侯紅平，宋 玲，陳騰飛，高云航，彭 博，王彩霞，葉祖光，張廣平

（中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 100700）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是來自非心源性因素引起的急性感染性疾病，可由多種因素誘發(fā)，包括創(chuàng)傷、肺炎、敗血癥、休克和感染等，主要病理改變?yōu)檠仔约毎?、炎癥因子大量產(chǎn)生和彌散在肺部組織，從而出現(xiàn)炎癥反應(yīng)失控，即“炎癥風暴”[1-2]，這與新冠肺炎加重期的“炎癥風暴”極為類似。血必凈注射液由紅花、赤芍、川芎、丹參、當歸組成，具有化瘀解毒的功效，適用于因感染誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征，在試行第四版和第五版《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》中，血必凈注射液在西醫(yī)治療方案中被推薦用于治療重型和危重型病例，在中醫(yī)治療方案中被推薦用于中期“疫毒閉肺”和重癥期“內(nèi)閉外脫”兩個證候的治療[3-4]。

復方苦參注射液是由苦參、白土苓組成的一種純中藥制劑，具有清熱利濕、通絡(luò)活血、散結(jié)止痛等功效，目前廣泛用于惡性腫瘤的治療，能夠緩解癌痛及出血[5-6]?，F(xiàn)代藥理研究表明，復方苦參注射液的有效成分為苦參堿、氧化苦參堿和苦參黃酮類等，不僅具有止痛、抗腫瘤的功能，而且能夠調(diào)節(jié)人體的免疫力，具有抗炎[7]、抗心律失常[8]、抗纖維化[9]等作用。既往研究表明，復方苦參注射液能夠抑制巨噬細胞中核因子（NF）-κB的活化，有效阻止人體中炎性因子的釋放，保護人體肺組織[5]。本研究旨在對比復方苦參注射液與血必凈注射液對ALI大鼠的炎癥抑制作用，為臨床治療藥物的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和主要試劑 復方苦參注射液購于山西振東制藥股份有限公司，批號：20 181034；血必凈注射液購于天津紅日藥業(yè)有限公司，批號：1 906251；地塞米松磷酸鈉注射液購于貴州天地藥業(yè)有限責任公司，批號：19110802A。脂多糖（LPS）干粉購于美國Sigma公司，批號：039M4004V；甲醛購于天津市大茂化學試劑廠，批號：20 180801；白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子（TNF-α）購于北京索萊寶科技有限公司；NF-κB酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購于武漢華美生物工程有限公司，批號：C08033095。

1.2 實驗動物和分組 SPF級Wistar大鼠，體重180～200 g，購自北京維通利華試驗動物技術(shù)有限公司，動物使用許可證號：SYXK（京）2019-0003。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠隨機分為7組，分別為正常組、模型組、陽性對照組、血必凈注射液組及苦參注射液高、中、低劑量組，每組12只，雌雄各半。

1.3 造模和給藥[9]除正常組外，其余各組均口鼻霧化吸入LPS溶液（濃度4 mg/mL）復制急性肺損傷模型，1次/d，15 min/次，連續(xù)3 d。造模后立即給藥，陽性對照組尾靜脈注射地塞米松注射液（4 mg/kg），血必凈注射液組腹腔注射4 mL/kg血必凈注射液，苦參注射液高、中、低劑量組分別腹腔注射4 mL/kg、2 mL/kg、1 mL/kg復方苦參注射液，正常組和模型組均給予等體積生理鹽水，連續(xù)給藥3 d。末次造模后15 h各組進行第4次給藥。

1.4 樣本收集 給藥后1 h，用10%水合氯醛麻醉（4 mL/kg）大鼠，腹主動脈采血，暴露肺和氣管，結(jié)扎右肺，PBS灌洗左肺（2次，2 mL/次，30 s/次，合并灌洗液），部分右肺組織加入PBS緩沖液（按1∶10比例），進行組織勻漿。將灌洗液和組織勻漿液離心（2 500 r/min，10 min），取上清，分裝。剩余右肺組織以10%甲醛溶液固定，用于病理學觀察。

1.5 炎癥因子檢測 采用ELISA法檢測肺灌洗液和組織勻漿中IL-1β、IL-6、NF-κB和TNF-α的含量。檢測過程嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.6 組織病理學檢查 取右肺組織，以10%甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋，制成4μm厚石蠟切片，行蘇木精—伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察肺組織的病理學變化。根據(jù)Roderick的病理學分級標準[10]，將上述肺部損傷狀況分為0～3級。0級：肺泡壁完好無增厚，無炎性浸潤，無充血；1級：肺泡間隔少量彌散性炎性細胞（中性粒細胞）浸潤，肺泡壁未見增厚；2級：肺泡間隔較多炎性細胞（中性粒細胞、單核細胞）浸潤，肺泡壁輕微增厚（1～2倍）；3級：肺泡間隔大量的彌漫性炎性細胞（中性粒細胞為主）浸潤，個別區(qū)域肺泡壁增厚2～3倍。

1.7 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（P25～P75）]表示，等級資料采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肺組織HE染色結(jié)果 正常組支氣管、肺泡結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)正常；模型組主要表現(xiàn)為肺泡間隔內(nèi)炎性細胞（中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞）浸潤，肺泡間隔增厚，支氣管黏膜上皮破壞脫落，伴肺泡絮狀物（肺水腫）等滲出性改變；陽性對照組、復方苦參注射液高劑量組和血必凈注射液組肺組織的損傷程度減輕，表現(xiàn)為肺間隔輕度增寬，少量炎性細胞浸潤，見圖1。與正常組比較，模型組肺組織炎性細胞浸潤程度升高，陽性對照組、血必凈注射液、苦參高劑量組肺組織炎性細胞浸潤程度低于模型組，見表1。

圖1 肺組織HE病理染色圖（×200）

表1 各組肺組織炎性細胞浸潤等級比較

2.2 各組肺灌洗液中炎癥因子水平比較 與正常組比較，模型組肺灌洗液中IL-1β、IL-6、NF-κB和TNF-α水平升高；與模型組比較，陽性對照組、血必凈注射液組及苦參高、中劑量組肺灌洗液中IL-1β、IL-6、NF-κB和TNF-α水平降低，苦參低劑量組IL-6水平降低；與血必凈注射組比較，苦參高、中劑量組肺灌洗液中NF-κB水平下降，苦參中劑量組TNF-α水平降低，見表2。

表2 各組肺灌洗液中炎癥因子水平比較 pg/mL，M（P25～P75），n=12

2.3 各組肺組織中炎癥因子的表達水平比較 與正常組比較，模型組肺組織中IL-1β、IL-6、NF-κB和TNF-α的表達水平升高；與模型組比較，苦參高、中劑量組及陽性對照組肺組織中IL-1β、IL-6、NF-κB和TNF-α表達水平降低，苦參低劑量組和血必凈注射液組肺組織IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平降低；與血必凈注射液組比較，苦參中劑量組肺組織NF-κB和TNF-α表達水平下降，見表3。

表3 復方苦參注射液和血必凈注射液對肺組織中炎癥因子表達的影響 pg/μg prot，M（P25～P75），n=12

3 討論

現(xiàn)代藥理研究表明，復方苦參注射液能夠抑制腫瘤細胞的生長，增加白細胞的數(shù)量，提高機體免疫力，同時對各種實體瘤引起的疼痛和出血具有明顯的治療效果[11-12]。本研究肺組織病理染色顯示，模型組肺組織炎性細胞浸潤程度高于正常組，而苦參高劑量和血必凈組肺組織病理損傷較模型組有一定的改善。提示復方苦參注射液和血必凈對急性肺損傷大鼠有肺保護作用。

近年來，復方苦參注射液被用于放射性肺損傷的臨床預防和治療中。研究報道，輔以復方苦參注射液干預的放射性肺損傷患者TGF-β1、TNF-α、IL-6和IL-10水平降低，而CD3+、CD4+、CD4+/CD8+升高[13-15]。提示復方苦參注射液不僅能夠提高患者的機體免疫力，同時能夠降低機體的炎癥水平，從而達到減輕肺損傷的目的。LPS能夠激活巨噬細胞，進而促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生。巨噬細胞是吞噬性白細胞，在先天免疫炎癥反應(yīng)中起重要作用。活化的巨噬細胞分泌各種細胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性細胞因子[16]。其中，TNF-α作為一種重要的促炎介質(zhì)，參與多種炎癥信號通路，其表達對急性肺炎、肺功能損傷等病理生理改變起到關(guān)鍵作用[17]。IL-1β作為機體重要的免疫調(diào)節(jié)因子，能夠促進T細胞和B細胞的增殖、分化，對中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞產(chǎn)生趨化作用，同時誘導IL-2、IL-6和TNF-α等因子的表達[18]。IL-6同樣作為一種促炎細胞因子，能夠刺激免疫細胞的增殖和分化，激活下游STAT信號傳導途徑，增強機體炎癥反應(yīng)[19]。因此，TNF-α、IL-1β和IL-6常作為檢測炎癥反應(yīng)的指標。本研究中，模型組肺灌洗液和肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量升高，陽性對照組、血必凈注射液組及苦參高、中劑量組IL-1β、IL-6、NF-κB和TNF-α水平降低，且苦參中劑量組肺灌洗液和肺組織中TNF-α水平低于血必凈注射液組。表明復方苦參注射液和血必凈注射液均能夠緩解LPS誘導的大鼠急性肺損傷炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

細胞核因子NF-κB是多功能的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控著包括細胞因子、炎癥因子、趨化因子、細胞黏附和凋亡等相關(guān)基因的表達，在機體免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用[20]。NF-κB的活化促使許多編碼炎癥介質(zhì)、細胞因子等的促炎基因表達上調(diào)，使得炎癥反應(yīng)級聯(lián)放大。因此，NF-κB表達水平檢測可反映機體炎癥情況。本研究中，模型組肺灌洗液和肺組織中NF-κB水平升高，陽性對照組、血必凈注射液組及苦參高、中劑量組NF-κB表達水平降低，且苦參中劑量組肺組織NF-κB表達水平低于血必凈注射液組。表明血必凈注射液和苦參注射液均可通過下調(diào)NF-κB表達來減輕急性肺損傷大鼠炎癥反應(yīng)。從TNF-α和NF-κB的表達情況來看，高、中和低劑量的苦參注射液沒有體現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，且中劑量的表達效果優(yōu)于高劑量，推測可能與苦參提取物所含的生物堿類（苦參堿、氧化苦參堿等）具有毒性密切相關(guān)，劑量過大時會有不同程度的臟器損傷，并對神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷[9]。同時，炎癥因子的表達應(yīng)與組織病理HE染色等其他指標綜合分析，才能得到科學可信的結(jié)果。

綜上，復方苦參注射液和血必凈注射液對LPS誘導的大鼠急性肺損傷均有一定的治療效果，能夠有效抑制肺組織炎癥反應(yīng)，且復方苦參注射液的改善作用更為明顯。