由鵬飛，李春煥，陳曉，張迅杰，薛維麗，張乃斌

(山東省食品藥品檢驗研究院，國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室，山東省仿制藥一致性評價工程技術(shù)研究中心，山東 濟南 250101)

肝素鈉注射液為肝素鈉的滅菌水溶液，主要用于心腦血管疾病和血液透析治療。《中國藥典》2020年版中規(guī)定多劑量包裝的注射液可加適宜的抑菌劑，靜脈給藥與腦池內(nèi)、硬膜外、椎管內(nèi)用的注射液均不得加抑菌劑[1]，肝素鈉注射液屬于單劑量包裝的注射劑，且各生產(chǎn)企業(yè)說明書中用法用量均包括靜脈注射及靜脈滴注，目前仍有部分企業(yè)添加苯酚作為抑菌劑。注射液中常用的抑菌劑有：醇類(苯甲醇、三氯叔丁醇)、酚類(苯酚)、酯類(羥苯酯類)等[2-5]，不同抑菌劑的機理不同，但普遍存在一定的毒副作用[6-8]，如苯酚有致癌風險，苯甲醇的降解和代謝產(chǎn)物苯甲醛具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性，三氯叔丁醇可導致溶血反應，羥苯酯類可導致過敏反應等，因此，有必要對肝素鈉注射液進行抑菌劑檢查。目前已有高效液相色譜(HPLC)法測定肝素鈉注射液中苯酚的報道[9]，但其中未對其他抑菌劑進行檢測，因此本文建立了HPLC法同時測定肝素鈉注射液中苯酚、苯甲醇、三氯叔丁醇、羥苯甲酯、羥苯乙酯及羥苯丙酯等6種抑菌劑的含量，為更好地質(zhì)控肝素鈉注射液的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20A液相色譜儀(日本島津公司)，PDA檢測器；Mettler Toledo XSE205DU電子天平(德國梅特勒公司)。

1.2 試劑試藥 甲醇為色譜純；水為Millipore Q-POD制備的純化水；其他試劑均為分析純。

肝素鈉注射液：來自2021年國家評價性抽驗，包括11家生產(chǎn)企業(yè)共100批樣品。

對照品：苯酚(中檢院，批號：100509-201804，含量：100.0%)；苯甲醇(中檢院，批號：190019-202004，含量：99.7%)；三氯叔丁醇(Cato Research Chemicals，批號：0622-RB-0005，含量：99.8%)；羥苯甲酯(中檢院，批號：100278-201906，含量：99.9%)；羥苯乙酯(中檢院，批號：100847-202105，含量：100.0%)；羥苯丙酯(中檢院，批號：100444-202005，含量：99.9%)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相A為水，流動相B為甲醇，洗脫程序見表1，流速：1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，進樣量20 μL。檢測波長：苯酚、苯甲醇、三氯叔丁醇選擇220 nm；羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯選擇256 nm。

表1 HPLC 梯度洗脫程序

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液 分別精密稱取苯酚、苯甲醇、羥苯甲酯、羥苯乙酯、三氯叔丁醇及羥苯丙酯標準品約25 mg置10 mg量瓶中，用甲醇-水(1∶1)溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成6種對照品貯備溶液，分別精密量取上述貯備溶液適量，用甲醇-水(1∶1)溶液稀釋成濃度分別為400.06、1671.88、490.4、85.81、793.54、80.45 μg·mL-1的對照品溶液1。

2.2.2 供試品溶液 分別精密量取肝素鈉注射液1 mL置25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。

2.3 系統(tǒng)適用性 精密量取20 μL“2.2.1”項下對照品溶液1進樣，記錄色譜圖，出峰順序依次為苯酚、苯甲醇、羥苯甲酯、羥苯乙酯、三氯叔丁醇及羥苯丙酯(見圖1)。各相鄰峰之間的分離度均不小于1.5。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗色譜圖

2.4 線性關系試驗 精密量取“2.2.1”項下對照品溶液1，逐級稀釋成含苯酚濃度為200.03、100.02、50.01、25.00 μg·mL-1；含苯甲醇濃度為835.94、417.97、208.99、104.49 μg·mL-1；含羥苯甲酯濃度為245.20、122.60、61.30、30.65 μg·mL-1；含羥苯乙酯濃度為42.91、21.45、10.73、5.36 μg·mL-1；含三氯叔丁醇濃度為396.77、198.39、99.19、49.60 μg·mL-1；含羥苯丙酯濃度為40.23、20.11、10.06、5.03 μg·mL-1的對照品溶液2～5，分別精密吸取系列對照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，測定，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，結(jié)果見表2。

表2 線性關系考察結(jié)果

2.5 系統(tǒng)精密度試驗 精密量取20 μL對照品溶液3，連續(xù)進樣6 次，記錄色譜圖，測其峰面積，計算RSD。苯酚、苯甲醇、羥苯甲酯、羥苯乙酯、三氯叔丁醇及羥苯丙酯峰面積的RSD分別為0.10%、0.20%、0.03%、0.06%、0.49%、0.13%，表明系統(tǒng)精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.4”項下制備的對照品溶液3，精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，每隔5 h進樣一次，測定6種抑菌劑的峰面積，共考察25 h，計算峰面積的RSD，以觀察在檢測過程中待測成分的穩(wěn)定性。苯酚、苯甲醇、羥苯甲酯、羥苯乙酯、三氯叔丁醇及羥苯丙酯峰面積的RSD分別為0.12%、0.73%、0.02%、0.24%、0.58%、0.12%，試驗結(jié)果表明，對照品溶液在25 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，能夠滿足測定需要。

2.7 定量限測定 取對照品溶液進行稀釋后進樣，以信噪比S/N=10 計，苯酚的定量限為0.1 μg·mL-1、苯甲醇的定量限為1 μg·mL-1、三氯叔丁醇的定量限為20 μg·mL-1、羥苯甲酯的定量限為0.03 μg·mL-1、羥苯乙酯的定量限為0.1 μg·mL-1、羥苯丙酯的定量限為0.3 μg·mL-1。

2.8 加樣回收率試驗 精密量取肝素鈉注射劑(處方中苯酚的含量為2.5 mg·mL-1)4 mL置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度。再分別精密量取2、2.5、3 mL對照品溶液1置20 mL量瓶中，分別精密加入供試品溶液10 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，制成低、中、高濃度的溶液，分別進樣10 μL，記錄色譜圖，計算苯酚、苯甲醇、羥苯甲酯、羥苯乙酯、三氯叔丁醇和羥苯丙酯的回收率，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，6種抑菌劑回收率在90%～110%，RSD均不超過2.0%。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果

2.9 樣品測定 取收集到的11家企業(yè)100個生產(chǎn)批次的肝素鈉注射液樣品，以“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定，以外標法計算抑菌劑含量。檢出3家生產(chǎn)企業(yè)使用苯酚作為抑菌劑，其他抑菌劑未檢出。本次檢驗的結(jié)果表明，11家生產(chǎn)企業(yè)中有3家工藝處方中添加苯酚，測定結(jié)果與理論加入量相符，未檢出其他5種抑菌劑；其他8家企業(yè)工藝處方中未添加抑菌劑，6種抑菌劑均未檢出。

3 討論

雖然抑菌劑在規(guī)定的使用濃度范圍內(nèi)一般是安全的，但由于其本身存在毒性，仍會導致一些不良反應發(fā)生，因此應加強對注射劑中抑菌劑的監(jiān)管和檢測，特別對于單劑量包裝的注射劑，應盡量避免抑菌劑的使用。我們根據(jù)各肝素鈉注射液生產(chǎn)企業(yè)中苯酚的理論加入量以及文獻報道[10-11]，確定了6種抑菌劑的對照品溶液的濃度，方法學驗證結(jié)果表明，本文建立的HPLC法適用于肝素鈉注射液中苯酚、苯甲醇、羥苯甲酯、羥苯乙酯、三氯叔丁醇和羥苯丙酯等6種抑菌劑的含量測定，可作為肝素鈉注射液質(zhì)量安全評價方法，為更好地控制肝素鈉注射液的質(zhì)量提供依據(jù)。