5 mg/g～0.359 4 mg/g。結(jié)果見表3。

表3 樣品的含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）

4 討論

4.1 人工牛黃薄層鑒別摸索

膽酸為人工牛黃的主要成分，且性質(zhì)比較穩(wěn)定。薄層鑒別方法摸索中，考察了不同提取溶劑（三氯甲烷、95%乙醇）及不同提取方法（超聲、回流）對(duì)色譜結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)兩種方法效果均較好，考慮到方法操作簡(jiǎn)便性、經(jīng)濟(jì)性和毒性等，選擇以95%乙醇超聲提取的方法［4］。

4.2 枳殼薄層鑒別摸索

現(xiàn)代藥理學(xué)研究提示，枳殼主要含揮發(fā)油類和黃酮苷類橙皮苷等，具調(diào)節(jié)胃腸道平滑肌、升血壓、強(qiáng)心、利尿、解熱鎮(zhèn)痛等作用［5］。

試驗(yàn)中，新橙皮苷和柚皮苷斑點(diǎn)位置相近，容易出現(xiàn)斑點(diǎn)粘連情況，重點(diǎn)摸索展開劑中三氯甲烷的比例，最終得斑點(diǎn)分離情況較好的展開劑為：三氯甲烷-甲醇-水（35∶17∶5），于10 ℃以下放置過夜的下層溶液。

4.3 綠原酸的含量測(cè)定

茵陳具有利濕退黃、解毒療瘡的作用，可用于陽黃及陰黃的治療［6］?，F(xiàn)代藥理研究顯示，有保肝利膽、退黃利濕、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等藥理活性，常用于肝膽疾病的治療。其利膽成分主要是綠原酸、對(duì)羥基苯乙酮等［7-8］。HPLC 法因其高效、高分辨率等技術(shù)優(yōu)勢(shì)，已成為目前控制中藥制劑有效成分的重要手段［9］。故選擇對(duì)綠原酸的含量進(jìn)行檢測(cè)，可有效地控制質(zhì)量，進(jìn)一步保證藥品療效。通過紫外可見分光光度計(jì)對(duì)綠原酸對(duì)照品溶液波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，最大吸收波長(zhǎng)與《中國藥典》一致，確定檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm。由于利膽排石糖漿為較黏稠液體，故選擇以稱重方式稱取樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

本研究所建立的方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可用于利膽排石糖漿的質(zhì)量控制。