蒙灣灣，趙偉東，李麗清，王瑜丹，梁世雄

（1.廣西醫(yī)科大學，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院放療科，南寧 530021）

放射性肺損傷（radiation-induced lung injury，RILI）是臨床上最常見的胸部腫瘤放射治療的并發(fā)癥之一，總體發(fā)生率約為20%～36%[1]，有研究顯示，RILI發(fā)病率最高的是肺癌（5%～25%），其次是縱隔淋巴瘤（5%～10%）和乳腺癌（1%～5%）[2]。RILI限制了放射治療的劑量并影響患者的治療效果和預后，是發(fā)生非原發(fā)病因死亡的主要原因之一。細胞因子學說是RILI發(fā)病機制的研究熱點，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是RILI發(fā)生、發(fā)展過程中非常重要的細胞因子，在RILI生成的活性氧自由基（reactiveoxygen species，ROS）刺激下，TGF-β、TNF-α大量產(chǎn)生[3-4]。同時，在照射過程中ROS本身也是RILI產(chǎn)生的重要原因[5]。這使抗氧化成為防治放射性肺損傷的重要研究方向。

雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）是青蒿素的衍生物，是高效、速效、低毒的抗瘧藥[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)，DHA能通過作用于TLR4/NF-κB通路，抑制NF-κB的激活，調(diào)控TGF-β、TNF-α等多種炎癥因子的表達從而實現(xiàn)抗炎效果[8]。為此，本研究通過復制小鼠RILI模型，觀察DHA對肺組織TNF-α、TGF-β、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及ROS表達的影響，以探討DHA對RILI的干預作用，為RILI的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑及儀器

健康SPF級C57BL/6小鼠54只，雄性，6～8周齡，體重20～25 g，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心（許可證號：SCXK桂2020-0003），采用標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水和飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗。DHA購自Selleck公司，批號為S 229009；常規(guī)蘇木精—伊紅（HE）染色、免疫組化及TGF-β、TNF-α檢測所需試劑盒購自武漢塞維爾生物，貨號分別為：G1003、GB13028及GB11188；SOD檢測試劑盒均購自南京建成生物，貨號為A001；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）及TGF-β、TNF-α檢測所需試劑盒購自江蘇酶免。Precise1120直線加速器購自瑞典醫(yī)科達公司，酶標儀購自BIO-RAD公司。

1.2 動物分組與造模

將54只健康C57BL/6小鼠隨機分為空白組、DHA組、單純照射模型（IR）組，每組18只。對IR組小鼠進行RILI造模，小鼠RILI的造模于廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院的放療中心進行，照射方法為單次全肺20 Gy劑量照射，此為課題組前期實驗已證實可以造模成功的方法[9]：使用1%戊巴比妥鈉（劑量為45 mg/kg）將小鼠麻醉，注射方式為腹腔注射，擺位后進行CT模擬定位，勾畫照射野為全肺，照射面積約為1 cm×12 cm，每次照射6只小鼠，并排放置在照射臺上，間隔為2 cm，用直線加速器進行單次雙肺照射，照射劑量20 Gy，放射參數(shù)6 MV光子，皮源距100 cm，照射野30 cm×0.6 cm?？瞻捉M麻醉后佯裝照射。照射結(jié)束后將小鼠送回動物實驗中心飼養(yǎng)，并分別于照射后7 d、14 d處死小鼠。

1.3 給藥方式與劑量

DHA溶于羧甲基纖維素鈉（CMCNA）溶液中，各組均于照射前1 d開始給藥，每日1次灌胃給藥，連續(xù)7 d，DHA組按照前期預實驗結(jié)果確定的25 mg/kg·d-1的劑量給藥；空白組和IR組給予等量生理鹽水。

1.4 小鼠肺標本的收集及處理

分別于照射后7 d、14 d兩個時間點，每組各隨機取9只小鼠，頸椎脫臼法處死小鼠后，打開胸腔，取出雙側(cè)新鮮肺組織，將左、右兩側(cè)肺均分為2份，左肺置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于觀察病理改變，取右肺置于凍存管中，放入-80℃冰箱中保存待檢測。

1.5 方法

1.5.1 HE染色觀察肺組織病理改變 取處理好的左側(cè)小鼠肺組織標本，石蠟包埋，5μm連續(xù)切片，HE染色，光鏡下觀察肺組織炎性病理變化，并采用Szapiel半定量法[10]對其進行評分，1分：無肺泡炎表現(xiàn)；2分：輕度肺泡炎表現(xiàn)，即受累面積＜20%肺葉；3分：中度肺泡炎，即受累面積為20%～50%肺葉；4分：重度肺泡炎，即受累面積＞50%肺葉。

1.5.2 免疫組化染色觀察TNF-α和TGF-β表達 取處理好的左側(cè)小鼠肺組織標本，石蠟包埋，5μm連續(xù)切片，根據(jù)試劑盒說明書步驟，采用免疫組化法對肺組織中TNF-α和TGF-β蛋白相對表達量進行檢測，免疫組化染色評分（IRS）＝染色強度（SI）×陽性細胞百分比（PP）[11]。SI不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。PP評分為：視野中未見陽性細胞為0分，陽性細胞占總細胞數(shù)＜10%為1分，11%～50%為2分，51%～80%為3分，＞80%為4分。

1.5.3 冰凍切片DHE染色觀察ROS陽性細胞 取處理好的左側(cè)小鼠肺組織標本，在自制的錫箔紙小杯中以O(shè)CT包埋，液氮速凍15 s后存于-80℃冰箱，行厚度為8μm的冰凍切片。每張切片滴加50μL的10μmol/L DHE工作液，37℃孵育30 min。PBS沖洗后，滴加抗熒光猝滅劑封片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5.4 電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu) 將肺組織制成約1 mm×1 mm×1 mm的組織小塊，經(jīng)電鏡固定液迅速固定30 min，使用醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染色法染色，應(yīng)用透射電鏡觀察肺組織細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.5.5 ELISA檢測TNF-α和TGF-β的濃度 取各組小鼠相同部位肺組織，制作肺勻漿，3 000 r/min離心15 min，取其上清液用于檢測，實驗過程嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.5.6 BCA法檢測總蛋白含量 制作各組小鼠肺勻漿，取其上清液用于檢測，其余按試劑盒說明書操作。

1.5.7 羥胺法檢測肺組織SOD含量 制作各組小鼠肺勻漿，取其上清液用于檢測，按SOD試劑盒說明書，采用多功能酶標儀檢測肺組織SOD活性（波長550 nm）。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織HE染色及肺組織總蛋白含量比較

小鼠肺組織HE染色結(jié)果顯示：空白組小鼠肺組織肺泡壁薄、結(jié)構(gòu)清晰。照射7 d和14 d后，IR組與DHA組小鼠均出現(xiàn)不同程度局灶性肺泡壁水腫、肺泡間隔增厚（圖1白色箭頭所示），巨噬細胞、中性粒細胞浸潤、局部肺泡內(nèi)充血（圖1黑色箭頭所示），其中IR組肺組織炎癥明顯加重，而DHA組則反應(yīng)較輕；照射7 d和14 d后各組小鼠肺組織病理評分結(jié)果中，IR組評分較空白組升高，DHA組較IR組降低（均P＜0.05）；肺勻漿BCA法總蛋白含量檢測結(jié)果顯示，照射后7 d，各組小鼠肺組織總蛋白含量比較，未呈現(xiàn)明顯差異（P＞0.05）；照射后14 d，IR組總蛋白含量較空白組升高，DHA組較IR組降低（均P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠肺組織病理評分及總蛋白含量比較 ，n＝9

表1 各組小鼠肺組織病理評分及總蛋白含量比較 ，n＝9

與空白組比較，a P＜0.05；與IR組比較，b P＜0.05。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色圖（×200）

2.2 各組小鼠肺組織TNF-α和TGF-β蛋白表達比較

免疫組化染色結(jié)果顯示：空白組和DHA組小鼠肺組織支氣管上皮中可見TNF-α和TGF-β呈散在表達，在肺實質(zhì)中有少量炎癥細胞及肺泡上皮細胞呈弱陽性（淡黃色）表達；照射后7 d和14 d，IR組肺組織TNF-α和TGF-β表達均增加，主要在支氣管上皮中表達，呈片狀、強陽性（棕褐色）表達，見圖2、圖3（TNF-α和TGF-β陽性表達如白色箭頭所示）。

圖2 各組小鼠肺組織病理TGF-β免疫組化染色結(jié)果比較（×400）

圖3 各組小鼠肺組織病理TNF-α免疫組化染色結(jié)果比較（×400）

照射后7 d、14 d，與空白組比較，IR組肺組織TGF-β和TNF-α的IRS評分升高（P＜0.05），與IR組比較，DHA組肺組織TGF-β和TNF-α的IRS評分降低（P＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠肺組織TGF-β和TNF-α的IRS評分比較 ，n＝9

表2 各組小鼠肺組織TGF-β和TNF-α的IRS評分比較 ，n＝9

與空白組比較，a P＜0.05；與IR組比較，b P＜0.05。

2.3 各組小鼠肺組織TGF-β、TNF-α含量及SOD活性比較

照射后7 d、14 d，與空白組比較，IR組肺組織中TGF-β和TNF-α含量均明顯增高（P＜0.05），與IR組比較，DHA組肺組織中TGF-β和TNF-α含量明顯降低（P＜0.05）；照射后7 d，各組SOD活性比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；照射后14 d，與空白組比較，IR組SOD活性降低（P＜0.05），DHA組SOD活性高于IR組（P＜0.05），見表3。

表3 各組小鼠肺組織TGF-β、TNF-α含量及SOD活性比較 ，n＝9

表3 各組小鼠肺組織TGF-β、TNF-α含量及SOD活性比較 ，n＝9

與空白組比較，a P＜0.05；與IR組比較，b P＜0.05。

2.4 各組小鼠肺組織細胞線粒體形態(tài)比較

照射后14 d，各組小鼠肺組織細胞線粒體形態(tài)學透射電鏡下觀察顯示：空白組小鼠肺組織細胞線粒體結(jié)構(gòu)基本正常；與空白組比較，IR組小鼠肺細胞超微結(jié)構(gòu)明顯受損，線粒體明顯腫脹、嵴數(shù)量明顯減少或消失，嗜鋨性板層小體的板層結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯融合或消失；與IR組比較，DHA組小鼠肺組織細胞超微結(jié)構(gòu)損傷程度有所減輕，見圖4（線粒體結(jié)構(gòu)改變見圖中白色箭頭所示）。

圖4 各組小鼠肺組織細胞線粒體形態(tài)

2.5 各組小鼠肺組織ROS水平比較

照射后14 d，各組肺組織冰凍切片DHE-ROS染色結(jié)果顯示：肺組織細胞中ROS呈現(xiàn)紅染，IR組小鼠肺組織切片中ROS陽性表達細胞較空白組增多；與IR組相比，DHA組小鼠肺組織切片中ROS陽性表達細胞減少，見圖5。

圖5 各組小鼠肺組織DHE-ROS染色圖（×400）

3 討論

RILI是一種由機體免疫系統(tǒng)介導的局部放射反應(yīng)，其病理過程并不是單一靶細胞損傷的結(jié)果，而是具有多種細胞因子調(diào)控和多種細胞參與的復雜過程。有研究顯示，TGF-β、TNF-α能趨化巨噬細胞和相關(guān)炎癥細胞，誘導其合成IL-1、IL-6等細胞因子逐層放大“炎癥瀑布”效應(yīng)，進一步加劇肺部炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激[12-13]。有研究顯示，青蒿素可明顯抑制CpG DNA誘導的TNF-α和TGF-β釋放，并且青蒿素可顯著減少膿毒癥大鼠炎癥介質(zhì)TNF-α和TGF-β的釋放[14]。同時，DHA能夠明顯改善RILI小鼠肺組織的炎性滲出，抑制膠原纖維的產(chǎn)生，對RILI有保護作用[15]。本實驗對TGF-β和TNF-α兩種細胞炎性因子進行測定，進一步研究DHA對小鼠RILI的干預作用。組織病理學實驗結(jié)果顯示，IR組小鼠肺泡炎評分和免疫組化評分明顯升高，肺組織TNF-α和TGF-β含量明顯增加，DHA組小鼠肺泡炎評分和免疫組化評分降低，肺組織TNF-α和TGF-β含量有所減少，同時，ELISA實驗結(jié)果同樣呈現(xiàn)以上趨勢，揭示DHA可以抑制小鼠肺部TGF-β和TNF-α的表達，DHA可能通過減少細胞炎性因子來減輕RILI。

近年來大量研究表明，氧化應(yīng)激也是造成RILI的重要機制之一[16]。較高劑量射線進入肺組織時，將通過與機體水分子發(fā)生離子化反應(yīng)產(chǎn)生大量ROS，ROS可對DNA、蛋白質(zhì)及脂膜造成破壞，從而誘導氧化應(yīng)激,上調(diào)TGF-β，并能使線粒體等細胞器功能損壞[7,17]，進一步引發(fā)RILI進展。SOD是機體最主要的自由基清除劑，其可通過催化超氧陰離子和過氧化氫發(fā)生歧化反應(yīng)而減少活性氧含量[18-19]。本實驗中，IR組小鼠肺組織照射后14 d SOD活性降低，肺細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷明顯，肺組織ROS陽性細胞表達增加，而DHA組小鼠肺組織SOD活性明顯升高，肺細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷減輕，肺組織ROS陽性細胞表達減少。提示DHA可保護肺組織中SOD活性，減輕線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷，減少肺組織ROS的產(chǎn)生，緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)，且其作用于該模型的時間為用藥后7 d。

本文初步探討了DHA對放療誘導的肺損傷的作用及其機制，旨在為臨床治療RILI提供新的可能，DHA有望成為臨床治療RILI的候選藥物，但DHA對RILI的保護作用機制還有待進一步研究。