張佳琦，郭宗珊，劉長華，李榮田

（1黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080；2黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江省普通高等學(xué)校分子生物學(xué)重點(diǎn)實驗室，哈爾濱 150080）

0 引言

黑龍江省是中國六大水稻種植區(qū)之一，也是世界上最寒冷的稻作區(qū)。水稻在黑龍江省種植區(qū)域較廣，覆蓋了5個積溫區(qū)，品種類型多樣，包括普通粳稻、糯稻、香稻、香糯、軟米和旱稻等類型[1-2]。盡管審定通過的品種較多，但生產(chǎn)上當(dāng)家品種還是‘龍粳31’、‘綏粳18’、‘龍稻 18’、‘松粳 9’和‘稻花香 2 號’等經(jīng)典品種[3]，新品種與老品種相比，在性狀方面的差異不顯著，缺乏突破性品種。造成寒區(qū)水稻品種徘徊局面的主要原因是早粳稻種質(zhì)資源匱乏，遺傳基礎(chǔ)狹窄。少數(shù)骨干親本被反復(fù)應(yīng)用于育種實踐，導(dǎo)致新品種和老品種基因組成類似、性狀相似。

SSR分子標(biāo)記，即微衛(wèi)星序列，是由1～6 bp基序組成的重復(fù)序列，在真核生物中普通存在[4]。因SSR多態(tài)性好、穩(wěn)定可靠和重復(fù)性好，已被廣泛應(yīng)用于作物品種鑒定、遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域[5]。張全芳等[6]利用48個SSR標(biāo)記，分析了山東省育成和審定的48份水稻品種，發(fā)現(xiàn)其遺傳多樣性不夠豐富，品種間的親緣關(guān)系較近。董俊杰等[7]利用214個分子標(biāo)記分析了來自14個國家的273份水稻材料，發(fā)現(xiàn)具有豐富的遺傳變異。宋澤等[8]對173份貴州糯稻品種，利用SSR標(biāo)記進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明供試材料遺傳背景相似程度較高。劉丹等[9]利用45個SSR分析了黑龍江省的粳稻資源，結(jié)果表明黑龍江省農(nóng)科院黑河分院材料與其他單位粳稻品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但與黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)院佳木斯水稻研究所的材料親緣關(guān)系較近。另外，目前還在小麥[10]、玉米[11]、馬鈴薯[12]、甜菜[5]和花生[13]等多種作物中利用SSR標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了DNA指紋圖譜。因此，利用SSR分子標(biāo)記分析水稻種質(zhì)資源的遺傳多樣性，了解種質(zhì)資源的遺傳背景和親緣關(guān)系，其結(jié)果可指導(dǎo)雜交育種親本選擇，避免育種的盲目性，提高育種效率。為了探明黑龍江省近年來主栽水稻品種及新育成品種遺傳多樣性，本研究利用農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法(NY/T 1433—2014)》中公布的SSR標(biāo)記檢測寒區(qū)231份水稻品種的DNA指紋圖譜，根據(jù)遺傳距離的聚類結(jié)果確定品種間的親緣關(guān)系，為培育寒區(qū)突破性水稻品種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

本研究選用的231份水稻材料系黑龍江省近年來主栽品種及2019年參加省品種審定區(qū)域試驗及生產(chǎn)試驗的部分水稻品種。這些水稻覆蓋黑龍江省第一至第五積溫區(qū)（表1）。將231份水稻的種子于2019年生長季節(jié)在黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)水稻試驗田進(jìn)行旱育苗插秧栽培，插秧規(guī)格為行距30 cm、株距12 cm、每蔸插2～5棵秧苗。田間水稻材料順式排列，2行區(qū)，行長3 m，小區(qū)面積1.8 m2。田間種植及管理同大田，于同年9月15日收獲種子。秋天每份水稻材料選擇典型植株取葉片，用于DNA抽提及SSR檢測。

表1 供試水稻品種及其適應(yīng)區(qū)域

續(xù)表1

1.2 SSR分子標(biāo)記

研究選用《中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法》(NY/T 1433—2014)中公布的分布于12條染色體的47個SSR標(biāo)記來檢測供試的231份水稻品種的基因型。SSR標(biāo)記信息見表2。

1.3 基因組DNA提取及PCR檢測

采用CTAB法提取水稻葉片DNA[14]，使用Nano Drop2000超微量分光光度計檢測DNA濃度及純度，保證OD260/280值≥1.8，濃度≥20 ng/μL，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。

PCR反應(yīng)體系：水稻模板DNA 1 μL，正向引物0.5 μL(10 μmol/L)，反向引物 0.5 μL(10 μmol/L)，2×TaqPCR Master Mix 3 μL，ddH2O 5 μL，總 體 積 為10 μL。

PCR擴(kuò)增程序：94℃，3 min；94℃變性30 s～56℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，30 循環(huán)；72℃，8 min；4℃儲存。PCR完成后，擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

在DNA電泳圖譜中，在同一遷移位置，列出二元數(shù)據(jù)矩陣：有DNA擴(kuò)增帶的記為“1”，無擴(kuò)增帶的記為“0”。用Excel2013整理SSR電泳結(jié)果，按照不同的軟件要求轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)格式。利用PowerMarker V3.25軟件計算每個位點(diǎn)等位基因數(shù)、基因多樣性、多態(tài)性信息量(PIC)和標(biāo)記指數(shù)(MI)[15]；利用MEGA4.0軟件計算遺傳距離，按UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[16]。利用Gen ALEx軟件進(jìn)行主坐標(biāo)分析并構(gòu)建二維主坐標(biāo)分析圖[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記多樣性

47個SSR在供試的231份水稻均能檢測到清晰、穩(wěn)定的條帶，其中分子標(biāo)記RM583對部分水稻品種檢測結(jié)果如圖1所示。由圖1A可見，M583標(biāo)記共有3種帶型，針對每個水稻材料可得到“01”型DNA指紋圖譜（見圖1B）。

圖1 水稻品種1號～32號分子標(biāo)記RM583電泳圖(A)及其DNA指紋(B)

47個SSR標(biāo)記檢測231份水稻品種的多態(tài)性結(jié)果見表2。由表2可知，47個SSR標(biāo)記在231份水稻中共檢測到136個等位基因，等位基因數(shù)變異范圍為2～5個，平均為2.92個；基因多樣性變幅為0.11～0.79，平均為0.56；多態(tài)性信息量PIC值變化范圍0.11～0.76，平均為0.49；標(biāo)記指數(shù)MI變化范圍為3.18～18.39，平均為6.52。其中，分子標(biāo)記RM224檢測到的等位基因數(shù)最多（5個），相應(yīng)地PIC值最高(0.76)，而RM274檢測到的等位片段數(shù)最少（2個），PIC值也最低(0.11)。

表2 47個SSR標(biāo)記位點(diǎn)在231份水稻中的遺傳多態(tài)性

續(xù)表2

47個SSR標(biāo)記對231份水稻品種多態(tài)性檢測結(jié)果在不同連鎖群上的表現(xiàn)如圖2。圖2顯示，不同的連鎖群上分子標(biāo)記多態(tài)性不同，連鎖群11分子標(biāo)記等位基因數(shù)最高，連鎖群5和連鎖群6較低；不同連鎖群PIC值大小存在差異，連鎖群8PIC值最大，連鎖群5PIC值最低。從圖2還可知，通常分子標(biāo)記等位基因數(shù)高的連鎖群，其PIC值往往也高，但是二者并不是一對一的關(guān)系。這些結(jié)果表明，供試的水稻品種（系）每條染色體上分子標(biāo)記的多態(tài)性均較好，選用的47個SSR標(biāo)記能夠較好地反映供試的水稻品種遺傳變異情況。

圖2 231份水稻品種不同連鎖群平均等位基因數(shù)和平均PIC值

2.2 DNA指紋圖譜構(gòu)建

47個SSR標(biāo)記對黑龍江省水稻‘松粳9’、‘龍稻18’、‘稻花香2號’、‘綏粳18’和‘龍粳31’等5個代表性品種構(gòu)建的DNA“01”數(shù)字圖譜見表3（其他品種DNA數(shù)字圖譜略）。由表3可知，每個水稻品種都有一串獨(dú)特的136位的“01”型的數(shù)字符，是唯一的有別于其他品種的數(shù)字圖譜，可視為該品種的“分子身份證”，可用于進(jìn)行水稻品種真?zhèn)舞b別及分析不同品種間的差異大小。

表3 代表性水稻品種DNA指紋圖譜

2.3 聚類分析

依據(jù)47個SSR標(biāo)記對231份水稻品種檢測獲得的DNA“01”數(shù)字圖譜，利用MEGA4.0軟件計算遺傳距離，按UPGMA方法聚類的結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，231份水稻品種劃分為3大類7個群。類1包括群1、群2和群3等3個群，共89份材料；類2包括群4、群5和群6等3個群，共136份材料；類3最小，只有群7，包括6個品種。

圖3 231份水稻品種基于遺傳距離的UMPGA聚類結(jié)果

對各類群品種進(jìn)一步分析的結(jié)果見圖4。圖4顯示，群1，以積溫區(qū)Ⅲ品種為主，積溫區(qū)Ⅲ品種占比65.52%，群1包括‘龍粳31’等品種共29個；群2，以積溫區(qū)Ⅱ和積溫區(qū)Ⅲ品種為主，積溫區(qū)Ⅱ品種比例為24.14%，積溫區(qū)Ⅲ品種比例為37.93%，積溫區(qū)Ⅱ和積溫區(qū)Ⅲ品種占比62.07%，群2包括‘龍科10’和‘豐碩3’等品種共29個；群3，以積溫區(qū)Ⅲ品種為主，積溫區(qū)Ⅲ品種比例61.29%，群3包括‘飛凡9’等31個品種。群4，積溫區(qū)Ⅰ品種最多，占該品種總數(shù)的50.00%，群4包括‘哈粳稻9號’品種在內(nèi)共58個品種；群5，以積溫區(qū)Ⅰ、積溫區(qū)Ⅱ品種為主，積溫區(qū)Ⅰ品種比例為35.29%、積溫區(qū)Ⅱ品種比例為23.53%，積溫區(qū)Ⅰ和積溫區(qū)Ⅱ品種占比58.82，群5包括‘五優(yōu)稻1號’和‘鴻源5號’等17個品種；群6，積溫區(qū)Ⅰ品種占比最多(47.54%)，包括‘稻花香2號’、‘龍稻18’等61個品種，是最大的群。類3只有1個群，即群7，只有‘龍洋16’等6個品種，是最小的群。群7各個品種未劃歸類1和類2中，單獨(dú)成為一類，說明該6個品種與其他品種遺傳距離相對較遠(yuǎn)。比較分析類1和類2的水稻品種，類1中以北部積溫區(qū)Ⅲ品種為主，類2中以南部積溫區(qū)Ⅰ品種為主。說明，黑龍江省北部水稻主產(chǎn)區(qū)的積溫區(qū)Ⅲ的不同水稻品種遺傳差異較小，南部優(yōu)質(zhì)稻米產(chǎn)區(qū)的積溫區(qū)Ⅰ的不同水稻品種遺傳差異較小，北部積溫區(qū)Ⅲ品種與南部積溫區(qū)Ⅰ品種遺傳差異相對較大。

圖4 不同類群水稻品種在各積溫區(qū)分布圖

根據(jù)47個分子標(biāo)記的分型結(jié)果，用Gen ALEx軟件構(gòu)建231份水稻品種的二維主坐標(biāo)分析圖（圖5）。以第1主成分和第2主成分為二維坐標(biāo)圖的坐標(biāo)，第1主成分和第2主成分分別反映了10.74%和9.87%的變異。主坐標(biāo)圖上的距離遠(yuǎn)近代表著各個水稻材料之間的親緣關(guān)系。從圖5可以看出，231份水稻明顯分成兩大類，一類主要包括a、b、c等3個群，另一類由e、f、g等3個群組成。d、f和g群的少數(shù)品種介于2類之間。主成分分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果基本一致。

圖5 231份水稻品種的主坐標(biāo)分析(PCA)二維散點(diǎn)圖

3 討論

DNA標(biāo)記位點(diǎn)的平均PIC值，可被用來估算群體的遺傳多樣性水平，群體的平均PIC值越高，表明群體的DNA標(biāo)記位點(diǎn)變異程度越高，群體的遺傳多樣性越豐富[18-19]。張全芳等[6]利用48個SSR標(biāo)記，分析了山東省育成和審定的48個水稻品種（系），SSR標(biāo)記的PIC平均為0.26，山東省育成和審定的水稻品種（系）遺傳多樣性不夠豐富。從夕漢等[20]利用29個SSR標(biāo)記分析東南亞62個水稻品種，平均多態(tài)信息含量為0.52，同一來源地的品種遺傳基礎(chǔ)較狹窄。李松等[21]利用18個SSR標(biāo)記分析騰沖本地糯谷和推廣種植的品種間的遺傳多樣性，SSR的PIC平均值為0.63，騰沖糯谷與推廣種植水稻品種間遺傳基礎(chǔ)豐富。本研究中，47個SSR標(biāo)記在231份水稻檢測到有效等位基因數(shù)為136個，平均每個位點(diǎn)檢測到的等位基因數(shù)為2.92個，基因多樣性變幅為0.11～0.79（平均為0.56），平均PIC值為0.49，該結(jié)果高于張全芳等[6]的(PIC=0.26)研究結(jié)果，低于從夕漢等[20](PIC=0.52)和李松等[21](PIC=0.63)的PIC值，說明寒區(qū)當(dāng)前水稻品種遺傳多樣性不夠豐富。以后，在水稻育種進(jìn)程中，應(yīng)加強(qiáng)引進(jìn)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)、性狀優(yōu)良的水稻種質(zhì)資源用作雜交親本，提高黑龍江省的粳稻遺傳多樣性。

近年來，育種家們普遍利用分子標(biāo)記研究群體的遺傳距離和遺傳多樣性[22-24]。束愛萍等[25]發(fā)現(xiàn)水稻品種之間的遺傳差異與緯度和地理位置有很大的關(guān)系。馬作斌等[26]研究表明所處緯度相近的國家或地區(qū)的水稻品種之間的遺傳距離較近，而所處緯度較遠(yuǎn)的國家或地區(qū)的水稻品種遺傳距離較遠(yuǎn)。玄英實等[27]研究表明地理位置相對較近的品種，具有較近的親緣關(guān)系；地理位置相對較遠(yuǎn)的品種，則具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。本研究顯示，231份寒區(qū)水稻材料被分為3大類7群。類1中的群1、群2和群3均以積溫區(qū)III品種居多，積溫區(qū)III品種間具有較近的親緣關(guān)系。類2中群4和群6是主要的品種集，均以積溫區(qū)I品種占比最多，積溫區(qū)I品種間具有較近的親緣關(guān)系。這與玄英實等的研究結(jié)果相符。而黑龍江省北部積溫區(qū)III的大部分品種與南部積溫區(qū)I的大部分品種，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。黑龍江省北部與南部在地理位置上存在差異，氣候等生態(tài)類型不同，因此大部分品種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這與束愛萍、馬作斌等的研究結(jié)果相符。

在水稻新品種培育工作中，引進(jìn)優(yōu)異種質(zhì)資源，親本選配時適當(dāng)選擇遺傳距離較遠(yuǎn)且綜合性狀差異較大的材料，對培育新型水稻品種具有重要意義[28-29]。趙璐等[30]評價了寧夏及新疆193份水稻種質(zhì)資源的遺傳多樣性，并從新疆引進(jìn)遺傳距離較遠(yuǎn)的水稻作原始材料，有效地拓寬了寧夏水稻種質(zhì)資源。劉寶海等[31]研究了黑龍江省花培技術(shù)培育的粳稻品種親緣關(guān)系，發(fā)現(xiàn)寒區(qū)花培水稻品種間親緣關(guān)系較近。本研究證明黑龍江省北部水稻品種與南部水稻品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，寒區(qū)北部積溫區(qū)III是水稻主產(chǎn)區(qū)，代表品種‘龍粳31’等高產(chǎn)性品種，南部積溫區(qū)I是優(yōu)質(zhì)稻米主要生產(chǎn)區(qū)域，代表品種‘稻花香2號’及‘龍稻18’等。在黑龍江省今后水稻育種實踐中，應(yīng)該注意利用北部水稻品種與南部水稻品種之間雜交，拓寬遺傳背景，培育出綠色優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的突破性品種可能性較大。

4 結(jié)論

47個SSR分子標(biāo)記能夠?qū)⒑邶埥?31份水稻品種完全區(qū)分開來，寒區(qū)水稻品種遺傳多樣性不夠豐富（平均PIC值為0.49），聚類分析將231份水稻分為3類7群。同一積溫區(qū)不同水稻品種遺傳差異較小‘，稻花香2號’等品種主要在第一及第二積溫區(qū)，但有向第三積溫區(qū)擴(kuò)展的趨勢。南部優(yōu)質(zhì)米產(chǎn)區(qū)的積溫區(qū)I品種與北部水稻主產(chǎn)區(qū)積溫區(qū)III的品種遺傳差異較大。黑龍江省今后水稻育種工作中應(yīng)注意北部品種與南部品種的雜交，利于拓寬遺傳背景，培育出綠色優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)新品種。