劉 扣，高 翔，陳可洋，蔣正軒

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥之一。長(zhǎng)期高血糖會(huì)引起視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的病理和功能改變，嚴(yán)重危害勞動(dòng)年齡人的視力[1]。其中，糖尿病黃斑水腫(diabetic macular edema, DME)的發(fā)生率隨著DR的進(jìn)展逐漸增加，Ⅳ期時(shí)可達(dá)70%[2]。DME的發(fā)生與糖尿病視網(wǎng)膜血管的通透性異常增高息息相關(guān)。研究[3]表明，辣椒辣素可以有效抑制血管通透性增加以及新生血管。張廷 等[4]提出辣椒辣素能通過(guò)增強(qiáng)視網(wǎng)膜內(nèi)源性降鈣素基因相關(guān)肽的表達(dá)，在一定程度上抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡。但辣椒辣素抑制血管通透性增高的特性是否能在視網(wǎng)膜中發(fā)揮作用尚不清楚。

該研究采用辣椒辣素干預(yù)DR模型大鼠，采集大鼠血清相關(guān)因子、視網(wǎng)膜血管造影、免疫熒光等數(shù)據(jù)，并檢測(cè)視網(wǎng)膜中辣椒辣素受體蛋白(transient receptor potential vanillic 1, TRPV1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、閉鎖蛋白(occludin)濃度進(jìn)一步探討其作用的潛在機(jī)制，為明確辣椒辣素的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器辣椒辣素(上海Aladdin公司)；血糖儀、血糖試紙(美國(guó)羅氏公司)；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(美國(guó)Sigma公司)；兔Anti-TRPV1抗體(英國(guó)abcam公司)、兔Anti-VEGF抗體(成都正能生物有限公司)、兔Anti-occludin(美國(guó)Novus公司)；伊文思藍(lán)染料(北京索萊寶生物科技有限公司)；凝膠掃描成像系統(tǒng)Fine-do X6顯影儀(上海天能科技有限公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；總膽固醇(total cholesterol, TC)、三酰甘油(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)檢測(cè)試劑盒(南京建城生物工程研究所)；其余常見試劑和耗材均來(lái)自安徽醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫學(xué)系教研室。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模及干預(yù)選取8周齡雄性SD大鼠[5]24只，體質(zhì)量均為200 g左右(購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，動(dòng)物飼養(yǎng)間環(huán)境為12 h/12 h的晝夜節(jié)律，相對(duì)溫度為(23 ± 2) ℃，相對(duì)濕度為(50 ± 5)%。隨機(jī)選取6只大鼠作為正常對(duì)照組(NC組)，實(shí)驗(yàn)期間給予普通飼料喂養(yǎng)；其余18只大鼠作為糖尿病組先給予HFD喂養(yǎng)4周后，給予禁食16 h處理。將禁食后大鼠按 35 mg/kg的劑量腹腔注射配置好的STZ溶液(STZ粉劑溶于1%的枸櫞酸溶液配成濃度為0.1 mol/L緩沖液)。注射72 h后測(cè)空腹血糖值≥11.1 mmol/L的大鼠確定為糖尿病模型。糖尿病模型大鼠隨機(jī)分為糖尿病對(duì)照組(DM)6只、糖尿病3 mg/kg辣椒辣素處理組(CAP3)6只、糖尿病6 mg/kg辣椒辣素處理組(CAP6)6只。DM組大鼠和CAP3、CAP6組大鼠分別采用DMSO和2種濃度辣椒辣素灌胃干預(yù)。每周1次檢測(cè)大鼠體質(zhì)量、空腹血糖(禁食8 h)。大鼠飼養(yǎng)籠每天更換2次墊料，保證環(huán)境干燥。整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期共8周。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物干預(yù)后取材辣椒辣素灌胃處理8周后取材。實(shí)驗(yàn)大鼠安樂(lè)死，留取腹主動(dòng)脈血，生理鹽水反復(fù)灌洗臟器清除殘余全血后摘取雙眼眼球，-80 ℃或經(jīng)組織固定液4 ℃固定保存。大鼠眼球摘取后立刻使用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗干凈，在解剖顯微鏡下經(jīng)角鞏膜緣間平行于赤道方向剪開，仔細(xì)去除眼前節(jié)和玻璃體，冰上鈍性分離視網(wǎng)膜，儲(chǔ)存在1.5 ml EP管中，液氮速凍10 min，于-80 ℃保存。該研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，按照安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)范進(jìn)行。

1.4 血清TC、TG、HDL、LDL濃度檢測(cè)收集的全血靜置分層后，經(jīng)3 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上層血清-20 ℃保存。按TC、TG、HDL、LDL生化檢測(cè)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)濃度。

1.5 視網(wǎng)膜伊文思藍(lán)造影固定深度麻醉的大鼠，經(jīng)頸內(nèi)靜脈緩慢注射0.5 ml 加熱至37 ℃的伊文思藍(lán)溶液，見大鼠通體逐漸變?yōu)樗{(lán)色。循環(huán)20 min后將大鼠安樂(lè)死，摘取眼球立刻置于PBS中清洗，避光條件下分離視網(wǎng)膜，并展開在載玻片上，晾干、封片。暗室中，倒置熒光顯微鏡下采圖。

1.6 視網(wǎng)膜免疫熒光將4%多聚甲醛固定的眼球清洗、脫水、石蠟包埋等處理后，按5 μm厚度切片并固定于載玻片上。通過(guò)脫蠟復(fù)水、抗原修復(fù)、BSA封閉、熒光抗體孵育、甘油封片等制成免疫熒光切片，置于熒光顯微鏡下立即觀察、采圖。

1.7 視網(wǎng)膜TRPV1、VEGF、occludin蛋白水平檢測(cè)稱取30 mg大鼠視網(wǎng)膜組織，經(jīng)充分裂解勻漿后離心取上清液，BCA法蛋白定量，變性后于-20 ℃保存。經(jīng)凝膠電泳分離目的蛋白，恒流轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉，一抗(Anti-TRPV1、Anti-VEGF、Anti-occludin)4 ℃孵育12～16 h，二抗室溫孵育30～60 min。將承載目的蛋白的纖維素膜均勻滴加顯影液，置于顯影儀中拍攝保存。顯影結(jié)果進(jìn)行灰度掃描，統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 辣椒辣素對(duì)大鼠體質(zhì)量和血糖的影響與NC組相比，DM組大鼠在實(shí)驗(yàn)第 1 周開始體質(zhì)量降低。與DM組大鼠相比，CAP3、CAP6大鼠體質(zhì)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.83，P<0.01)。CAP3與CAP6處理組間體質(zhì)量有數(shù)值差距，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1A)。與NC組相比，3組糖尿病大鼠血糖升高(F=123.8,P<0.01)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期，DM、CAP3、CAP6組間血糖值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1B)。

圖1 大鼠體質(zhì)量及空腹血糖值

2.2 辣椒辣素對(duì)血管通透性的影響DM組大鼠視網(wǎng)膜血管通透性較NC組大鼠升高、滲漏明顯，辣椒辣素對(duì)視網(wǎng)膜血管通透性有改善作用。伊文思藍(lán)眼底造影顯示(標(biāo)尺：50 μm)，NC組大鼠的視網(wǎng)膜血管走形規(guī)則、清晰，無(wú)明顯的血管滲漏，見圖2A；DM組大鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)模糊不清，有多處明顯強(qiáng)熒光區(qū)域，提示血管滲漏顯著(白色箭頭)，見圖2B；CAP3組大鼠視網(wǎng)膜血管可見微小血管形態(tài)迂曲，主要血管有較明顯的強(qiáng)熒光，但較DM組熒光強(qiáng)度降低，提示血管滲漏減輕，見圖2C。CAP6組大鼠視網(wǎng)膜血管走形接近NC組，血管熒光強(qiáng)度較DM組降低，但與CAP3組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2D。

圖2 視網(wǎng)膜組織伊文思藍(lán)血管造影 ×100

2.3 辣椒辣素對(duì)糖尿病大鼠血脂的影響分別檢測(cè)4組大鼠血清中TC、TG、LDL、HDL濃度。與NC組相比，DM組TC濃度升高，CAP3、CAP6處理組漸次降低該數(shù)值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。且CAP6組TC濃度接近NC組正常值。檢測(cè)大鼠血清中TG濃度，與NC組相比，DM組TG濃度升高，CAP3、CAP6處理組均顯示TG濃度降低至正常值，兩處理組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。糖尿病大鼠LDL導(dǎo)致視網(wǎng)膜脂質(zhì)沉積。與DM組相比，可見CAP3組LDL濃度降低，CAP6組LDL濃度低于NC組，但并非提示不良反應(yīng)。與NC組相比，其余3組均表現(xiàn)HDL下降，CAP處理組未顯示改善作用(表1)。

表1 血清TC、TG、LDL、HDL含量

2.4 辣椒辣素對(duì)視網(wǎng)膜TRPV1、VEGF、occludin的影響大鼠視網(wǎng)膜組織免疫熒光(標(biāo)尺：50 μm)顯示，與未接受辣椒辣素處理組(NC、DM)相比，CAP3、CAP6處理組TRPV1具有較高熒光強(qiáng)度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3A)；檢測(cè)視網(wǎng)膜蛋白提示，CAP3、CAP6組大鼠視網(wǎng)膜TRPV1含量較NC、DM組升高(圖3B)，結(jié)果表明辣椒辣素可促進(jìn)視網(wǎng)膜中TRPV1的表達(dá)。此外經(jīng)辣椒辣素干預(yù)后，與DM組相比，CAP3、CAP6處理組視網(wǎng)膜VEGF蛋白濃度降低，occludin蛋白濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中，CAP6處理組較CAP3處理組視網(wǎng)膜VEGF更接近NC組(圖3C、D)。由此可見，辣椒辣素在視網(wǎng)膜組織中參與調(diào)節(jié)血管通透性關(guān)聯(lián)蛋白VEGF與occludin的表達(dá)。

圖3 視網(wǎng)膜TRPV1受體分布、occludin、VEGF蛋白水平

3 討論

DR隨著糖尿病發(fā)生率的升高已經(jīng)成為嚴(yán)重的眼科常見病。高血糖可導(dǎo)致組織缺血低氧、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，造成視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞損傷、細(xì)胞間連接蛋白減少，最終引起DR[6]。血-視網(wǎng)膜屏障(blood-retinal barrier, BRB)的破壞是DR的特征性病理改變，可引起血管滲透性增加和新生血管形成。

辣椒辣素是TRPV1(又稱瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1)的激動(dòng)劑，是存在于辣椒果實(shí)中的香草酰胺類生物堿。研究[7]表明，辣椒辣素能促進(jìn)膽固醇在肝臟中分解代謝，改善高脂血癥大鼠血清脂質(zhì)含量，降低TC、TG、LDL濃度，甚至能有效降低高脂血癥大鼠體質(zhì)量。此外，辣椒辣素能夠顯著抑制外源性VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞血管滲漏、血管形成[3]，其機(jī)制可能是辣椒辣素通過(guò)抑制血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)的酸磷酸化來(lái)抑制VEGF誘導(dǎo)的血管通透性增高。該實(shí)驗(yàn)中，辣椒辣素處理組體質(zhì)量較DM組增加，提示辣椒辣素可能緩解糖尿病特征性體質(zhì)量下降的癥狀。兩種濃度的辣椒辣素均降低糖尿病大鼠血清TC、TG、LDL濃度，但對(duì)HDL含量無(wú)改善效果，說(shuō)明辣椒辣素能促進(jìn)脂質(zhì)分子在體內(nèi)的代謝，但不具備協(xié)助HDL將脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入肝臟的能力。

視網(wǎng)膜血管通透性改變是DME的重要病理特征，而BRB的完整性是保證視網(wǎng)膜血管通透性功能正常的必要條件。視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞是在血液循環(huán)和神經(jīng)視網(wǎng)膜間發(fā)揮屏障作用的單層細(xì)胞[8]，其細(xì)胞間的3種連接結(jié)構(gòu)是保證該作用的核心支柱，包括緊密連接(tight junctions, Tjs)、黏附連接(adherens junctions, AJs)及縫隙連接(gap junctions, GJs)，三者共同維持視網(wǎng)膜血管功能穩(wěn)定[9]。其中，TJs是BRB最重要的連接結(jié)構(gòu)，其完整性是決定BRB功能是否正常的關(guān)鍵因素。occludin是一種跨膜蛋白，是Tjs的重要組成部分，參與維持上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞間結(jié)構(gòu)的完整性。occludin受多途徑調(diào)控，其中促炎因子VEGF會(huì)抑制其表達(dá)[10-11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DM組大鼠視網(wǎng)膜VEGF較NC組表達(dá)增高，occludin表達(dá)下降。經(jīng)辣椒辣素處理的CAP3、CAP6組糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織VEGF、occludin表達(dá)趨勢(shì)與DM組相反。該結(jié)果提示，DM組大鼠視網(wǎng)膜中過(guò)表達(dá)VEGF可能抑制了occludin的正常生成，導(dǎo)致TJs構(gòu)成組分不全，進(jìn)而導(dǎo)致BRB屏障功能受損，血管通透性異常改變。辣椒辣素處理后，大鼠視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)下降，occludin受抑制減少，表達(dá)恢復(fù)。該結(jié)果與病理數(shù)據(jù)也相符合。免疫熒光提示，TRPV1受體在視網(wǎng)膜中廣泛分布，且辣椒辣素處理后TRPV1受體較未處理組激活增多。造影結(jié)果顯示，與NC組相比，DM組大鼠視網(wǎng)膜血管有強(qiáng)而多的熒光滲漏區(qū)域，表明視網(wǎng)膜血管壁受損，通透性異常增高，造影劑隨損傷的血管壁滲漏進(jìn)入視網(wǎng)膜組織內(nèi)。CAP3、CAP6處理組較DM組大鼠視網(wǎng)膜血管可見改善，眼底血管未見明顯強(qiáng)熒光區(qū)，血管走形較為清晰，提示辣椒辣素緩解了糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管滲漏的情況，具有改善視網(wǎng)膜血管通透性的作用。該研究表明，辣椒辣素能激活糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中的TRPV1受體, 上調(diào)因VEGF過(guò)表達(dá)而受到抑制的occludin，保護(hù)TJs構(gòu)成組分、維持BRB正常功能。