秦鑫鵬，包永睿，2，3，王帥，2，3，李天嬌，2，3，孟憲生，2，3

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省中藥多維分析專業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600)

急性胃炎是指急性胃黏膜病變,具有發(fā)病急促、病情蔓延速度快等特征，極大地影響了患者的生活質(zhì)量。隨著時(shí)代的快速發(fā)展，生活節(jié)奏加快，飲食不規(guī)律等導(dǎo)致急性胃炎發(fā)病率顯著提升[1-4]。目前臨床上主要用奧美拉唑治療急性胃炎[5]。奧美拉唑是一種質(zhì)子泵抑制劑，短時(shí)間便可以發(fā)揮藥效，但缺點(diǎn)也十分明顯，即有很強(qiáng)的耐藥性，一般一周左右便難以發(fā)揮藥效。而且采用奧美拉唑僅是緩解癥狀，治標(biāo)不治本。氣滯胃痛片由柴胡、枳殼、醋香附、白芍、炙甘草、醋延胡索6味藥材組成，具有疏肝理氣、和胃止痛的作用，常用于肝郁氣滯所致的胸痞脹滿,胃脘疼痛等癥[6-7],可快速緩解急性胃炎癥狀，治標(biāo)治本，在臨床上對(duì)于急性胃炎具有很好的治療效果。但是，氣滯胃痛片對(duì)急性胃炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)并不明確。

微流控芯片技術(shù)具有試劑消耗少、體積小、可精確控制流體流速等優(yōu)點(diǎn)，在分析檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)展迅速[8-9]。與傳統(tǒng) 96 孔板相比，微流控芯片可以動(dòng)態(tài)培養(yǎng)細(xì)胞和動(dòng)態(tài)給藥，更接近人體給藥實(shí)際過(guò)程，還可實(shí)現(xiàn)多組分藥物的同時(shí)篩選。因此，本研究采用微流控芯片，從細(xì)胞死亡(包括凋亡和壞死)和炎癥因子表達(dá)等角度，研究氣滯胃痛片中不同藥效組分對(duì)炎癥細(xì)胞GES-1的影響，以期明確氣滯胃痛片的抗炎藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器與設(shè)備 LSP04-1A 型精密注射泵(保定蘭格公司)；TG-2U 型光刻機(jī)(北京中科同志科技有限公司)；W2001R 型 CO2培養(yǎng)箱(美國(guó) SIM 公司)；SC-1B 型勻膠機(jī)、BP-2B 型烘膠臺(tái)(北京創(chuàng)世威納科技有限公司)；SC-1B 型勻膠機(jī)、BP-2B 型烘膠臺(tái)(北京創(chuàng)世威納科技有限公司)；NIKON ECLIPSE TI 熒光倒置顯微鏡(日本 Nikon 公司)；HPDC-32G-2 型等離子清洗機(jī)(Harrick Plasma 公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó) Molecular Drvices 公司)；Sorvall Fresco 高速離心機(jī)(美國(guó)科峻儀器公司)；圖像處理軟件 Image ProPlus 6.0 ( IPP，美國(guó) Median Cybernetics 公司)。

1.2 藥材與試劑 氣滯胃痛片(規(guī) 格：0.5 g/片， 批 號(hào)： 20220101 )由華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司提供，柴胡、枳殼、醋香附、白芍、炙甘草、醋延胡索6味藥材均經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室許亮教授依據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版鑒定為正品；黃芪甲苷對(duì)照品(成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：19092903)；細(xì)胞死活檢測(cè)試劑盒[鈣黃素Calcein-AM/碘化丙啶(PI)，北京索萊寶科技有限公司]；1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶-EDTA、胎牛血清(美國(guó)GIBCO公司)；細(xì)胞凋亡/壞死檢測(cè)試劑盒(含Hoechst 33342染液和PI，碧云天生物技術(shù)研究所)；負(fù)性環(huán)氧樹脂光刻膠 SU-8 及顯影液(美國(guó)Micro-Chem公司)；青霉素/鏈霉素混合溶液(美國(guó)Hyclone公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，北京索萊寶科技有限公司)；TNF-α含量檢測(cè)試劑盒(美捷科技有限公司)；CCK-8增強(qiáng)型溶液(Meilunbio公司)。

1.3 細(xì)胞株 人胃黏膜細(xì)胞GES-1購(gòu)自上海艾研生物科技有限公司。

2 方法

2.1 氣滯胃痛片各組分的選擇 依據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研，氣滯胃痛片中柴胡皂苷[10-11]、枳殼黃酮[12-13]、香附黃酮[14-15]、白芍皂苷[16]、甘草黃酮[17-18]、延胡索生物堿[19]6個(gè)藥效組分報(bào)道較為廣泛，推測(cè)可能與炎癥相關(guān)，因此本研究選擇這6組組分作為可能的抗炎藥效組分，進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 氣滯胃痛片各組分的制備

2.2.1 柴胡皂苷 依據(jù)池雪潔等[20]的方法提取純化柴胡皂苷，將柴胡皂苷提取液用D101大孔樹脂分離洗脫，洗脫液水浴加熱濃縮至近干，減壓干燥，加入培養(yǎng)基配制成柴胡皂苷培養(yǎng)液。

2.2.2 枳殼黃酮 依據(jù)傅華強(qiáng)等[21]的方法提取純化枳殼黃酮，將枳殼黃酮提取液用AB-8型大孔樹脂分離洗脫，后續(xù)配備溶液方法同“2.2.1”項(xiàng)下。

2.2.3 香附黃酮 依據(jù)趙洪超[22]的方法提取純化香附黃酮，將香附黃酮提取液用AB-8型大孔樹脂分離洗脫，后續(xù)配備溶液方法同“2.2.1”項(xiàng)下。

2.2.4 白芍皂苷 依據(jù)陳佳亮[23]的方法提取純化白芍皂苷，將白芍皂苷提取液用AB-8型大孔樹脂分離洗脫，后續(xù)配備溶液方法同“2.2.1”項(xiàng)下。

2.2.5 甘草黃酮 依據(jù)康彤[24]的方法提取純化甘草黃酮，將柴胡皂苷提取液用D101大孔樹脂分離洗脫，后續(xù)配備溶液方法同“2.2.1”項(xiàng)下。

2.2.6 延胡索生物堿 依據(jù)孫靜等[25]的方法提取純化延胡索生物堿，將延胡索生物堿提取液用 732 型陽(yáng)離子交換樹脂分離洗脫，后續(xù)配備溶液方法同“2.2.1”項(xiàng)下。

2.3 溶液的配制

2.3.1 陽(yáng)性藥配制 取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加入 1640 培養(yǎng)基配制成 0.1 mg·mL- 1的溶液，超聲 15 min助溶，過(guò) 0.22 μm微孔濾膜即得，4 ℃保存?zhèn)溆肹26]。

2.3.2 含藥培養(yǎng)液的配制 依據(jù)馮峰等[27-28]的方法篩選安全給藥濃度，確保細(xì)胞數(shù)目在給藥前后無(wú)明顯變化，便于 TNF-α炎癥因子的含量檢測(cè)和細(xì)胞凋亡壞死研究。稱取適量氣滯胃痛片及上述 6 個(gè)組分，依據(jù)“2.5”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果配制各藥物濃度，即：加入 1640 培養(yǎng)基分別配制成 0.05 mg·mL- 1復(fù)方含藥培養(yǎng)液、0.2 mg·mL- 1柴胡皂苷含藥培養(yǎng)液、0.05 mg·mL- 1枳殼黃酮含藥培養(yǎng)液、0.1 mg·mL- 1香附黃酮含藥培養(yǎng)液、0.01 mg·mL- 1白芍皂苷含藥培養(yǎng)液、0.01 mg·mL- 1甘草黃酮含藥培養(yǎng)液、0.05 mg·mL- 1延胡索生物堿含藥培養(yǎng)液。

2.4 LPS誘導(dǎo)GES-1體外炎癥模型的建立 將GES-1細(xì)胞以每孔 1×104接種于96孔板內(nèi)，置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng) 24 h ，棄上清并設(shè)立空白對(duì)照組及 LPS梯度濃度組(0.005、0.01、 0.1、0.25、0.5、1、2、5、10、50 μg·mL- 1)[29-30]，每組設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔，給藥后繼續(xù)避光培養(yǎng)24 h，采用CCK-8法，用酶標(biāo)儀在 450 nm 處測(cè)定吸光度(OD)。細(xì)胞存活抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%，計(jì)算 IC50并篩選最佳造模濃度。

2.5 各組藥物的細(xì)胞毒性和最佳給藥濃度 按“2.4”項(xiàng)下培養(yǎng)方法常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，棄上清，并設(shè)立空白對(duì)照組、陽(yáng)性藥、組分給藥組(每組的組分給藥梯度均為0.01、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg·mL- 1)，每組設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔，各組分別給藥 100 μL 樣品溶液，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，采用 CCK-8 法用酶標(biāo)儀在 450 nm 處測(cè)定OD值，并按照“2.4”項(xiàng)下方法計(jì)算給藥組分對(duì)細(xì)胞存活的影響，以對(duì)細(xì)胞無(wú)增殖作用且抑制率小于5%為指標(biāo)，篩選最佳給藥濃度。

2.6 各組藥物對(duì)炎癥細(xì)胞GES-1合成分泌TNF-α含量的影響 按“2.4”項(xiàng)下培養(yǎng)方法常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，棄上清，并按照“2.4”“2.5”項(xiàng)下篩選的最佳造模和最佳給藥濃度設(shè)立空白組、炎癥模型組、陽(yáng)性藥組及組分給藥組，各組分別每孔給藥 100 μL(陽(yáng)性藥組和給藥組分組終濃度符合“2.4”“2.5”項(xiàng)下篩選濃度)，空白組給1640培養(yǎng)基 100 μL，除空白組外，其余各組均給予LPS進(jìn)行造模，避光培養(yǎng)24 h后，各組分別取上清，離心去雜，吸取上清液，按照 TNF-α試劑盒的步驟測(cè)量炎癥因子的含量。

2.7 芯片的設(shè)計(jì)與制作 本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建一種集成有微閥結(jié)構(gòu)的高通量藥物篩選芯片，形似雪花稱為“雪花芯片”，該芯片分為上、中、下三個(gè)部分，上部為微閥控制層，中部為流體通道層，下部為玻璃基底層。最外圍 18 個(gè)紅色孔為細(xì)胞及藥物入口，半徑為 1.8 mm；中部白色橢圓孔為細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)，由 3×6 組培養(yǎng)通道構(gòu)成，每組設(shè) 4 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)腔為橢圓形，孔徑為 1.2 mm×0.9 mm，每3個(gè)小組之間有一個(gè)白色圓孔，可以作為廢液收集口；最中間的藍(lán)色孔為共用廢液口及細(xì)胞入口。整體芯片尺寸為長(zhǎng) 5 cm，寬 5 cm，厚度約為 0.8 cm，示意圖見圖1。

圖1 微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖

雪花芯片基于實(shí)驗(yàn)室前期研究方法[31-33]進(jìn)行制作。閥層通過(guò)液壓的方式隔絕其他組別之間的干擾，可以由外圍紅色孔給不同濃度的藥液，于中心藍(lán)色孔收集廢液，也可以由藍(lán)色孔給予藥液，紅色孔收集廢液作后續(xù)研究。每組4個(gè)復(fù)孔作為平行實(shí)驗(yàn)，也可以4個(gè)復(fù)孔作為一組，與其他組作平行實(shí)驗(yàn)。該芯片特點(diǎn)是正向反向可以同時(shí)使用，可按照實(shí)驗(yàn)的需要自由選擇。中心藍(lán)色孔可以作為總?cè)肟?，通入?xì)胞以及培養(yǎng)液等，均可由該孔一并完成，操作方便快捷，滿足氣滯胃痛片抗炎多組分的要求。該芯片可用于細(xì)胞培養(yǎng)、藥效篩選、作用機(jī)制等研究，實(shí)物圖見圖2。

圖2 微流控芯片實(shí)物圖

2.8 芯片的預(yù)處理[34-35]向芯片流體通道內(nèi)通入75%乙醇清洗10 min，再用無(wú)菌超純水沖洗通道數(shù)次直至無(wú)乙醇?xì)埩?，?0 ℃加熱烘干，置于細(xì)胞超凈臺(tái)中紫外照射 30 min滅菌后即可使用。

2.9 芯片中GES-1細(xì)胞培養(yǎng)及生長(zhǎng)狀態(tài)考察 按“2.4”項(xiàng)下培養(yǎng)方法常規(guī)培養(yǎng)GES-1細(xì)胞，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/cm2,接種于微流控芯片中，待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)液以1 μL· min-1的流速通過(guò)精密注射泵注入芯片中進(jìn)行動(dòng)態(tài)培養(yǎng)。細(xì)胞在培養(yǎng) 24、 48、72 h后分別用活死試劑盒對(duì)其染色，檢測(cè)GES-1細(xì)胞活力，綠色為存活細(xì)胞，細(xì)胞存活率(%)=活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

2.10 氣滯胃痛方中各組分對(duì)芯片中炎癥細(xì)胞GES-1的凋亡和壞死作用 本實(shí)驗(yàn)以該芯片一條通路上的4個(gè)復(fù)孔為一組，與其他組作平行實(shí)驗(yàn)，按“2.4”和“2.9”項(xiàng)下方法培養(yǎng)細(xì)胞并接種于微流控芯片動(dòng)態(tài)培養(yǎng) 24 h 后，以1 μL· min-1的流速通過(guò)精密注射泵向模型組注入 0.005 μg·mL-1脂多糖(LPS)溶液動(dòng)態(tài)培養(yǎng)24 h，以1 μL· min-1的流速通過(guò)精密注射泵向組分給藥組注入終濃度符合“2.4”“2.5”項(xiàng)下篩選濃度的溶液動(dòng)態(tài)培養(yǎng) 24 h，以 1 μL· min-1的流速通過(guò)精密注射泵向空白組注入1640 培養(yǎng)基動(dòng)態(tài)培養(yǎng) 24 h后，用Hoechst 33342/PI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙染。

3 結(jié)果

3.1 各組造模以及最佳給藥濃度和 TNF-α炎癥表達(dá) 分別按“2.4”“2.5”“2.6”項(xiàng)下方法進(jìn)行細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)和給藥刺激，經(jīng)過(guò) SPSS 26.0軟件對(duì)脂多糖(LPS)梯度和細(xì)胞存活抑制率進(jìn)行預(yù)測(cè)，測(cè)得脂多糖(LPS)IC50為0.006 μg·mL- 1，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置多個(gè)梯度，其中脂多糖(LPS)濃度為 0.01 μg·mL- 1時(shí)抑制率為50.42%，滿足實(shí)驗(yàn)要求。為便于配制溶液，最終采用 0.01 μg·mL- 1脂多糖(LPS)濃度為最佳造模濃度；TNF-α炎癥表達(dá)按照試劑盒步驟嚴(yán)格操作，最佳給藥濃度以及TNF-α 炎癥表達(dá)(見表1)。根據(jù)結(jié)果可得各組炎癥因子含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.001 3X+0.065 3(線性范圍：31.5～1 000 pg·mL- 1)，R2=0.997 2 ，各組與模型組相比均具有較好的抑制作用，炎癥因子含量明顯降低，且結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中甘草黃酮和延胡索生物堿這兩組的藥效最好，炎癥表達(dá)與模型組相比差異顯著(P<0.01)，效果最好，藥物各組分作用于炎癥細(xì)胞GES-1后炎癥因子的含量(見圖3)。

圖3 藥物各組分作用于炎癥細(xì)胞GES-1后炎癥因子的含量 注：圖中橙色表示與模型組相比差異極顯著(即P<0.01)

3.2 芯片中GES-1細(xì)胞生長(zhǎng)活力檢測(cè) 按“2.4”項(xiàng)下培養(yǎng)方法常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，調(diào)整細(xì)胞密度后接種于微流控芯片中，一般2～ 4 h即基本貼壁，培養(yǎng)24、48、72 h后細(xì)胞形態(tài)正常，生長(zhǎng)良好，細(xì)胞存活率90%以上，芯片觀察示意圖，如圖4所示。不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活死檢測(cè)試劑盒熒光圖片，如圖5所示。

圖4 芯片觀察示意圖

圖5 不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活死檢測(cè)試劑盒熒光圖片

3.3 芯片中氣滯胃痛片及各組分對(duì)炎癥細(xì)胞GES-1的促凋亡和壞死的作用 按“2.10”項(xiàng)下方法培養(yǎng)細(xì)胞并進(jìn)行熒光染色后，通過(guò)熒光倒置顯微鏡拍攝結(jié)果，藍(lán)色為凋亡細(xì)胞，紅色為壞死細(xì)胞，熒光結(jié)果見圖6。將結(jié)果導(dǎo)入Image Pro Plus 6.0 分析計(jì)算凋亡壞死率，凋亡壞死率=(凋亡細(xì)胞數(shù)+壞死細(xì)胞數(shù))/總細(xì)胞數(shù)，根據(jù)結(jié)果可知，各組與模型組相比均明顯抑制了細(xì)胞的凋亡壞死，結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且氣滯胃痛片、甘草黃酮和延胡索生物堿這三組抑制率最好，與空白組相比，凋亡壞死率無(wú)明顯差異(P≥0.05)，可認(rèn)為這三組細(xì)胞已基本恢復(fù)正常，結(jié)果見表1。

表1 各組細(xì)胞凋亡壞死率、炎癥因子含量和最佳給藥濃度結(jié)果表

圖6 各組作用于GES-1細(xì)胞24 h的Hoechst 33342/PI雙染熒光圖

4 討論

微流控技術(shù)在體外藥效篩選、顯微熒光分析等方面具有較好的應(yīng)用，隨著研究技術(shù)、圖像處理分析技術(shù)的不斷發(fā)展，微流控技術(shù)在炎癥藥效篩選方面展現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景。本文設(shè)計(jì)了“雪花”芯片，整體形似雪花狀，特點(diǎn)是可以正向和反向同時(shí)使用。本芯片安裝有液壓閥，在閥層通入液體即產(chǎn)生形變，阻斷通道內(nèi)液體的流動(dòng)，其他通道內(nèi)液體流動(dòng)則不受影響，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)組別數(shù)量以及給藥濃度的不同進(jìn)行合理安排?！把┗ā毙酒瑑?nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)良好，并且與傳統(tǒng)96 孔板相比細(xì)胞以及給藥過(guò)程更接近真實(shí)人體，同時(shí)雪花芯片能滿足氣滯胃痛片及其組分抗炎癥多組分的同時(shí)篩選，結(jié)合熒光影像和圖片分析技術(shù)對(duì)于抗炎的藥效篩選大有裨益。

根據(jù)模型組凋亡和壞死的結(jié)果可知，細(xì)胞的凋亡和壞死數(shù)目較多，而在甘草黃酮和延胡索生物堿組中，僅見少量凋亡，壞死情況極少，結(jié)合邵敬寶等[36-37]的研究發(fā)現(xiàn)，甘草黃酮和生物堿不僅具有較好的抗炎作用，還具有極好地鎮(zhèn)痛作用，因此細(xì)胞凋亡和壞死情況大大緩解，細(xì)胞壞死緩解尤為明顯。香附黃酮、枳殼黃酮、柴胡皂苷和白芍皂苷也具有較好的作用，凋亡和壞死情況與模型組相比緩解明顯，但是壞死情況與甘草黃酮和延胡索生物堿相比仍有差距，尤其是白芍皂苷和香附黃酮，壞死情況與其他組差距明顯，推測(cè)其抗炎效果較好，但鎮(zhèn)痛作用未能與其他組分達(dá)到同一水平。

本文通過(guò)TNF-α 試劑盒和 Hoechst 33342/PI 雙染法對(duì)氣滯胃痛片和不同藥效組分抗炎作用進(jìn)行研究，根據(jù)結(jié)果可知甘草黃酮和延胡索生物堿這兩組在治療炎癥方面的藥效最好，炎癥因子的含量和炎癥細(xì)胞GES-1凋亡壞死率均明顯降低，與模型組相比差異顯著(P<0.01)，香附黃酮、柴胡皂苷等其他組分與模型組相比(P<0.05)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有較好的療效。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)基于微流控芯片技術(shù)，研究氣滯胃痛片中有效組分對(duì)于細(xì)胞炎癥的藥效作用，初步明確了初步明確了氣滯胃痛片對(duì)GES-1 炎癥細(xì)胞的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)；同時(shí)設(shè)計(jì)了一塊微流控芯片，可以更真實(shí)的模擬人體環(huán)境，正向反向同時(shí)快速篩選藥效，方便快捷，操作簡(jiǎn)便。