黃奕璇，蔣莉夏，何 云，劉 元，楊 斌，黃春英△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530021；2.玉林市中醫(yī)醫(yī)院，玉林 537000；3.廣西中醫(yī)藥研究院，南寧 530021）

肝臟在機體遭受外界持續(xù)性刺激（如病毒、酒精、藥物、代謝失調(diào)等）時，肝臟中膠原蛋白（以Col-Ⅰ和Col-Ⅲ為主）等細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分過度積累，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生[1-3]。肝纖維化是可逆的，但會進展為肝硬化甚至肝癌，嚴(yán)重威脅人類生命健康[4]。在目前對肝硬化尚無理想病因根治的情況下，有效地防治肝纖維化是一項極為重要的對策。研究表明，在肝纖維化的發(fā)病機制中，肝星狀細(xì)胞（HSC）發(fā)揮核心作用[5]?；罨腍SC在肝損傷部位移動、增殖，表達各種信號傳導(dǎo)蛋白，產(chǎn)生大量ECM成分和細(xì)胞因子，是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)[5]。因此，有效抑制HSC活化、增殖，減少ECM合成，誘導(dǎo)凋亡和阻滯細(xì)胞周期是阻斷、逆轉(zhuǎn)肝纖維化的重要策略[6-8]。

棒柄花是大戟科棒柄花屬植物，棒柄花葉為棒柄花植物的葉子。棒柄花苷A[反式-4-（1-丙烯基）-苯酚-β-D-吡喃葡萄糖苷，PPGA]是棒柄花葉中主要的苯丙素類物質(zhì)，具有較強的化學(xué)專屬性[9]。苯丙素類化合物具有抗菌、消炎、抗氧化、護肝和抗腫瘤等作用。但目前PPGA對肝纖維化的作用及其機制尚未完全闡明。本研究通過白介素-1β（IL-1β）來刺激HSC-T6細(xì)胞，建立體外肝纖維化模型，探討PPGA對HSC-T6細(xì)胞增殖、膠原、凋亡及細(xì)胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物和主要試劑 PPGA（純度≥95%）由廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院提取、分離。IL-1β購于PeproTech公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購于Gibco公司，胎牛血清購于AusGeneX公司，PBS緩沖液和噻唑藍（MTT）購于Solarbio公司，細(xì)胞周期檢測試劑盒和AnnexinV-FITC/7-AAD熒光雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于Elabscience公司，吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）熒光染色試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，兔Col-Ⅰ、Col-Ⅲ多克隆抗體購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，封閉山羊血清購于北京中杉金橋公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將HSC-T6細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清和0.5%雙抗（青－鏈霉素）的DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以1∶3比例傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.3 MTT法測定PPGA對HSC-T6細(xì)胞活力的影響 取處于對數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，離心、計數(shù)，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液配制成5×104個/mL的細(xì)胞懸液，按100μL/孔加入96孔培養(yǎng)板中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，分別用不同濃度的PPGA（6.25 mg/L、12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L和800 mg/L）處理細(xì)胞24 h、48 h和72 h。另設(shè)空白組（不含細(xì)胞和藥物，只加培養(yǎng)液、MTT、DMSO）和正常對照組（不含藥物，只加培養(yǎng)液、MTT、DMSO），每組設(shè)3個重復(fù)孔。藥物作用結(jié)束后，棄上清液，換以無血清DMEM培養(yǎng)基配制的MTT（0.5 mg/mL）溶液，繼續(xù)在恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄上清液，然后按150μL/孔加入DMSO裂解細(xì)胞，振蕩10 min，于490 nm波長處測定吸光度（OD）值，重復(fù)測定3次，計算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=1－[（OD實驗組－OD空白組）/（OD正常對照組－OD空白組）]×100%。

1.4 細(xì)胞分組及體外肝纖維化模型的建立 取處于對數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液配制成4×104個/mL的細(xì)胞懸液，按100μL/孔加入96孔培養(yǎng)板中，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分為5組，分別為正常對照組、模型組及PPGA高、中、低劑量組。除正常對照組（給予完全培養(yǎng)基）外，其他各組均用IL-1β刺激HSC-T6細(xì)胞30 min，建立HSC-T6細(xì)胞體外肝纖維化模型。PPGA干預(yù)24 h或48 h后，采用MTT法檢測PPGA對IL-1β刺激的HSC-T6細(xì)胞增殖的影響。

1.5 免疫熒光法檢測細(xì)胞Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表達 分組處理后，棄上清液，PBS洗滌3次，甲醛固定30 min；PBS洗滌3次，0.5%Triton X-100通透20 min；PBS洗滌3次，山羊血清封閉30 min后吸去多余血清，Col-Ⅰ和Col-Ⅲ一抗4℃孵育過夜；次日，PBS洗滌3次，熒光二抗避光孵育1 h，PBS清洗，用DAPI染細(xì)胞核5 min，封片。熒光顯微鏡下觀察并拍照，用Image J軟件進行熒光定量并計算平均熒光強度。綠色熒光強度越高，表示目的蛋白表達量越高。

1.6 PI染色檢測細(xì)胞周期 收集細(xì)胞，PBS洗滌后加入0.3 mL PBS重懸細(xì)胞，加入1.2 mL無水乙醇，置于-20℃冰箱中1 h；離心，PBS洗滌細(xì)胞，加入100μL RNase A并充分懸浮細(xì)胞；37℃水浴30 min，加入400μLPI溶液，充分混勻，冰上避光孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.7 AO/EB熒光染色實驗 按照AO/EB雙熒光試劑盒說明書步驟處理細(xì)胞。以波長488 nm的紫外光激發(fā)，熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞凋亡形態(tài)。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 收集細(xì)胞，按照Annexin V-FITC/7-ADD熒光雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書步驟，加入500μL Annexin V Binding Buffer工作液重懸細(xì)胞，細(xì)胞懸液中加入5μL Annexin V-FITC和5μL 7-AAD染色液，混勻，避光孵育20 min，流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞凋亡情況。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PPGA對HSC-T6細(xì)胞活力的影響 與正常對照組比較，不同濃度PPGA作用HSC-T6細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，細(xì)胞增殖活力均降低（P＜0.05），見圖1。PPGA作用于HSC-T6細(xì)胞24 h、48 h、72 h的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為473 mg/L、100 mg/L、15 mg/L。因此，本研究選擇200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L分別作為PPGA高、中、低劑量進行后續(xù)實驗。24 h和48 h后，與模型組比較，PPGA高、中劑量組細(xì)胞增殖能力降低（P＜0.05），見圖2。本研究選擇24 h作為PPGA作用時間進行后續(xù)實驗。

圖1 PPGA對HSC-T6細(xì)胞增殖的影響

圖2 PPGA對IL-1β激活的HSC-T6細(xì)胞增殖活力的影響

2.2 PPGA對HSC-T6細(xì)胞Col-Ⅰ和Col-Ⅲ表達的影響 與正常對照組比較，模型組Col-Ⅰ和Col-Ⅲ平均熒光強度升高（P＜0.05）；與模型組比較，PPGA各劑量組Col-Ⅰ平均熒光強度降低，PPGA高、中劑量組Col-Ⅲ平均熒光強度降低（均P＜0.05），見圖3、圖4。

圖3 細(xì)胞免疫熒光圖（×400）

圖4 各組HSC-T6細(xì)胞Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表達比較

2.3 PPGA對HSC-T6細(xì)胞周期的影響 與正常對照組比較，模型組HSC-T6細(xì)胞G0/G1期、S期和G2/M期分布比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，PPGA高、中和低劑量組G0/G1期、G2/M期縮短，S期延長（均P＜0.05），見圖5。

圖5 PPGA對IL-1β刺激的HSC-T6細(xì)胞周期的影響

2.4 PPGA對HSC-T6細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響 與正常對照組比較，模型組HSC-T6細(xì)胞凋亡形態(tài)無明顯改變，細(xì)胞呈長梭形并發(fā)出綠色熒光；與模型組比較，PPGA高、中、低劑量均能促進HSC-T6細(xì)胞凋亡，部分細(xì)胞呈圓珠狀并發(fā)出橘紅色熒光，見圖6。

圖6 PPGA對HSC-T6細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響（×100）

2.5 PPGA對HSC-T6細(xì)胞凋亡率的影響 模型組與正常對照組細(xì)胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，PPGA高、中和低劑量組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05），見圖7。

圖7 PPGA對IL-1β刺激的HSC-T6細(xì)胞凋亡率的影響

3 討論

肝纖維化及其終末期疾病肝硬化是由多種慢性肝病引起的主要健康問題。在正常生理狀態(tài)下，HSC-T6細(xì)胞處于靜息狀態(tài)；當(dāng)HSC-T6細(xì)胞活化后，細(xì)胞增殖增加，呈現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞樣，以Col-Ⅰ和Col-Ⅲ為主要成分的ECM過度沉積[10]。因此，抑制HSC增殖、減少細(xì)胞膠原生成和促進膠原降解是抗纖維化治療的重要策略。研究證明，IL-1β可作為HSC-T6細(xì)胞的誘導(dǎo)活化劑[11-12]。本實驗采用IL-1β刺激HSC-T6細(xì)胞30 min后，細(xì)胞增殖能力顯著增強，同時Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表達增加；PPGA作用后抑制了HSC-T6細(xì)胞增殖，減少Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表達。提示PPGA可抑制HSC-T6增殖、活化，減少ECM過度積累，維持ECM的動態(tài)平衡，從而起到抗肝纖維化的作用。

細(xì)胞凋亡在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和清除多余或異常細(xì)胞中起著重要的作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)，促進細(xì)胞凋亡是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的關(guān)鍵[14]。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是抑制HSC活化和清除已活化的HSC細(xì)胞的重要途經(jīng)之一[15]。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，會呈現(xiàn)出細(xì)胞皺縮、細(xì)胞核固縮、細(xì)胞骨架解體等特征性形態(tài)學(xué)變化，其中細(xì)胞皺縮是最直觀的變化，細(xì)胞核固縮是最顯著的變化[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β沒有明顯改變HSCT6細(xì)胞形態(tài)；但經(jīng)PPGA干預(yù)后，部分細(xì)胞出現(xiàn)固縮或呈圓珠狀，發(fā)出橘紅色熒光，且隨PPGA濃度增大，呈橘紅色熒光的細(xì)胞也隨之增多，提示PPGA可顯著誘導(dǎo)HSC細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著改變，促使細(xì)胞凋亡。細(xì)胞受到外部刺激后，多種促凋亡蛋白釋放，促凋亡蛋白、凋亡蛋白激活因子等在細(xì)胞質(zhì)中結(jié)合形成凋亡小體，凋亡小體可進一步誘導(dǎo)活化，促進細(xì)胞凋亡[13,15,17-18]。本研究中，與正常對照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率沒有明顯變化，而PPGA干預(yù)導(dǎo)致HSC-T6細(xì)胞凋亡率升高。細(xì)胞周期分為G0/G1期、S期和G2/M期，S期是DNA復(fù)制期，同時也是細(xì)胞周期的關(guān)鍵期[19-20]。本實驗中，IL-Iβ刺激對HSCT6細(xì)胞周期分布的影響不大，但經(jīng)PPGA處理后，HSC細(xì)胞周期停滯在S期，HSC細(xì)胞不能正常進入分裂期，不能完成完整的細(xì)胞周期，這可能導(dǎo)致HSC-T6細(xì)胞生長延遲。以上結(jié)果表明，PPGA能誘導(dǎo)HSC凋亡，并將細(xì)胞周期阻滯在S期，這可能與其抗肝纖維化作用有關(guān)。

綜上所述，PPGA能明顯抑制IL-1β刺激的HSC-T6細(xì)胞增殖與活化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，影響細(xì)胞周期，并減少細(xì)胞內(nèi)膠原蛋白表達，減輕肝纖維化。本研究為PPGA及棒柄花在肝纖維化的臨床應(yīng)用提供了實驗基礎(chǔ)。