漆欣筑，祝晶，何劼毅，聶鵬

(貴州省食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 貴陽(yáng) 550004)

替格瑞洛是一種新型環(huán)戊基三唑嘧啶類口服抗血小板藥物，可通過(guò)激活P2Y12受體，可逆性地阻滯ADP介導(dǎo)的血小板活化和聚集，有效抑制動(dòng)脈粥樣硬化[1-3]。國(guó)際多中心PLATO 研究結(jié)果顯示，替格瑞洛彌補(bǔ)了氯吡格雷抗血小板作用起效慢、個(gè)體差異性大等不足[4]。替格瑞洛于2010年12月由阿斯利康公司率先研制而成，2011年獲美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于急性冠狀動(dòng)脈綜合征的治療[5]。替格瑞洛結(jié)構(gòu)式為(1S,2S,3R,5S)-3-(7-{[(1R,2S) -2-(3,4-二氟苯基)環(huán)丙基]氨基}-5-(硫丙基) -3H-(1,2,3)三唑( 4,5-d)嘧啶-3-基) -5-(2-羥基乙氧基)環(huán)戊烷-1,2-二醇[6]，具有6個(gè)不對(duì)稱手性中心[7]，理論上將可能產(chǎn)生64種對(duì)映異構(gòu)體[8]，但在實(shí)際合成過(guò)程中，只存在7種含量相對(duì)較大的異構(gòu)體(見(jiàn)圖1)。

圖1 替格瑞洛各異構(gòu)體

目前替格瑞洛已在全球超過(guò)85個(gè)國(guó)家獲批上市，于2012年在中國(guó)獲批上市。截至目前，該藥在產(chǎn)廠家共有22家，共計(jì)40個(gè)批文，國(guó)內(nèi)共有8家生產(chǎn)企業(yè)自擬了相關(guān)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。由于各企業(yè)的合成方法和生產(chǎn)環(huán)節(jié)不一致，其控制的檢驗(yàn)項(xiàng)目和限定參數(shù)均存在較大差異,其中僅有兩個(gè)廠家對(duì)異構(gòu)體的含量進(jìn)行了控制。我們從臨床用藥安全的角度出發(fā)，認(rèn)為有必要對(duì)該系列異構(gòu)體的毒性進(jìn)行全面評(píng)價(jià)，同時(shí)構(gòu)建7個(gè)異構(gòu)體的統(tǒng)一檢驗(yàn)分析方法，并對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)試驗(yàn)研究；最后，基于我們建立的分析方法，對(duì)目前中國(guó)市場(chǎng)上在售的8個(gè)廠家生產(chǎn)的共計(jì)179批次替格瑞洛片的異構(gòu)體進(jìn)行含量分析。

1 軟件、儀器與試藥

1.1 軟件版本 ADMET 性質(zhì)預(yù)測(cè)軟件ADMET PredictorTM(Version 10.0,美國(guó)Simulations Plus公司)；Gastroplus數(shù)據(jù)庫(kù)(Version 9.8.2000)。

1.2 儀器 高效液相色譜儀(型號(hào)：e2695，美國(guó)Waters公司)；XS-205型電子分析天平(瑞士梅特勒公司)；超聲儀(型號(hào)：KQ-500DE，昆山市超聲儀器有限公司)；純水機(jī)(UPL-I-30EZ，四川優(yōu)普超純科技有限公司)。

1.3 試藥試劑 乙腈(批號(hào)：20025138，美國(guó)TEDIA試劑公司)；甲醇(批號(hào)：21015240，美國(guó)TEDIA試劑公司)；正己烷(批號(hào)：160830，昌泰興業(yè)有限公司)；無(wú)水乙醇(批號(hào)：210302，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；三氟乙酸(批號(hào)：20210503，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；替格瑞洛對(duì)照品(批號(hào)：430050-202101，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；替格瑞洛7個(gè)異構(gòu)體對(duì)照品均來(lái)源于Sinco Pharmachem；自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 毒理預(yù)測(cè)結(jié)果 從總體情況看，替格瑞洛該系列異構(gòu)體的毒性預(yù)測(cè)打分均低于2.0，即毒性較小。但各異構(gòu)體生不良反應(yīng)的可能性都較高，應(yīng)注意控制劑量，最大推薦治療劑量MaxRTD(針對(duì)一般成年人體)需低于3.16 mg·(kg·d)-1。該系列異構(gòu)體在環(huán)境毒性、內(nèi)分泌毒性、心臟毒性、急性毒性、基因毒性方面均無(wú)相關(guān)毒性。過(guò)敏性預(yù)測(cè)方面，均無(wú)呼吸過(guò)敏性。致癌性預(yù)測(cè)方面(Rat TD50和Mouse TD50)，均有產(chǎn)生小鼠致癌性的可能。生殖毒性預(yù)測(cè)方面(Repro Tox)，異構(gòu)體Y2有產(chǎn)生生殖毒性的可能性。肝臟不良反應(yīng)預(yù)測(cè)方面，各雜質(zhì)均有潛在的肝臟毒性(見(jiàn)表1)。

表1 異構(gòu)體毒理評(píng)價(jià)預(yù)測(cè)結(jié)果

2.2 常規(guī)檢驗(yàn) 本次涉及的8個(gè)廠家中，只有兩個(gè)廠家(廠家A與廠家B)的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)制劑中的異構(gòu)體含量進(jìn)行了控制。其中廠家A控制了Y1和Y2(限度均為≤0.2%)，廠家B控制Y1、Y2和Y2′(限度Y1≤0.2%，Y2+Y2′≤0.2%)。有5個(gè)廠家(廠家C、D、E、F、G)的原料藥為自己合成，其中兩家企業(yè)在原料藥標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)異構(gòu)體的含量進(jìn)行了控制，各廠家原料藥標(biāo)準(zhǔn)中異構(gòu)體的含量控制具體情況見(jiàn)表2。

表2 各廠家原料藥中異構(gòu)體控制情況

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn) 在含量測(cè)定的檢驗(yàn)項(xiàng)目中，用異構(gòu)體對(duì)照品進(jìn)行試驗(yàn)，檢測(cè)異構(gòu)體是否會(huì)在檢驗(yàn)條件下，影響替格瑞洛主峰的含量。結(jié)果表示在各廠家相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的含量測(cè)定條件下，異構(gòu)體Y1、Y2和Y2′和主峰的出峰時(shí)間一致，其含量會(huì)影響主藥的含量控制。異構(gòu)體Y3、Y3′、Y4、Y4′和主峰可以分開(kāi)。

2.3.1 色譜條件 儀器及色譜條件：儀器：高效液相色譜儀Waters e2695，色譜柱：Chiralpak AD-H，流動(dòng)相：正己烷∶無(wú)水乙醇∶三氟乙酸(85∶15∶0.2)，檢測(cè)波長(zhǎng)：255 nm，柱溫：40 ℃，流速：1.0 mol·L-1，進(jìn)樣量：10 μL。

2.3.2 溶液配制 系統(tǒng)適應(yīng)性溶液的配制：分別取替格瑞洛對(duì)照品和7個(gè)異構(gòu)體對(duì)照品適量，用無(wú)水乙醇溶解并制成每1 mL含各異構(gòu)體均為10 μg，替格瑞洛為2.0 mg的混合溶液。作為系統(tǒng)適應(yīng)性溶液。

供試品溶液的配制：取本品細(xì)粉適量(約含替格瑞洛50 mg)，置100 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

對(duì)照溶液的配制：取供試品續(xù)濾液1 mL至200 mL，用無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照溶液。

2.3.3 專屬性試驗(yàn) 系統(tǒng)適應(yīng)性結(jié)果：各成分出峰順序依次為：Y4、Y3′、Y3、替格瑞洛、Y2′、Y2、Y4′、Y1。各峰之間且與主峰之間分離度符合要求，空白溶劑無(wú)干擾(見(jiàn)圖2)。

圖2 系統(tǒng)適用性圖譜

2.3.4 檢測(cè)限及定量限試驗(yàn) 定量限：各取異構(gòu)體對(duì)照品適量，用無(wú)水乙醇溶解并稀釋成每1 mL中約含各異構(gòu)體均為2 μg的溶液，調(diào)整進(jìn)樣量，得各異構(gòu)體的定量限和檢出限。此檢驗(yàn)方法能滿足含量0.001%的異構(gòu)體檢驗(yàn)(見(jiàn)表3)。

表3 各異構(gòu)體檢出限及定量限

2.3.5 異構(gòu)體含量分析 經(jīng)本方法檢測(cè)，8個(gè)廠家179批樣品中，其中廠家C、D、E、F、G、H的樣品中均未檢出，廠家A樣品中檢出Y2，廠家B樣品中檢出Y1、Y2(見(jiàn)表4)。廠家A與廠家B的3批次樣品檢驗(yàn)結(jié)果與常規(guī)檢驗(yàn)結(jié)果基本一致(見(jiàn)表5～6)。

表4 各異構(gòu)體含量

表5 廠家A 3批次樣品中的異構(gòu)體含量

表6 廠家B 3批次樣品中的異構(gòu)體含量

3 討論

根據(jù)ICH M7指導(dǎo)原則的要求，對(duì)于藥物中雜質(zhì)的毒理學(xué)研究，除采用試驗(yàn)數(shù)據(jù)外，同時(shí)也認(rèn)可(定量)構(gòu)效關(guān)系[(Q)SAR]評(píng)價(jià)結(jié)果。按照指導(dǎo)原則的要求，對(duì)于藥物的遺傳毒性雜質(zhì)，我們主要關(guān)注其致突變性。ADMET predictor分析結(jié)果顯示，替格瑞洛的各異構(gòu)體均存在不良反應(yīng)的可能性和肝臟毒性，建議各藥品生產(chǎn)企業(yè)嚴(yán)格控制該藥品攝入量。同時(shí)，各異構(gòu)體均存在引起心臟毒性和小鼠致癌的可能性，異構(gòu)體Y2可能存在生殖毒性。基于ICH M7的要求，我們有必要對(duì)該系列異構(gòu)體進(jìn)行研究和控制。但ADMET predictor在對(duì)藥物毒性進(jìn)行分析時(shí)，主要是基于該藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)中是否存在相關(guān)的毒性警示結(jié)構(gòu)，因此使用該軟件在對(duì)同分異構(gòu)體進(jìn)行毒性分析時(shí)，并不能完全區(qū)分異構(gòu)體間的不同的毒性。因此，建議藥品生產(chǎn)企業(yè)深入研究該系列異構(gòu)體的毒理學(xué)研究，重點(diǎn)關(guān)注相關(guān)異構(gòu)體和不良反應(yīng)癥狀之間的關(guān)聯(lián)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物給藥量與腫瘤生成的內(nèi)在聯(lián)系，論證異構(gòu)體控制的必要性和相關(guān)限度。

通過(guò)該高效液相方法，替格瑞洛相關(guān)異構(gòu)體與主峰和其他雜質(zhì)峰分離度良好，能在同一條件同一系統(tǒng)里區(qū)分該7個(gè)異構(gòu)體與主成分，專屬性強(qiáng)。該系列異構(gòu)體的檢測(cè)限為4～8 ng，定量限為10～16 ng，能有效辨別異構(gòu)體的種類和分析藥品中各異構(gòu)體的含量。該方法專屬性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、檢驗(yàn)效率高。經(jīng)本方法檢驗(yàn)，企業(yè)B檢出異構(gòu)體Y1，企業(yè)A、B檢出異構(gòu)體Y2，各異構(gòu)體的含量低于限度(0.1%)，均在可控范圍內(nèi)，其結(jié)果為符合規(guī)定，其他企業(yè)未檢出有關(guān)異構(gòu)體。各企業(yè)的多批次樣品的結(jié)果偏差也較小，產(chǎn)品穩(wěn)定性均較好，檢驗(yàn)同一廠家的三批次藥品，其Y1、Y2含量的偏差均較小，說(shuō)明該系列企業(yè)的合成路徑設(shè)置均較為合理，分離純化方法也較為徹底，能有效地去除原料藥中的相關(guān)異構(gòu)體雜質(zhì)。按此方法檢驗(yàn)，可有效地辨別和測(cè)定該藥品的相關(guān)異構(gòu)體，為高效檢驗(yàn)和控制該藥品的質(zhì)量提供了方法借鑒和數(shù)據(jù)支撐。