馬經(jīng)偉，張 寧，朱 萌 ，盧新蘭，張志勇 ，任牡丹

（1. 寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院腫瘤外二科,寧夏銀川 750004；2. 寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院病理科，寧夏銀川 750004；3. 寧夏醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，寧夏銀川 750004；4. 西安交通大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西西安 710061）

胃癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率第5 位和死亡率第3 位的惡性腫瘤[1]。胃癌的流行病學趨勢顯示，早期胃癌的預(yù)后很好，但進展期胃癌臨床占比依然很高，多種類型轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)預(yù)示著5 年生存率不足30%[2]；胃癌的發(fā)病具有廣泛的地域差異，我國是胃癌高發(fā)區(qū)；由于癌癥的自我感知較低，胃癌呈現(xiàn)年輕化趨勢，且年輕患者往往呈現(xiàn)印戒細胞癌和低分化癌，預(yù)后較差。因此，迫切需要深入研究胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制。研究顯示，非編碼RNA 參與調(diào)控胃癌的發(fā)生發(fā)展。微小RNA（miRNA）是一類非常重要的非編碼RNA，通過轉(zhuǎn)錄后抑制mRNA 而調(diào)節(jié)基因表達。環(huán)狀RNA（circRNA）是一類新的非編碼RNA，基本來源于其親本基因的外顯子[3-4]，外顯子環(huán)狀RNA 結(jié)構(gòu)使其在組織中穩(wěn)定存在，許多RNA 轉(zhuǎn)錄本與miRNA 共享結(jié)合位點，通過蛋白質(zhì)海綿、翻譯和miRNA 海綿[3-5]，尤以miRNA 海綿作用而參與到許多腫瘤的發(fā)病機制中。目前，關(guān)于circRNA 靶向miRNA 對胃癌細胞生物學特性的影響尚少見報道。本課題組前期研究顯示，miR-106a 在胃癌中異常表達，可能參與調(diào)控胃癌細胞的生物學行為[6]。然而，miR-106a 異常表達的原因及調(diào)節(jié)機制并不清楚。為進一步探索，本研究從circRNA 對miRNA 作用入手，數(shù)據(jù)庫篩選hsa_circ_0045943，檢測其表達水平對胃癌細胞生物學特性的影響，以期與miR-106a 共同揭示胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設(shè)備

胎牛血清（Gibco, Cat. No.10099-141），RPMI-1640 培養(yǎng)基（Hyclone,Cat.No.SH30809.01B），青鏈霉素，PBS 緩沖液，胰酶（Genview,Cat.No.9002-07-7），Lipofectamine? 3000（Invitrogen,Cat.No.L3000075），CCK-8 檢測試劑盒（Dojindo, Cat. No. CK04），Transwell 小 室（Costor, Cat. No. 3422），Matrigel 基 質(zhì)（Corning, Cat. No. 356234），一步法 TUNEL 檢測試劑盒（Beyotime），Trizo（lTakara），Bestar?qPCR RT kit（DBI Bioscience），Bestar?SybrGreen qPCR Master Mix（DBI Bioscience）。Stratagene Real time PCR儀（Agilent），酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀（Thermo Fisher），倒置熒光顯微鏡（Leica），倒置顯微鏡（Motic）。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

人胃癌細胞系MKN-45、AGS 和胃黏膜上皮細胞GES-1購自于中國科學院上海細胞庫，在含100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中于37℃50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。構(gòu)建circ_0045943 的沉默載體，通過腺病毒載體將靶向circ_0045943 的短發(fā)夾RNA（sh-circRNA）和陰性對照（sh-NC）導入受體細胞；構(gòu)建circ_0045943 的過表達載體（OE-circRNA）和陰性對照（OE-NC）。以上購自上海吉凱生物技術(shù)有限公司。采用Lipofectamine?3000 進行細胞轉(zhuǎn)染，瞬時轉(zhuǎn)染48 h 后用于后續(xù)實驗。細胞功能實驗分組：OE-NC、OE-circRNA、sh-NC、sh-circRNA。

1.3 Real-time PCR 檢測 circ_0045943、miR-106a表達

采用Real-time PCR 法檢測胃癌細胞中circ_0045943、miR-106a 的相對表達量。Trizol 法提取總RNA。RNA 模板量 2 μg，配置反應(yīng)液 10 μL。逆轉(zhuǎn)錄：取上述反應(yīng)液 7.0 μL，5×RT 緩沖液 2.0 μL，miRNA RT 0.25 μL，U6 R 0.25 μL，RT逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，總體系 10 μL。37 ℃ 15 min，98 ℃ 5 min，合成 cDNA 第一鏈。PCR擴增：cDNA 1 μL，Bestar?SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.5 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.5 μL，ddH2O 8 μL，總體系 20 μL。置于熒光定量 PCR 儀Mx3000P 進行如下反應(yīng)：95 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，58 ℃20 s，72 ℃ 20 s，40 個循環(huán)。miR-106aRT：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTACCTGC；miR-106a F：ACACTCCAGCTGGGAAAAGTGCTTACAGTGCA；circ_0045943 F：CATAGAAAGTGAATTTTGTAG；circ_0045943 R：GCATGATGTTGTAAATACTTA。每組3 個復(fù)孔，按照 2-△△Ct方法處理數(shù)據(jù)。

1.4 CCK-8 檢測胃癌細胞增殖

采用CCK-8 法檢測過表達或抑制circ_0045943后AGS 細胞的增殖變化。胃癌細胞AGS 接種于96孔板，細胞密度1×105/mL，每孔100 μL。于接種后0、24、48、72 h 檢測，檢測前每孔加入 100 μL CCK-8檢測工作液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀450 nm處測定吸光度值。

1.5 TUNEL 檢測胃癌細胞凋亡

采用TUNEL 法檢測過表達或抑制circ_0045943后AGS 細胞的凋亡變化。胃癌細胞AGS 接種于置有載玻片的6 孔板，細胞密度5×105/mL，每孔2 mL，細胞貼附于載玻片上，40 g/L 多聚甲醛固定60 min，0.1% Triton?X-100 冰浴 2 min；制備 TUNEL 反應(yīng)混合液：20 μL rTdT＋480 μL 熒光標記液＋500 μL TUNEL 檢測液混勻，每孔 50 μL，37 ℃避光孵育60 min；浸入 10 μL DAPI 工作液，37 ℃避光 10 min染色；用抗熒光淬滅封片劑封片，倒置熒光顯微鏡觀察熒光信號。

1.6 Transwell 檢測胃癌細胞遷移、侵襲

采用Transwell 法檢測過表達或抑制circ_0045943 后 AGS 細胞的遷移、侵襲變化。AGS 細胞饑餓培養(yǎng)12 h 后接種于24 孔培養(yǎng)板transwell 小室中，遷移實驗不鋪膠，侵襲實驗鋪Matrigel 基質(zhì)膠（稀釋倍數(shù)：1∶50）。細胞密度 2×105/mL，每孔 100 μL，下室加入完全培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)48 h，40 g/L 多聚甲醛固定20 min，1 g/L 結(jié)晶紫染色5 min，置于光學顯微鏡下計數(shù)互不重疊的6 個高倍視野下穿膜細胞平均數(shù)。

1.7 劃痕實驗檢測胃癌細胞遷移

采用劃痕實驗檢測過表達或抑制circ_0045943后AGS 細胞的遷移變化。胃癌細胞AGS 接種于6 孔板，細胞密度 5×105/mL，每孔 1 mL，培養(yǎng) 48 h 后用吸頭筆直劃痕，每孔至少劃5 條痕跡，PBS 洗滌細胞3 次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后置于倒置顯微鏡下觀察，IPP 軟件統(tǒng)計。劃痕愈合率=(T0width-Ttwidth)/T0width×100%。

1.8 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料的統(tǒng)計描述采用表示，樣本均數(shù)比較的統(tǒng)計分析采用單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），當總體均數(shù)不等時，采用多個樣本均數(shù)間的多重比較LSD-t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。統(tǒng)計圖采用GraphPad Prism（version 5.0）制作直條圖表示不同樣本總體均數(shù)的差異，線圖表示吸光度值隨時間變量變化而變化的趨勢。

2 結(jié) 果

2.1 circ_0045943 在胃癌細胞中的表達

首先檢測circ_0045943 在人胃癌細胞中的表達。Real-time PCR 顯 示 ，circ_0045943 在 胃 癌 細 胞MKN-45 中相對表達量為 0.617±0.038，AGS 中相對表達量為0.520±0.020，與胃黏膜上皮細胞GES-1 相比，circ_0045943 在3 種細胞中表達量的總體均數(shù)不等（F=172.458，P＜0.001），可以認為 circ_0045943在胃癌細胞中表達降低，尤以AGS 為低（圖1）。

圖1 Real-time PCR 檢測circ_0045943 在胃癌細胞中的表達Fig. 1 Real-time PCR for detection of circ_0045943 expression in gastric cancer cells

2.2 circ_0045943 對胃癌細胞增殖的影響

為確定低表達的circ_0045943 是否對胃癌細胞生物學特性產(chǎn)生影響，選用AGS 細胞檢測其增殖、凋亡、遷移和侵襲能力變化。CCK-8 檢測顯示，AGS細胞增殖吸光度A 值在過表達和沉默circ_0045943 后出現(xiàn)明顯變化（F24h=15.497，P＜0.05；F48h=55.726，P＜0.001；F72h=70.656，P＜0.001），可以認為不同時間點4個處理組AGS 細胞吸光度值總體均數(shù)均不等。兩兩比較顯示，OE-circRNA 組A 值低于sh-circRNA（P24h＜0.05，P48h＜0.001，P72h＜0.001），可以認為過表達circ_0045943 抑制AGS 細胞增殖，沉默circRNA促進AGS 細胞增殖（圖2）。

圖2 CCK-8 法檢測AGS 細胞增殖Fig.2 CCK-8 method for detection of AGS cells’proliferation ability

2.3 circ_0045943 對胃癌細胞凋亡的影響

已檢測到circ_0045943 影響AGS 細胞增殖，此處檢測其凋亡情況。TUNEL 檢測顯示，AGS 細胞凋亡隨circ_0045943 的過表達和沉默而發(fā)生變化，過表達circ_0045943 后細胞凋亡數(shù)增多，表現(xiàn)為陽性熒光信號增多，沉默circ_0045943 后凋亡數(shù)明顯減少，表現(xiàn)為陽性熒光信號減少（圖3）。

圖3 TUNEL 法檢測AGS 細胞凋亡Fig.3 TUNEL method for detection of AGS cells’apoptotic ability，bar=100 μm

2.4 circ_0045943 對胃癌細胞遷移、侵襲的影響

由于本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miR-106a 具有調(diào)控胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的能力，此次從circRNA 和miRNA作用機制角度探討circ_0045943 是否與miR-106a 通過位點互作而調(diào)控胃癌細胞表型。Transwell 檢測顯示，AGS 細胞遷移和侵襲在過表達和沉默circ_0045943 后發(fā)生變化，遷移實驗穿膜細胞數(shù)為OE-NC=71.17±7.627，OE-circRNA=45.50±3.017，sh-NC=73.17 ± 8.159，sh-circRNA=108.83 ± 4.401（F=106.139，P＜0.001）。侵襲實驗穿膜細胞數(shù)為OENC=52.83±7.139，OE-circRNA=29.83±2.137，sh-NC=51.50±6.317，sh-circRNA=91.50±1.643（F=160.967，P＜0.001）?？梢哉J為4 個不同處理組AGS細胞遷移、侵襲的總體均數(shù)均不等。兩兩比較得出OE-circRNA 組細胞穿膜數(shù)低于sh-circRNA，P＜0.001，可以認為過表達 circ_0045943 后 AGS 細胞遷移侵襲能力受到抑制，而沉默circRNA 促進AGS細胞轉(zhuǎn)移（圖4）。劃痕實驗顯示，劃痕愈合率為OENC=39.678±2.973，OE-circRNA=16.952±3.234，sh-NC=42.776±2.040，sh-circRNA=47.491±0.671（F=92.368，P＜0.001）。可以認為 4 個不同處理組AGS 細胞的劃痕愈合不全相同。過表達circ_0045943后AGS 細胞遷移能力最低，沉默circ_0045943 后遷移較高（圖5）。

圖4 Transwell 法檢測AGS 細胞遷移和侵襲Fig.4 Transwell assay for detection of AGS cells’migration and invasion abilities

圖5 劃痕法檢測AGS 細胞遷移Fig.5 Wound healing assay for detection of AGS cells’migration ability

2.5 miR-106a 在胃癌中的表達及其與circ_0045943的關(guān)系

考慮到circRNA 與miRNA 的潛在相關(guān)性，本研究采用starbase 數(shù)據(jù)庫檢索到circ_0045943 和miR-106a具有互補結(jié)合序列（圖6）。Real-time PCR 檢測miR-106a在胃癌細胞MKN-45、AGS中的表達量與GES-1的總體均數(shù)不等（F=108.891，P＜0.001），可以認為miR-106a 在胃癌細胞中表達增高（圖7）。隨后檢測circ_0045943 的表達及轉(zhuǎn)染circ_0045943 后miR-106a的表達變化，real-time PCR 顯示circ_0045943 在不同處理組中表達量不全相等（F=222.203，P＜0.001）。與Control 相比，過表達后circ_0045943 升高，沉默后circ_0045943 降低（P均＜0.001）；miR-106a 在不同處理組中表達量亦不全相等（F=125.282，P＜0.001）。與 Control 相比，過表達 circ_0045943 后 miR-106a表達下降，沉默circ_0045943 后miR-106a 表達回升（P均＜0.001）?？梢钥闯觯殡S circ_0045943 表達升高和下降，miR-106a 表達出現(xiàn)相反變化（圖8）。

圖6 miR-106a 與circ_0045943 的結(jié)合位點示意圖Fig.6 Schematic diagram of binding site between circ_0045943 and miR-106a

圖7 Real-time PCR 檢測miR-106a 在胃癌細胞中的表達Fig.7 Real-time PCR for detection of the expression of miR-106a in gastric cancer cells

圖8 Real-time PCR 檢測過表達或沉默circ_0045943 后circ_0045943 和miR-106a 的表達Fig.8 Real-time PCR for detection of the expressions of circ_0045943 and miR-106a after overexpression or silencing of circ_0045943

3 討 論

惡性腫瘤細胞在進化的過程中將逐漸獲得不斷的自我更新能力、遷移和侵襲、抵抗凋亡，以及區(qū)域擴張和遠處播散能力。然而，這些惡性行為獲得的原因并不清楚[7]。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)miR-106a 的異常表達具有調(diào)控胃癌細胞轉(zhuǎn)移的能力，但具體機制仍不清楚[8]。本研究探索circRNA 與miR-106a 的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)circ_0045943 在胃癌中表達下調(diào)，結(jié)合之前研究發(fā)現(xiàn)miR-106a 在胃癌中高表達，提示二者可能具有潛在的反向關(guān)系，circ_0045943 可能作為腫瘤抑制因子減輕miR-106a 的促腫瘤行為。細胞水平進一步證實，過表達circ_0045943 后胃癌細胞增殖能力下降，凋亡增多，遷移和侵襲減少，惡性生物學行為的趨勢有所緩和；反方向亦證明，當沉默circ_0045943 后，以上這些趨于緩和的惡性行為得以重新恢復(fù)，胃癌細胞表現(xiàn)為增殖加速，凋亡的抵抗和遷移侵襲的增強。此種表型的改變表明，circ_0045943 可能對胃癌細胞的生物學特性具有抑制作用。

CircRNA 最早發(fā)現(xiàn)于 20 世紀 70 年代[9]，但直到2012 年，對circRNA 的研究才開始集中于闡明其對包括癌癥在內(nèi)的人類疾病的影響[10]。大量研究表明，circRNA 的不同作用機制、高穩(wěn)定性以及在可獲得體液中的存在使其成為生物標記物和治療干預(yù)的潛在靶點[11]。大多數(shù)circRNA 由蛋白質(zhì)編碼基因承載，RNA 聚合酶Ⅱ負責轉(zhuǎn)錄，其生物發(fā)生由剪接體介導。外顯子序列組成的circRNA 是由一種稱為“反向剪接”的機制產(chǎn)生，其中一個外顯子下游5′剪接位點連接到另一個外顯子上游3′剪接位點。這一機制的結(jié)果是產(chǎn)生共價封閉的環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本和跳過外顯子的選擇性剪接線性RNA[12]。circRNA 參與基因表達的功能多數(shù)被認為是一種miRNA 海綿發(fā)揮競爭性內(nèi)源RNA 作用，吸附這些miRNA 并抑制其活性；另外，circRNA 還有RNA 結(jié)合蛋白隔離劑及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的功能[13-14]。本研究采用定量檢測證實，過表達circ_0045943 對應(yīng)miR-106a 表達降低，沉默circ_0045943后miR-106a 表達升高，表明了二者的反向關(guān)系。結(jié)合細胞功能實驗的結(jié)果，circ_0045943 對胃癌細胞增殖凋亡平衡的約束作用，以及遷移侵襲能力獲得的抵抗作用，將有可能是通過miRNA 海綿機制競爭性調(diào)節(jié)靶基因表達。

因此，本研究使用circinteractome 檢索circ_0045943 的宿主，發(fā)現(xiàn)宿主基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物TIMP2，而此宿主恰好是miR-106a 直接靶基因之一。本課題組以往的研究表明，miR-106a 可能通過直接靶向TIMP2 而促進胃癌的發(fā)生發(fā)展[8]。有研究顯示，來源于 TIMP2 的 circRNA 通過靶向 miR-185-5p 促進椎間盤中央髓核細胞的細胞外基質(zhì)分解代謝并抑制合成，加速椎間盤退變的進展[15]。另有研究顯示，低表達的circ_0001649 可能通過負向調(diào)控Wnt/βcatenin 信號通路影響直腸癌的發(fā)生發(fā)展[16]。本研究所觀察到的circ_0045943 對胃癌轉(zhuǎn)移的影響也有可能是通過靶向miR-106a 影響下游TIMP2 等靶位點，進而使得細胞外基質(zhì)完整性破壞調(diào)節(jié)重塑[17]。

總之，本研究至少在細胞水平證明，circ_0045943調(diào)控胃癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲，其機制可能為靶向miR-106a 而發(fā)揮的miRNA 海綿作用。