江 惠，賴永靜，李 驊，馮一唯，夏 巍，唐安洲

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 廣西醫(yī)科大學(xué)區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021）

樹鼩是一種小型哺乳動物，隸屬攀鼩目，主要分布于馬來西亞、菲律賓，我國云南、廣西等地區(qū)[1]。樹鼩與靈長類親緣關(guān)系較近[2]，并且具有繁殖周期短、飼養(yǎng)成本低的特點(diǎn)，因此被用于人類疾病的預(yù)防和治療研究，國內(nèi)外學(xué)者已建立多種疾病樹鼩模型[3-11]。然而，相比大鼠、小鼠等成熟的模型動物，目前樹鼩特異性抗體等實(shí)驗(yàn)試劑的開發(fā)尚不充分，影響對諸如樹鼩免疫系統(tǒng)特性等方面的研究。流式細(xì)胞術(shù)是一種通過流式細(xì)胞儀快速定量分析細(xì)胞群的物理化學(xué)特征，并根據(jù)這些特征精確分選細(xì)胞的技術(shù)，通過加入特異性抗體可將細(xì)胞群進(jìn)一步細(xì)分，如將外周血淋巴細(xì)胞分為CD3、CD4、CD8等，可用于免疫學(xué)[12-14]、細(xì)胞和分子生物學(xué)等方面研究[15]。建立和開發(fā)樹鼩特異性抗體是一項(xiàng)投入較大的基礎(chǔ)工程，需要進(jìn)行系統(tǒng)研究，逐步開發(fā)完善。近年有學(xué)者通過篩選其他物種來源（小鼠、兔等）的熒光抗體，根據(jù)抗原抗體交叉反應(yīng)的特性，進(jìn)行樹鼩細(xì)胞表型分析，結(jié)果表明小鼠的相應(yīng)抗體具有相對特異性和敏感性[16-18]。使用跨物種抗體具有價(jià)格低、獲取方便等優(yōu)勢，可為建立樹鼩淋巴細(xì)胞分析和數(shù)量變化方法提供快捷路徑。

環(huán)孢素A（cyclosporine A，CsA）是由真菌代謝產(chǎn)物中提取得到的由11個(gè)氨基酸組成的環(huán)狀多肽，可選擇性抑制T細(xì)胞活化[19]，對B細(xì)胞的抑制作用弱，可部分抑制T細(xì)胞依賴的B細(xì)胞反應(yīng)，常用于抑制淋巴細(xì)胞。本研究主要應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)，探索建立一種適用于樹鼩外周血淋巴細(xì)胞的檢測方法，并且利用該方法動態(tài)觀察注射CsA樹鼩的淋巴細(xì)胞、CD4+、CD19+細(xì)胞百分比的變化，為樹鼩動物模型的建立及人類免疫缺陷相關(guān)疾病的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康成年樹鼩18只，體重110～160 g，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，為人工繁育的普通級中緬樹鼩滇西亞種，飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，采用金屬籠具單籠飼養(yǎng)，內(nèi)置休息木盒，室溫22～25℃，濕度40%～60%，每日光照12～14 h，保持籠具、食具清潔衛(wèi)生，定時(shí)喂食谷物、面包蟲、水果等，自由飲水，室內(nèi)保持安靜。實(shí)驗(yàn)過程中樹鼩的飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作均符合廣西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑及儀器 PBS（Solarbio，北京）、FITC倉鼠抗小鼠CD3（BD，美國）、APC大鼠抗小鼠CD4（BD，美國）、APC抗鼠CD19（Biolegend，美國）、牛血清白蛋白（BSA，BioFroxx，德國）、紅細(xì)胞裂解液（Solarbio，北京）、臺盼藍(lán)染色液（Sigma、美國）。流式細(xì)胞儀（BD FACSVerse，美國）、臺式高速低溫離心機(jī)（Eppendorf 5810R，德國）、光學(xué)顯微鏡（Olympus，日本）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 將18只樹鼩隨機(jī)分為空白組（10只）、CsA高劑量組（4只）和CsA低劑量組（4只）?？瞻捉M不予處理。CsA高、低劑量組分別經(jīng)腹腔注射20 mg/kg和40 mg/kg的CsA，連續(xù)注射35 d，1次/d。采血當(dāng)日不注射。

1.4 血樣采集 分別在第1、第7天，抽取空白組股靜脈血1 mL（比較不同時(shí)間淋巴細(xì)胞及各亞群差異，以檢驗(yàn)流式實(shí)驗(yàn)操作的穩(wěn)定性）。分別在第0（注射CsA前1 d）、第7、第13、第20、第29、第35天，抽取CsA高、低劑量組股靜脈血1 mL。采血前12 h禁食，將動物固定于保定裝置，采血后迅速放入含有EDTA抗凝劑的采血管中，輕輕搖晃混勻，室溫放置。

1.5 樹鼩外周血單細(xì)胞懸液的制備 采集的血液加入3倍體積紅細(xì)胞裂解液，冰上裂解15 min；4℃離心10 min（2 000 r/min），棄上清液，加入2倍體積裂解液，吹打混勻，動作輕柔，再次4℃離心10 min（2 000 r/min）；小心吸棄上清液，用染色緩沖液重懸，即得外周血單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)/mL，置于冰上避光備用。

1.6 臺盼藍(lán)染色法檢測兩種不同染色緩沖液對細(xì)胞存活率的影響 取空白組外周血單細(xì)胞懸液10μL（之前分別用兩種不同染色緩沖液：1×PBS溶液、含1%BSA的1×PBS溶液重懸），加入10μL臺盼藍(lán)進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察、拍照，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=活細(xì)胞數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)量。死細(xì)胞被染成藍(lán)色。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測樹鼩外周血淋巴細(xì)胞表面分子 將樹鼩外周血單細(xì)胞懸液分裝到無菌無酶的潔凈1.5 mL EP管中，每管100μL；避光加入1μL流式熒光抗體，輕輕搖晃混勻，4℃避光孵育30 min；加入1 mL染色緩沖液，輕輕搖晃混勻；1 300 r/min離心5 min，小心吸棄上清液；加入200μL染色緩沖液重懸，流式細(xì)胞儀檢測樹鼩外周血淋巴細(xì)胞及其亞群（CD3+、CD4+、CD19+）。將CsA高、低劑量組的第0天結(jié)果（淋巴細(xì)胞及亞群百分率）均設(shè)為100%，計(jì)算第7、第13、第20、第29、第35天結(jié)果與第0天結(jié)果的比值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用flowjo（10.6.2）軟件分析流式數(shù)據(jù)。采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樹鼩外周血模型 SSC為側(cè)向散射光，表示細(xì)胞內(nèi)容物的復(fù)雜度，F(xiàn)SC為前向散射光，表示細(xì)胞體積的大小。樹鼩外周血與靈長類動物結(jié)果相似，顯示樹鼩外周血可清晰地分為4群，分別為細(xì)胞體積較大、胞內(nèi)容物較豐富的粒細(xì)胞（a），中等大小的髓樣細(xì)胞（b），體積較小的淋巴細(xì)胞（c）以及小顆粒（紅細(xì)胞、血小板和碎片，d），見圖1。

圖1 樹鼩外周血FSC/SSC模式圖

2.2 不同染色緩沖液對細(xì)胞存活率的影響 用含1%BSA的PBS作為染色緩沖液重懸的細(xì)胞存活率高于用PBS重懸的細(xì)胞（P＜0.05），見圖2。

圖2 不同染色緩沖液對細(xì)胞活率的影響

2.3 空白組不同采血時(shí)間的外周血淋巴細(xì)胞及其亞群百分率比較 空白組不同采血時(shí)間的外周血淋巴細(xì)胞、CD3+、CD4+、CD19+百分率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。CD3+細(xì)胞百分率的檢測結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差過大，因此該實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可信，見圖3。

圖3 空白組不同采血時(shí)間的外周血淋巴細(xì)胞及其亞群百分率比較

2.4 動態(tài)監(jiān)測注射CsA樹鼩淋巴細(xì)胞及亞群百分率變化 由于前述結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)中所使用的CD3抗體并不適用于檢測樹鼩CD3+細(xì)胞，故僅對注射低劑量和高劑量CsA樹鼩的淋巴細(xì)胞、CD4+、CD19+細(xì)胞進(jìn)行動態(tài)觀察（35 d）。

CsA高、低劑量組淋巴細(xì)胞在注射前兩周下降，在第3、第4周有所上升，第5周下降；兩組CD4+細(xì)胞在第1周有輕微上升趨勢，第2周明顯下降，之后呈先升高再下降的趨勢；CsA低劑量組CD19+細(xì)胞在前3周先下降后上升，隨后持續(xù)下降，而高劑量組在整個(gè)觀察期內(nèi)呈持續(xù)下降趨勢，見圖4。

圖4 注射CsA后樹鼩外周血淋巴細(xì)胞、CD4+和CD19+細(xì)胞百分率的變化

3 討論

本研究建立了一種應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測樹鼩的外周血淋巴細(xì)胞的方法，F(xiàn)SC/SSC模式圖顯示所制備的樹鼩外周血淋巴細(xì)胞樣本分群良好、細(xì)胞碎片少。在PBS中加入1%BSA后，提高了裂解后的細(xì)胞存活率，細(xì)胞狀態(tài)對于流式分析上機(jī)的結(jié)果影響較大，存活率高的單細(xì)胞懸液能夠盡可能地排除實(shí)驗(yàn)的誤差，得到更準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，同時(shí)也為流式細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)打下了基礎(chǔ)，狀態(tài)良好的細(xì)胞有利于分選實(shí)驗(yàn)后的細(xì)胞培養(yǎng)與功能檢測相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

使用相同的紅細(xì)胞裂解以及樣本染色實(shí)驗(yàn)流程分別在第1天和第7天檢測空白組樹鼩外周血淋巴細(xì)胞、CD3+細(xì)胞、CD4+細(xì)胞和CD9+細(xì)胞的百分比，以探究實(shí)驗(yàn)操作的穩(wěn)定性，同時(shí)評估跨物種流式抗體應(yīng)用于樹鼩外周血淋巴細(xì)胞樣本的可行性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同時(shí)間淋巴細(xì)胞、CD4+細(xì)胞、CD19+細(xì)胞百分率均無明顯差異，可認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)建立的流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定、可靠。由于CD3為T細(xì)胞廣譜的表面分子，本實(shí)驗(yàn)中使用的CD3抗體與細(xì)胞表面結(jié)合后檢測得出的百分比相對較低，并且標(biāo)準(zhǔn)差較大，說明抗體與細(xì)胞結(jié)合不夠穩(wěn)定，即該抗體不適用于檢測樹鼩外周血CD3+細(xì)胞免疫表型。因此，對于已經(jīng)篩選出的跨物種抗體，如要用于樹鼩研究，應(yīng)進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性。

此外，本研究結(jié)果顯示，注射CsA樹鼩的淋巴細(xì)胞、CD4+、CD19+細(xì)胞總體呈下降趨勢，與CsA藥理學(xué)作用相符，證明CsA對樹鼩有免疫抑制效果，可用于制備免疫抑制狀態(tài)的樹鼩模型。目前已有樹鼩免疫細(xì)胞表面分子相關(guān)研究，并且學(xué)者們也相繼進(jìn)行樹鼩特異性抗體制備的探索[20-24]，相信未來針對樹鼩的研究工具，包括其專用的試劑、適合樹鼩的實(shí)驗(yàn)方法等將逐漸完善。然而，目前難以通過流式細(xì)胞學(xué)方法精確分析樹鼩免疫細(xì)胞表型，今后將進(jìn)一步探索樹鼩模型，制備樹鼩特異性抗體，更好地利用流式細(xì)胞術(shù)分析樹鼩免疫系統(tǒng)特性，完善樹鼩作為免疫相關(guān)疾病動物模型的建立。

綜上，本研究在缺乏樹鼩特異性抗體的情況下，建立了適用于樹鼩外周血樣本檢測的流式細(xì)胞學(xué)方法，利用抗體的交叉反應(yīng)性篩選了適合用于分析樹鼩外周血CD4+和CD19+細(xì)胞的抗體，觀察到樹鼩在免疫抑制狀態(tài)下外周血淋巴細(xì)胞、CD4+以及CD19+細(xì)胞的變化趨勢，為進(jìn)一步研究樹鼩的T、B淋巴細(xì)胞對感染的反應(yīng)以及其對疾病發(fā)生、發(fā)展的作用打下基礎(chǔ)。