王 萍，符 宇，蔣敏敏，王澤瑾，顏 焱，高天雨，王 穎，燕樹勛

0 引言

甲狀腺相關眼病(thyroid-associated ophthalmopathy，TAO)是一種器官特異性自身免疫性疾病，是Graves病(Graves’ disease，GD)最常見、最重要的甲狀腺外器官損害[1]，其發(fā)生率占GD的25%～50%[2]。TAO臨床表現(xiàn)復雜，疾病的活動期主要為明顯的炎癥反應，眼部異常物質如糖胺聚糖(glycosamiboglycans，GAGs)大量沉積、淋巴細胞浸潤和組織水腫引起的眼瞼、結膜充血水腫、眼球突出等。靜止期炎癥活動減退，則出現(xiàn)眶內組織的纖維化和脂肪化，出現(xiàn)眼球運動障礙、斜視和復視等癥狀[3]。TAO導致的顱面畸形、視功能損傷等使患者總體的健康相關生活質量明顯下降[4]。目前多用一般支持療法、糖皮質激素治療、免疫抑制劑治療、球后放射治療、手術等干預TAO[1]，臨床尚缺乏統(tǒng)一、成熟的治療方案[5]。TAO的發(fā)病機制涉及免疫、遺傳、環(huán)境等諸多方面，其中免疫因素與TAO關系密切[6]。越來越多的證據(jù)顯示，輔助性T17(T-helper 17 lymphocyte，Th17)細胞、調節(jié)性T(regulatory T cell，Treg)細胞對TAO免疫平衡的影響至關重要[7]。本文就Th17、Treg細胞及其平衡對TAO的影響進行綜述。

1 TAO的免疫學發(fā)病機制

TAO的具體發(fā)病機制尚不明確。多數(shù)學者認為其發(fā)病以甲狀腺上皮細胞、眼眶成纖維細胞(orbital fibroblasts，OFs)等表達共同抗原所引起的細胞免疫異常為主。促甲狀腺激素受體(thyrotropin receptor，TSH receptor，TSHR)是當前較為肯定的交叉抗原[8]。TSHR表達量的升高能直接參與TAO的發(fā)病，也能在TAO發(fā)生后進一步上升。胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1，IGF-1R)是TAO發(fā)病和進展的另一重要自身抗原[9]。

OFs作為TAO自身免疫反應的靶細胞[10]，可發(fā)揮免疫調節(jié)功能，并有明顯的異質性(細胞在生長過程中，經過多次分裂增殖，在完成其生命周期的同時呈現(xiàn)分子生物學或基因方面的改變，從而產生細胞狀態(tài)或類型的多樣性)。OFs能夠在細胞因子和自身抗體的作用下分化成肌成纖維細胞和脂肪細胞[11]?；罨腡淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞等可通過CD40～CD154共刺激途徑激活OFs，合成并釋放大量的細胞因子、黏附分子和抗體到組織中，影響OFs的增殖和分化，誘導OFs合成并釋放透明質酸(hyaluronic acid，HA)和其他GAGs，并表達免疫調節(jié)蛋白，引起眼眶局部炎癥。GAGs堆積及脂肪形成最終導致眼外肌的增粗、水腫、變性、眼眶脂肪組織體積增大[3]和眼眶結締組織纖維化[6]。同時，激活的OFs分泌大量的細胞因子、生長因子及趨化因子，將更多的免疫細胞進一步募集至眼眶中，導致TAO炎癥反應的失控[12]。在TAO的發(fā)生發(fā)展中外周血纖維細胞也起到了很重要的作用。纖維細胞來源于骨髓，可表達CD45、CD34、趨化因子受體4(CXCR4)和TSHR等表面標志物。TAO患者外周血中CD34+纖維細胞的數(shù)量上升明顯，能夠浸潤眼眶組織并分化成CD34+OF，與眼眶中原有的CD34-OF共同表達TSHR和IGF-1R，且相互調節(jié)[13]。Gillespie等[14]研究表明與健康組相比，TAO患者的外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中有更多的纖維細胞，TSHR表達增加。Smith等[3]認為組成性CD40和主要組織相容性復合體Ⅱ(major histocompatibility complex-Ⅱ，MHC-Ⅱ)在纖維細胞上的表達比OFs更有效，纖維細胞可有效地將抗原呈遞給TAO中的T細胞。

2 Th17和Treg細胞及其功能概述

Th17作為主要的促炎細胞，其增殖、分化過程需要由胸腺基質淋巴細胞(TSLP)、IL-23、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、白細胞介素-1β(interleukin-1，IL-1β)、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、IL-4等共同介導，并需轉錄激活因子3(STAT3)活化和特異性轉錄因子維甲酸相關孤兒受體γt(RORγt)mRNA的表達[15-16]。其中IL-6在促進Th17細胞的分化的同時能夠抑制Treg細胞的分化[17]。Th17細胞主要分泌IL-17(IL-17A)、IL-21、IL-22等細胞因子，表達IL-23受體(IL-23R)及趨化因子受體6(CCR6)。其中IL-17的改變能夠代表Th17細胞水平的改變和疾病的發(fā)生。IL-17能夠促進免疫細胞活化，使靶細胞高表達IL-6、IL-8等細胞因子，從而進一步召集和活化中性粒細胞，導致更多的炎癥因子分泌，最終加重局部炎癥反應及組織損傷。IL-21能夠和STAT3相互作用，上調IL-23、RORγt的表達，擴展Th17細胞的分化狀態(tài)[18]。IL-23作為Th17細胞啟動后進一步拓展和存活的依賴性因子，能促進并維持Th17細胞的分化成熟和生理功能的反饋[19]。

Treg細胞有低反應性及免疫抑制性的特點。叉頭狀轉錄因子P3(fork head boxP3，F(xiàn)oxp3)是Treg細胞的標志性分子[20]。Treg細胞通過分泌細胞因子、細胞間接觸、由Foxp3在轉錄水平調控效應性T細胞的活化過程、延長細胞增值周期、促進細胞死亡、清除活化免疫細胞[21]等多種方式發(fā)揮對效應性T細胞及抗原提呈細胞(antigen-presenting cells，APC)的負調節(jié)作用，還能由改變APC的狀態(tài)來抑制B細胞的過度活化[22]。Treg細胞主要分泌TGF-β、IL-10等細胞因子，表達細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)分子，傳遞抑制信號。高濃度TGF-β在沒有炎性因子介導的情況下，通過信號轉導磷酸化激活轉錄因子Smad2和Smad3刺激FoxP3表達，促使CD4+T細胞分化為Treg細胞[23]。IL-10作為功能強大的抑炎因子，與TGF-β共同誘導Treg細胞分化，同時抑制Th17細胞的反應[24]。

Th17與Treg細胞是CD4+T細胞分化的不同方向，二者共享TGF-β介導的信號通路。TGF-β單獨作用時，活化的初始T細胞分化成Treg細胞。當機體免疫系統(tǒng)被激活，IL-6和TGF-β協(xié)同作用則誘導RORγt mRNA產生，使T細胞向Th17細胞分化，同時抑制Treg的表達。Th17和Treg細胞在機體的免疫反應中既獨立又統(tǒng)一，共同維持機體免疫微環(huán)境的平衡，一旦這種平衡被打破，多種免疫相關疾病便會隨之發(fā)生[25]。

3 Th17細胞在TAO發(fā)生發(fā)展中的作用

Th17細胞在TAO患者眼眶組織的炎癥反應和纖維化中起重要作用[26]。Th17細胞能夠激活免疫細胞和OFs，促進細胞外基質的生成和眼眶組織的炎性改變，引起組織損傷和重塑[27]。IL-17A作為Th17細胞最主要的效應因子，在誘發(fā)炎癥反應中發(fā)揮關鍵作用。眾多研究已證實TAO患者的眼眶細胞及甲狀腺細胞中有IL-17A的增加[28]。有研究顯示，TAO患者外周血中Th17細胞數(shù)量增加、活性提高[29-30]。伴隨著TAO的緩解，Th17細胞數(shù)量逐漸下降[28]。TAO患者OFs及外周血中IL-17A、IL-21、RORγt mRNA表達和IL-6、IL-23、IL-1β數(shù)量明顯增高[31]，并與促甲狀腺素受體抗體(thyrotropin receptor antibody，TRAb)水平[28]、TAO臨床活動性評分(clinical activity score，CAS)正相關[32-33]。此外，CD44作為HA的主要受體，可趨化T細胞黏附于OFs，而Th17細胞表面高表達CD44，可作為招募其浸潤眼眶組織的重要信號分子。

3.1IL-17A促進TAO的炎癥反應IL-17A不僅具有強大的致炎作用，還具有調節(jié)炎癥反應的作用。IL-17A可在全身和眼眶局部組織等多個層面調控TAO的炎癥反應[10,28]。TAO患者中IL-17A可誘導OFs表達促炎基因和蛋白，這種誘導作用具有時間依賴性及劑量依賴性，且能被IL-17A中和抗體完全阻斷[18]。IL-17A通過激活NF-κB通路及MAP激酶(MAPK)刺激纖維細胞和OFs中的IL-6、TNF-α、IL-1β、趨化因子(如MCP-1、CXCL1、CXCL2、CXCL9、CXCL10、CCL7、CCL20)、粒細胞-巨噬細胞刺激因子(GM-CSF)、細胞間黏附分子(ICAM)、前列腺素E2(PGE2)、一氧化氮合成酶、共刺激分子(CD40和MHC Ⅱ)等的表達，招募炎癥細胞并促進其增殖，并將炎癥細胞募集到靶細胞的黏膜表面。同時和其它炎性細胞因子(如TNF-a、IFN-γ)協(xié)同增強炎癥反應[6,30,34-35]。IL-17A與IL-17A受體的結合還可促進B細胞分化為漿細胞而產生TRAb。細胞因子中的IL-6可通過正反饋進一步促進Th17的分化和IL-17A的分泌，激活急性期反應與補體，不斷放大細胞的免疫反應。方思捷等[36]研究表明在IL-17A處理的OFs中，p38 MAPK通路的活化有利于OFs合成和分泌促炎細胞因子。而纖維細胞和OFs可通過PGE2受體EP2或EP4介導的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)途徑促進Th17表型[26,33]。Leskela等[37]發(fā)現(xiàn)TAO患者外周血中T細胞免疫球蛋白黏蛋白-3(TIM-3)及半乳糖凝集素-9(Galectin-9)的表達減少，而TIM-3和Galectin-9表達降低與Th17細胞增加有關。魏洪發(fā)[38]推測miR-146a通過減弱對其靶基因白細胞介素-1受體相關激酶1(IRAK1)的抑制作用而提高IL-17A水平，參與TAO的發(fā)病，且IL-17A的水平能夠反映疾病的嚴重程度。除此之外，IL-17A的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與TAO的易感性有一定聯(lián)系[39]。Th17細胞還可與Th1細胞協(xié)同介導TAO的眼眶炎癥反應。李琳娜[40]研究表明甲強龍能夠抑制活動期TAO患者PBMC中Th17細胞的增殖及IL-17A表達，糖皮質激素對Th17細胞的調節(jié)作用是其臨床治療TAO的機制之一。

除了眼眶結締組織外，淚腺腺泡細胞也可表達TSHR，是TAO的靶器官之一。TAO患者淚腺的炎癥會引起不同程度的干眼癥狀，影像學可表現(xiàn)為淚腺體積增大[41]。TAO患者淚腺的大小與淚液中IL-17A等炎性因子的水平正相關[42]。

3.2IL-17A推動TAO眼眶結締組織的纖維化IL-17A能刺激多種細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的基因及蛋白表達水平上調[26]。ECM的增加不但是推動TAO纖維化病變的重要因素，還是TAO的重要病理特征。α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)是成纖維細胞分化成肌成纖維細胞的重要標志，IL-17A在激活成纖維細胞的同時能夠提高TAO患者OFs中α-SMA基因及蛋白的表達。IL-17A還可通過JNK-c-Jun信號通路與TGF-β協(xié)同促進TAO患者來源的CD90+OF細胞分化為肌成纖維細胞并合成ECM[26]。需要說明的是，以往的研究多認為TGF-β能抑制大部分T細胞的反應，促進抗炎的Treg細胞產生，然而新近的實驗表明TGF-β可以誘導未致敏的T細胞表達RORγt，促進小鼠原始T細胞分化成Th17細胞。TGF-β有雙重作用，能夠誘導原始T細胞分化為Treg細胞或Th17細胞。在無其他細胞因子參與時可抑制Th17細胞分化，但在細胞因子IL-6、IL-23、IL-1、TNF-α等參與時促進Th17細胞的分化，且?guī)椭鶷h17細胞抵抗Treg細胞的抑制作用[43]。

OFs對IL-17A反應的異質性使IL-17A對OFs在纖維化和脂肪化的平衡中更趨向于發(fā)生纖維化改變。在TAO的整個病程中，無論球后脂肪組織增生的多少，患者的眼眶結締組織最終都會發(fā)生不同程度的纖維化變性。

3.3IL-17A抑制TAO眼眶結締組織的成脂分化TAO中被激活的T細胞能夠產生促進脂肪生成的前列腺素，刺激前脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞，擴大眼眶組織體積。然而IL-17A可通過GSK-3β-CEBP/α通路抑制TAO的成脂分化過程。IL-17A有利于CD90-OF中脂肪的降解，在成脂分化的早期階段加速脂肪相關蛋白的分解代謝，在中后期階段能對過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)激動劑介導的眼眶脂肪細胞的分化產生直接干擾作用[29]。而IL-6、IL-4、IL-10等能夠提高眼眶組織中TSHR的表達，促進脂肪轉化。上述證據(jù)表明，IL-17A可在一定程度上抑制TAO眼眶結締組織的成脂分化。

3.4Th17細胞其他細胞因子對TAO的影響IL-21、IL-23雖然不是Th17細胞所特有的，但它們能夠維持Th17細胞的表型及功能。體外實驗表明，IL-21單獨作用能夠引起少量Th17細胞的產生，和TGF-β協(xié)同刺激后能夠促進Th17細胞大幅增殖，上調IL-23R和RORγt的表達[44]。IL-21還可誘導IL-6缺失的T細胞分化為Th17細胞，提示IL-21可能作用在IL-6下游，能在一定程度上取代IL-6。IL-21結合IL-21受體能通過JAK/STAT信號通路促進T細胞增殖，使免疫細胞活化。TAO患者外周血中IL-21水平增加[27]。

IL-23可誘導Th17細胞分泌更多的IL-17A，同時分泌IL-22，穩(wěn)定和擴增Th17細胞的表型[44]。未致敏的T淋巴細胞分化成Th17細胞的同時生成有抗炎作用的IL-10，可抑制Th17細胞的致炎能力，然而IL-23能夠降低IL-10的表達，提高IL-17A的表達及致病效應。IL-23與其受體的結合能夠激活Janus激酶(Jak2和Tyk2)，形成STAT的對接位點，STAT的磷酸化可激活IL-17A和IFN-γ的轉錄。有研究提示IL-23R SNP變異也與TAO的易感性有關。李紅林等[45]報道了IL-23在TAO患者外周血中表達升高。

4 Treg細胞在TAO發(fā)生發(fā)展中的作用

Treg細胞膜受體和MHC Ⅱ類分子相互作用，遞呈促甲狀腺素受體肽，參與TAO的發(fā)病過程。Treg細胞的減少使機體對TSHR的免疫耐受降低，導致甲狀腺自身抗體的產生和活化，尤其是TRAb的活化[46]。研究表明，Treg細胞在TAO患者PBMC中所占的比例較GD組、健康組下降[47]。TAO患者Foxp3 mRNA的表達顯著降低[29]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，通過利妥昔單抗(Rituximab)治療后的重度TAO患者，其體內Treg細胞的水平得到明顯提升。

4.1PD-1增強Treg細胞的免疫耐受功能延緩TAO進展活化的Treg細胞表面可表達程序性死亡受體1(PD-1)。PD-1是負性共刺激分子，它通過與其配體PD-L1、PD-L2的結合，增強Treg的免疫耐受功能[48]。TAO患者外周血PD-1及PD-L1陽性的Treg細胞數(shù)少于GD患者及健康人，PD-1/PD-L1低于GD患者。TAO患者經糖皮質激素沖擊治療后外周血CD4+T細胞表面PD-1表達率上調，同時TRAb滴度、CAS評分改善。糖皮質激素能夠刺激Treg細胞分泌TGF-β、IL-10等細胞因子。增加Treg細胞因子分泌、上調T細胞表面PD-1表達率可能是糖皮質激素抑制TAO自身免疫反應的機制之一[49]。Shi等[50]發(fā)現(xiàn)Treg細胞表面的PD-1可向樹突狀細胞(DC)傳遞負向信號，減少DC表面CD40、CD80、CD86的表達，引發(fā)DC的成熟障礙，抑制DC的抗原遞呈功能。

4.2雌激素增強Treg細胞數(shù)目延緩TAO進展Treg的功能受雌二醇(E2)的正性調控，是E2發(fā)揮免疫抑制、抗炎及增加免疫耐受等作用的中介因子。體內及體外實驗均證實E2可以增加Treg細胞數(shù)目，使Treg表達Foxp3增多，TGF-β、IL-10分泌增加[51]，從而加強Treg細胞的免疫抑制作用。伴隨雌激素水平的改變，Treg的數(shù)量及功能也發(fā)生改變[52]。因雌激素受體(ERα)基因多態(tài)性的影響，不同個體E2的生物學效應不同，這可能是造成TAO患者療效差異較大的原因之一。研究表明TAO患者ERa基因Xba I位點AA基因攜帶者的ER含量的降低能夠直接影響E2對Treg的作用，造成Treg數(shù)目或功能的下降，這可能是女性TAO發(fā)生的機制之一[53]。

4.3差異研究探討盡管多數(shù)研究認為TAO患者體內Treg細胞減少，免疫抑制作用下降。但也有一些研究出現(xiàn)了不同的結果。有研究顯示TAO患者外周血中Treg細胞較健康者增多，但其抑制作用明顯下降[54]。也有研究顯示TAO患者外周血Treg細胞數(shù)目和健康者無差異。造成這些差異的原因可能是：(1)炎癥部位的大量炎癥因子能夠引起負反饋調節(jié)而提高Treg的數(shù)量。甲狀腺自身免疫性疾病患者外周血Treg細胞數(shù)目的增加是一種代償反應，且與TAO發(fā)病相關的主要是Treg細胞功能的衰退[55]；(2)不同研究對Treg細胞的界定不一。對Treg細胞的定義有CD4+CD25+T細胞、CD4+Foxp3+T細胞、CD4+CD25+Foxp3+T細胞的不同。激活的CD4+T細胞同樣表達CD25，把CD4+CD25+作為Treg細胞的標志可造成結果偏高；而CD4+Foxp3+T細胞根據(jù)是否表達CD45RA、Foxp3和CD25又可分為3個亞群，只標記Foxp3會造成結果偏低。目前多數(shù)研究認為用CD4+CD25+Foxp3+T細胞界定Treg細胞較為合適[56]；(3)忽視了性別對免疫系統(tǒng)的影響。雌激素是一種免疫調節(jié)劑，能夠調節(jié)Treg細胞的表型[52]；(4)TAO發(fā)展的不同階段和CAS的差異會影響眼眶結締組織的免疫炎癥進程；(5)不同檢測方法對檢測結果也會產生影響。

5 Th17/Treg細胞失衡促進TAO發(fā)展

多種自身免疫性疾病中均存在Th17/Treg穩(wěn)態(tài)的破壞[43]。國內外研究發(fā)現(xiàn)Th17/Treg失衡同樣參與了TAO的發(fā)生發(fā)展，并在一定程度上反映TAO的嚴重程度[56]。Li等[7]發(fā)現(xiàn)TAO患者Th17/Treg比值升高。Th17細胞和Treg細胞的誘導分化可相互排斥，兩者調節(jié)作用相反。有學者認為Treg細胞不僅參與了Th17細胞的分化，其本身也能夠向Th17細胞轉化[57]。部分研究認為，TAO激素治療后癥狀的緩解伴隨著其免疫系統(tǒng)重新進入一種免疫穩(wěn)態(tài)[58]。自身免疫性甲狀腺疾病患者發(fā)病和緩解兩個階段的T細胞表面受體(T cell receptor，TCR)免疫組庫的多樣性、克隆遷移、克隆擴增和分布都沒有大的變化，已緩解的TAO患者外周血中還存在針對TSHR的自身反應性T細胞，但其Th17/Treg細胞降低，Th17/Treg平衡在一定程度上得到恢復[59]。有學者對多發(fā)性硬化癥患者和強直性脊柱炎患者接受造血干細胞移植后的免疫狀態(tài)進行動態(tài)監(jiān)測，結果顯示盡管經歷了大劑量化療和造血干細胞移植，患者體內依然存在大量致病性T細胞[60]。這也說明自身免疫性疾病的緩解不是通過消除反應性克隆，而是通過重建免疫平衡來實現(xiàn)的。這在一定程度上也佐證了Th17/Treg細胞失衡對自身免疫性疾病的重要作用。Th17/Treg細胞平衡的不穩(wěn)定性可能是TAO容易復發(fā)的原因之一[61]。Th17、Treg細胞影響TAO自身免疫反應的機制見圖1。

圖1 Th17、Treg細胞對TAO自身免疫反應的影響模式圖 Th17:Th17細胞；Treg:Treg細胞；TRAb:促甲狀腺素受體抗體；TSHR:促甲狀腺激素受體；IGF-1R:胰島素樣生長因子1受體；HA:透明質酸；GAGs:糖胺聚糖；PG:前列腺素。綠色箭頭：促進或刺激；藍色箭頭：分化；黑色箭頭：引起癥狀或免疫指標異常；紅色抑制符：抑制或下調。

6 總結和展望

綜上，Th17細胞可促進TAO的炎癥反應及眼眶結締組織的纖維化，抑制TAO眼眶結締組織的成脂分化。Treg細胞可抑制TAO的免疫反應，維持免疫耐受。TAO的發(fā)生發(fā)展和Th17/Treg細胞免疫失衡密切相關。但目前關于Th17、Treg細胞及其下游靶基因等作用于TAO的具體機制尚不完全明了，有待進一步研究。目前雖已有針對IL-17A的多種單抗抑制劑被成功開發(fā)，但尚未在臨床大范圍應用于對TAO的治療。繼續(xù)研究Th17、Treg細胞對TAO影響的機制、研發(fā)調節(jié)Th17/Treg失衡的單抗治療藥物或中和異常表達細胞因子的制劑，可為TAO的防治提供新的思路和方法。