李新，劉肖瑩，蔣蕾，楊波*，彭海生*

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)藥學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

高血壓是引起冠心病和腦卒中等心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素[1]。人口老齡化的加劇以及青年群體不健康的生活飲食習(xí)慣，增加了高血壓的發(fā)病概率[2]，因此防治高血壓已成為我國(guó)公共衛(wèi)生安全的一項(xiàng)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[3]。前臨床使用的化藥降壓藥有ACEI類、β受體阻滯劑、利尿劑、鈣離子拮抗劑四大類。而在我國(guó)中醫(yī)古籍對(duì)高血壓無(wú)直接論述，而是以“眩暈”“頭痛”等進(jìn)行治療[4]，丹參-川芎-葛根是常與西藥降壓藥聯(lián)用的藥物，由丹參、川芎、葛根三味藥組成。趙健[5]研究表明，丹參-川芎-葛根和苯磺酸氨氯地平聯(lián)用，可安全有效的治療高血壓；而丹參、川芎、葛根也常用于治療高血壓的方劑中，但是丹參-川芎-葛根降血壓的機(jī)制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)最初由Hopkins[6]于2007年率先提出，從系統(tǒng)生物學(xué)角度研究并闡釋中藥作用成分及作用機(jī)制，這與傳統(tǒng)中藥通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)對(duì)機(jī)體進(jìn)行整體作用的觀點(diǎn)相一致[7]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析丹參-川芎-葛根治療高血壓的分子機(jī)制，為進(jìn)一步研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 篩選丹參、川芎、葛根活性成分及作用靶點(diǎn) 以丹參、川芎、葛根為詞條，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-like，DL)≥0.18作為條件[8]，在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP)(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.Php)篩選活性成分和作用靶點(diǎn)。在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org)，進(jìn)行靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化。以“Hypertension”為詞條，檢索Genecards(https://www.genecards.org)數(shù)據(jù)庫(kù)，得到高血壓相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2 “藥材-活性成分-靶點(diǎn)蛋白”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用Cytoscape 3.6.0版軟件，將篩選出的活性成分和靶點(diǎn)構(gòu)建“藥材-活性成分-靶點(diǎn)蛋白”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 有效成分與疾病靶點(diǎn)的韋恩圖及靶點(diǎn)蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 運(yùn)用韋恩圖數(shù)據(jù)庫(kù)(Venn Diagram，Venny)(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)合并活性成分靶點(diǎn)和高血壓相關(guān)靶點(diǎn)，獲得交集靶點(diǎn)。STRING在線分析平臺(tái)(https://string-db.org/)，選擇置信度>0.7的交集靶點(diǎn)[9]，預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，構(gòu)建抗高血壓靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 通路富集分析 用RStudio-1.4.1106進(jìn)行基因的本體(gene ontology，GO)生物學(xué)過(guò)程富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，并對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行可視化分析，建立靶點(diǎn)蛋白和通路的聯(lián)系，并構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。

1.5 分子對(duì)接 將PPI網(wǎng)絡(luò)圖中得到的核心靶點(diǎn)與活性成分進(jìn)行分子對(duì)接。在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中下載活性成分的mol2格式。從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.rcsb.org/)獲得靶蛋白的pdb格式[10]。通過(guò)AutoDock Tools 1.5.6版軟件處理靶蛋白，去除水分子，添加全氫，分離配體和受體，保存為pdbqt格式。將活性成分導(dǎo)入AutoDock Tools 1.5.6軟件，添加全氫，分配原子類型，所有柔性鍵均默認(rèn)可旋轉(zhuǎn)，保存為pdbqt格式。將處理后的靶蛋白和活性成分進(jìn)行對(duì)接，并運(yùn)用Pymol進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 丹參-川芎-葛根活性成分及作用靶點(diǎn)篩選結(jié)果 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選共獲得68個(gè)已知有效活性成分，其中丹參59個(gè)，川芎6個(gè)，葛根3個(gè)。通過(guò)Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)以相關(guān)性>10為篩選條件[11]，得到759個(gè)與高血壓相關(guān)的靶點(diǎn)?；钚猿煞忠?jiàn)表1。

表1 丹參-川芎-葛根篩選后得到的68個(gè)活性成分

表1(續(xù))

2.2 “藥材-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建結(jié)果 通過(guò)Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建藥材-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖1)。其中共包含217個(gè)節(jié)點(diǎn)(68個(gè)活性成分和146個(gè)靶點(diǎn))，1 045條線。紅色菱形代表靶點(diǎn)；藍(lán)色六邊形代表黨參活性成分；綠色六邊形代表川芎活性成分；黃色六邊形代表葛根活性成分。度值(degree)和節(jié)點(diǎn)(betweenness)與活性成分呈正相關(guān)狀態(tài)，節(jié)點(diǎn)越大，越重要[12]。

圖1 藥材-成分-靶點(diǎn)圖

2.3 有效成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)韋恩圖及PPI網(wǎng)絡(luò)的建立與分析 在Venny數(shù)據(jù)庫(kù)共獲得62個(gè)疾病和藥材的交集靶點(diǎn)(見(jiàn)圖2)。將得到的交集靶點(diǎn)，導(dǎo)入STRING在線分析平臺(tái)得到抗高血壓靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，并導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0進(jìn)行進(jìn)一步的拓?fù)浞治?見(jiàn)圖3)。最終獲得人內(nèi)皮型一氧化氮合酶(NOS3)、蛋白激酶Bα2(AKT1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、低聚果糖(FOS)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(AVEGFA)和內(nèi)皮素1(EDN1)等關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖2 韋恩圖

圖3 抗高血壓靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 通路富集分析 運(yùn)用RStudio 1.2.5019軟件得到1 871個(gè)GO富集條目(P<0.05)，其中生物過(guò)程(biological process，BP)條目1 767個(gè)，細(xì)胞組成(cellular component，CC)條目21個(gè)，分子功能(molecular function，MF)相關(guān)的條目74個(gè)。取前10的BP、CC、MF過(guò)程建立富集通路(見(jiàn)圖4)。KEGG通路富集，篩選出129條信號(hào)通路(P<0.05)，取基因占比前20的疾病相關(guān)通路利用RStudio 1.2.5019軟件制作可視化氣泡圖，結(jié)果見(jiàn)圖5。

篩選出11條與高血壓可能相關(guān)的通路，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”多維網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖6)。其節(jié)點(diǎn)大小和顏色深度與它們?cè)诰W(wǎng)絡(luò)中的度值有關(guān)。圓形代表通路；菱形代表成分；箭頭代表靶點(diǎn)。由圖可知，流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、鈣信號(hào)通路、AGE-RAGE、松弛素、cGMP-PKG等11個(gè)信號(hào)通路，共涉及58個(gè)活性成分，46個(gè)靶點(diǎn)。

其中準(zhǔn)確度最高(P最小)的是流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化通路(fluid shear stress and atherosclerosis)，其富集通路見(jiàn)圖7。由圖可知丹參-川芎-葛根主要通過(guò)作用于VEGFR、NOS3、AKT1等靶蛋白調(diào)控流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化通路，起到抗高血壓及其并發(fā)癥的作用。

圖6 丹參-川芎-葛根活性成分-靶點(diǎn)-通路圖

圖7 流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化通路

2.5 分子對(duì)接 將“藥材-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中“degree”>20的活性成分，與關(guān)鍵靶點(diǎn)NOS3、AKT1、IL-6、FOS、VEGFA和EDN1進(jìn)行結(jié)合能預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。用PyMOL軟件將對(duì)接結(jié)果可視化，結(jié)果見(jiàn)圖8。Hsin等[13]證明結(jié)合能<-4.25 kcal·mol-1提示配體與受體有一定的結(jié)合活性，<-5.0 kcal·mol-1有較好的結(jié)合活性，<-7.0 kcal·mol-1有強(qiáng)烈的結(jié)合活性。

a.隱丹參酮-NOS3；b.β-谷甾醇-FOS；c.丹參酮ⅡA-EDN1；d.丹參酮ⅡA-EDN1；e.丹參酮ⅡA-VEGFA；f.β-谷甾醇-AKT1圖8 分子對(duì)接模式圖

表2 活性成分及靶蛋白結(jié)合能預(yù)測(cè)

3 討論

借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，整理得到了抗高血壓作用的68個(gè)化學(xué)成分，62個(gè)潛在靶點(diǎn)。丹參-川芎-葛根相互作用網(wǎng)絡(luò)，體現(xiàn)出一個(gè)成分與多個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)聯(lián)，一個(gè)靶點(diǎn)與多種成分相關(guān)聯(lián)的機(jī)制。通過(guò)對(duì)丹參的分析，其主要降壓成分是酮類化合物，丹參酮ⅡA通過(guò)降低NO水平，抑制內(nèi)皮素-1(ET-1)生成，起到降血壓的目的[14]。川芎中降血壓的主要活性成分為楊梅酮，楊梅酮可以顯著提高磷酸化AKT的水平，降低p38絲裂原激活蛋白激酶(p38 MAPK)的磷酸化和核因子κB/p65的水平[15]。葛根中降血壓的主要活性成分有β-谷甾醇和芒柄花黃素，β-谷甾醇可降低血脂[16]；芒柄花黃素主要是通過(guò)下調(diào)p47phox和NOX4的mRNA含量間接性對(duì)降血壓起到作用[17]。

從PPI網(wǎng)絡(luò)圖得到核心靶點(diǎn)NOS3、FOS、EDN1、VEGFA、IL-6、AKT1。辛穎等[18]研究發(fā)現(xiàn)，NOS3基因多態(tài)性與高血壓繼發(fā)左心室肥厚相關(guān)聯(lián)；Wu等[19]證明FOS基因與腎髓質(zhì)性高血壓有關(guān)；Jiao等[20]研究表明，EDN1基因與肺動(dòng)脈高壓有關(guān)；謝志偉[21]的研究表明，VEGFA基因與高血壓密切相關(guān)；吳阿敏[22]研究表明IL-6蛋白與低氧肺動(dòng)脈高壓有關(guān)；齊書涵等[23]研究表明，血管重構(gòu)與高血壓循環(huán)作用，而AKT1對(duì)血管重構(gòu)有重要作用。

GO富集分析結(jié)果顯示，丹參-川芎-葛根的核心靶點(diǎn)是通過(guò)影響血管內(nèi)皮功能、藥物反應(yīng)及氧化應(yīng)激等生物過(guò)程對(duì)高血壓病進(jìn)行調(diào)控。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，丹參-川芎-葛根通過(guò)調(diào)節(jié)流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、鈣信號(hào)通路、AGE-RAGE、松弛素、cGMP-PKG信號(hào)通路來(lái)治療高血壓。較高的血流剪切力對(duì)維持血管內(nèi)皮功能有利，減少內(nèi)皮損傷因子分泌，保護(hù)血管內(nèi)膜，起到預(yù)防高血壓的作用[24]。鈣信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制對(duì)心臟和血管等相關(guān)疾病發(fā)揮重要作用[25]。海長(zhǎng)娥等[26]研究證明高血壓與AGE-RAGEA密切相關(guān)。高血壓患者的血漿松弛素水平明顯下降[27]。cGMP促使NO松弛血管平滑肌[28-29]。施偉麗等[30]證實(shí)激活cGMP-PKG信號(hào)通路對(duì)自發(fā)性高血壓有療效。

綜上所述，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，對(duì)丹參-川芎-葛根治療高血壓的作用機(jī)制做了初步探討。結(jié)果顯示，木犀草素和丹參酮ⅡA等成分主要通過(guò)流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路，作用于NOS3、AKT1、IL-6、FOS、VEGFA和EDN1等靶點(diǎn)發(fā)揮作用。為進(jìn)一步研究高血壓藥物提供參考。