強(qiáng)婷婷，張 麗，胡憲文

七氟烷是兒科手術(shù)中使用最廣泛的全身麻醉藥之一，然而Ing et al[1]研究表明，七氟烷長(zhǎng)時(shí)間麻醉可造成發(fā)育期兒童長(zhǎng)期的語(yǔ)言功能缺陷和認(rèn)知障礙；Zhu et al[2]研究表明，早期七氟烷暴露可導(dǎo)致發(fā)育期大鼠廣泛的海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而造成遠(yuǎn)期空間學(xué)習(xí)障礙。但是七氟烷暴露引起神經(jīng)損傷和認(rèn)知障礙的具體機(jī)制仍不清楚。

研究[3]表明，吸入麻醉藥暴露導(dǎo)致的突觸發(fā)育障礙與線粒體損傷相關(guān)。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)是線粒體膜上的一個(gè)非選擇性通道，親環(huán)素D(cyclophilin D，CypD)是MPTP的陽(yáng)性調(diào)節(jié)因子，而環(huán)孢素A(cyclosporin A，CsA)是MPTP的特異性抑制劑[4]。在阿爾茨海默病動(dòng)物模型中，CypD的表達(dá)增加，MPTP開(kāi)放增多，而CsA能夠下調(diào)CypD的表達(dá)，抑制MPTP開(kāi)放，維持線粒體功能穩(wěn)定進(jìn)而改善老年小鼠的認(rèn)知功能[5]。然而，CypD介導(dǎo)的MPTP開(kāi)放在七氟烷暴露導(dǎo)致發(fā)育期大腦神經(jīng)毒性中的作用尚不清楚。該研究利用原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元建立七氟烷損傷模型，重點(diǎn)研究MPTP及其調(diào)節(jié)蛋白CypD在七氟烷暴露引起神經(jīng)毒性中的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 孕(18±1)d SD大鼠由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(皖)2017-001。

1.1.2主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Glutamax)、青-鏈霉素、0.25%胰蛋白酶-EDTA、B-27、Neurobasal培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；5-氟-2′脫氧尿苷(FUDR)、多聚-L-賴氨酸(PLL)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自烏拉圭Lonsera公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、免疫印跡(Western blot)一抗稀釋液、CCK-8檢測(cè)試劑盒、TUNEL凋亡試劑盒、MPTP檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京碧云天生物技術(shù)公司；Triton X-100購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；β-actin抗體、突觸后致密蛋白95(postsynaptic density protein，PSD-95)抗體、突觸蛋白1(Snapsin-1)抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；CypD購(gòu)自上海Abcam公司；突觸素(Snaptophysin)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic facto，BDNF)購(gòu)自武漢Proteintech公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ECL顯影液購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.1.3主要儀器設(shè)備 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；倒置相差熒光顯微鏡(德國(guó)蔡司公司)；凝膠成像儀(德國(guó)耶拿公司)；便攜式細(xì)胞氧環(huán)境控制小室(加拿大Stem Cell公司)；氣體濃度監(jiān)測(cè)儀(深圳邁瑞生物公司)；七氟烷揮發(fā)罐(德國(guó)Drager公司)。

1.2 方法

1.2.1SD大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng) 取孕(18±1)d SD大鼠，七氟烷麻醉孕鼠，75%乙醇消毒孕鼠腹部，然后快速取出胚胎，將胎鼠斷頭取腦，放入裝有預(yù)冷的PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中，置于解剖顯微鏡下分離海馬組織。用0.25% 胰酶(37 ℃預(yù)熱)消化海馬組織10 min，然后用10% FBS終止消化，1 500 r/min，離心5 min后棄去上清液，再加入適量含10%FBS的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液，輕柔吹打1 min，重新懸浮細(xì)胞并使之變成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞接種密度調(diào)整為2×105～3×105個(gè)/ml，放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，全量換液為Neurobasal細(xì)胞維持液，并加入50 μmol/L FUDR。每隔3 d更換1次細(xì)胞培養(yǎng)液，換液1/2。將原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)至7 d時(shí)，建立七氟烷暴露模型。

1.2.2七氟烷暴露模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 原代培養(yǎng)的SD大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為：對(duì)照組(Con組)、環(huán)孢素A組(CsA組，0.1、0.5、1 μmol/L)、3%七氟烷組(Sevo組)、3%七氟烷+環(huán)孢素A處理組(Sevo+CsA組，0.1、0.5、1 μmol/L)。CsA組、Sevo+CsA組細(xì)胞在培養(yǎng)至6 d時(shí)加入相應(yīng)濃度的CsA預(yù)處理24 h。7 d時(shí)，Con組、CsA組放入充滿95% 空氣+5% CO2的控制小室中，然后置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱處理6 h；Sevo組、Sevo+CsA組放入充滿3%七氟烷的控制小室中處理6 h。處理結(jié)束后進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.2.3CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力 將細(xì)胞懸液調(diào)整濃度后種植于96孔板內(nèi)，每孔100 μl細(xì)胞懸液，約3×104個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。造模結(jié)束后棄去96孔板中的培養(yǎng)基，重新加入100 μl/孔預(yù)熱過(guò)的Neurobasal細(xì)胞維持液。每孔加入10 μl CCK-8溶液，放入37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h。酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值(OD值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.2.4TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 棄去培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，然后用PBS洗滌1次，再加入0.3% Triton X-100室溫通透細(xì)胞5 min，用PBS洗滌2次，加50 μl TUNEL檢測(cè)液，37 ℃避光孵育1 h，孵育結(jié)束后用PBS洗滌3次，滴加含DAPI的抗熒光淬滅封片液封片后置于熒光顯微鏡下觀察并拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，每次每組選取5個(gè)視野計(jì)算細(xì)胞凋亡比例。

1.2.5Western blot檢測(cè) 造模結(jié)束后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌1次，加入細(xì)胞裂解液后用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，接著置于4 ℃超速離心機(jī)下14 000 r/min離心15 min，留存上清液，按照BCA法測(cè)定蛋白濃度，再加入上樣緩沖液，煮沸10 min使蛋白充分變性。每個(gè)樣本取10 μg，配制10% SDS- PAGE分離膠，電泳分離蛋白，250 mA恒流轉(zhuǎn)膜，接著用5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗滌1次后分別加入配置好的不同的濃度的一抗稀釋液于4 ℃搖床上過(guò)夜孵育(β-actin 1 ∶10 000、BDNF 1 ∶1 000、PSD-95 1 ∶1 000、Snaptophysin 1 ∶20 000、Snapsin-1 1 ∶1 000、CypD 1 ∶5 000)。一抗孵育結(jié)束后用TBST洗滌3次，與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的相應(yīng)種屬的二抗(1 ∶1 000)在室溫下孵育1 h，TBST洗滌4次后采用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白表達(dá)量。

1.2.6線粒體膜電位檢測(cè) 線粒體JC-1染色，線粒體膜電位較高時(shí)形成聚合物(JC-1 aggregates)產(chǎn)生紅色熒光，線粒體膜電位較低時(shí)為JC-1單體(JC-1 monomers)產(chǎn)生綠色熒光。原代培養(yǎng)細(xì)胞在造模結(jié)束后立即吸除培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞1次，然后每孔加入1 ml Neurobasal細(xì)胞維持液，再加入1 ml JC-1染色工作液，輕輕混勻后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中育20 min，孵育結(jié)束后吸除上清液，用預(yù)冷的JC-1染色緩沖液洗滌2次，每孔加入2 ml細(xì)胞培養(yǎng)液后立即在熒光顯微鏡下觀察，1 h內(nèi)觀察完畢，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.2.7MPTP開(kāi)放程度檢測(cè) 造模結(jié)束后吸除培養(yǎng)液，用PBS洗滌1次，后加入適當(dāng)體積的鈣黃綠素乙酰甲酯(Calcein AM)染色液，輕輕晃動(dòng)使之混勻，放入培養(yǎng)箱中避光孵育40 min，孵育結(jié)束后更換成新鮮的37 ℃預(yù)熱的Neurobasal細(xì)胞維持液，然后再次避光孵育40 min，用PBS清洗3次，滴加DAPI后于熒光顯微鏡下觀察、拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

2 結(jié)果

2.1 七氟烷對(duì)原代海馬神經(jīng)細(xì)胞活力的影響檢測(cè)結(jié)果顯示，與Con組相比，Sevo組的細(xì)胞活力下降(F=12.81，P<0.05)；與Con組相比，CsA組用不同濃度的CsA(0.1、0.5、1 μmol/L)預(yù)處理24 h對(duì)細(xì)胞活力的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與Sevo組相比，Sevo+CsA(0.1、0.5、1 μmol/L)組可以降低七氟烷對(duì)細(xì)胞的損傷作用，其中CsA 的濃度為0.1 μmol/L時(shí)細(xì)胞活力最高(F=23.15，P<0.01)。因此，該研究選擇0.1 μmol/L CsA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度CsA對(duì)原代海馬神經(jīng)細(xì)胞活力的影響

2.2 七氟烷對(duì)原代海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響與Con組相比，Sevo組細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例增高，表明七氟烷持續(xù)暴露6 h可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(F=35.51，P<0.01)；與Sevo組相比，Sevo+0.1 μmol/L CsA預(yù)處理可以降低七氟烷持續(xù)暴露造成的高細(xì)胞凋亡率(F=26.61，P<0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

2.3 七氟烷對(duì)BDNF及突觸蛋白表達(dá)的影響與Con組相比，Sevo組BDNF、Snaptophysin、Snapsin-1、PSD-95等突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)量下降(F=13.57、14.63、17.90、16.21，P<0.05)；與Sevo組相比，Sevo+CsA組BDNF、Snaptophysin、Snapsin-1、PSD-95表達(dá)上調(diào)(F=10.98、12.79、13.77、14.05，P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 BDNF及突觸蛋白表達(dá)量

2.4 七氟烷對(duì)神經(jīng)元線粒體膜電位的影響與Con組相比，原代海馬神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)七氟烷處理后，JC-1聚合物熒光強(qiáng)度與JC-1單體熒光強(qiáng)度的比值降低，表明線粒體膜電位下降(F=29.74，P<0.01)；與Sevo組相比，CsA可以減輕七氟烷引起的線粒體膜電位的降低(F=16.84，P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 線粒體膜電位

2.5 七氟烷對(duì)神經(jīng)元MPTP開(kāi)放的影響與Con組相比，Sevo組線粒體上面的熒光強(qiáng)度有所降低，表明MPTP通道開(kāi)放致使線粒體熒光發(fā)生淬滅(F=27.46，P<0.01)；與Sevo組相比，Sevo+CsA組的線粒體熒光強(qiáng)度增高(F=15.05，P<0.01)，提示MPTP的開(kāi)放程度減低。見(jiàn)圖5。

圖5 MPTP開(kāi)放程度

2.6 七氟烷對(duì)CypD蛋白表達(dá)的影響與Con組相比，Sevo組CypD蛋白的表達(dá)上調(diào)(F=18.17，P<0.01)；與Sevo組相比，Sevo+CsA組CypD蛋白的表達(dá)下降(F=16.69，P<0.01)。見(jiàn)圖6。

圖6 CypD蛋白表達(dá)量

3 討論

七氟烷暴露對(duì)發(fā)育期大腦具有一定的神經(jīng)毒性[1,6]。但其具體機(jī)制目前仍不清楚。3%是兒科手術(shù)中使用七氟烷維持麻醉深度的常用濃度[5]，該研究將原代培養(yǎng)的SD大鼠海馬神經(jīng)元暴露于3%七氟烷6 h，觀察其神經(jīng)細(xì)胞凋亡、突觸蛋白表達(dá)、線粒體功能等指標(biāo)的變化，以探討MPTP及其陽(yáng)性調(diào)節(jié)蛋白CypD在七氟烷暴露導(dǎo)致發(fā)育期神經(jīng)細(xì)胞損傷中的分子機(jī)制。

該研究檢測(cè)3%七氟烷暴露6 h后的海馬神經(jīng)細(xì)胞的活性，結(jié)果顯示神經(jīng)細(xì)胞活力下降；利用TUNEL染色法檢測(cè)神經(jīng)元凋亡，結(jié)果顯示七氟烷暴露6 h后神經(jīng)細(xì)胞凋亡率增加。表明該研究已成功構(gòu)建了七氟烷細(xì)胞損傷模型。

除了七氟烷暴露會(huì)引起廣泛的海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡之外[7]，Ju et al[8]研究表明七氟烷暴露會(huì)導(dǎo)致嚙齒動(dòng)物遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制與七氟烷抑制神經(jīng)元突觸可塑性密切相關(guān)。神經(jīng)元發(fā)育至第7～10天是突觸生長(zhǎng)的關(guān)鍵階段[9]，因此該實(shí)驗(yàn)選擇在神經(jīng)元培養(yǎng)至第7天時(shí)檢測(cè)影響突觸功能的相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)含量。BDNF是影響神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和存活的重要神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，成熟的BDNF能夠結(jié)合并激活TrkB信號(hào)傳導(dǎo)通路，參與突觸可塑性的調(diào)節(jié)[10]。Snaptophysin、Snapsin-1分布在神經(jīng)元突觸前膜中突觸囊泡中，影響突觸前可塑性，而PSD-95位于突觸后致密區(qū)，影響突觸后可塑性[11]。該研究中，培養(yǎng)的神經(jīng)元在七氟烷暴露6 h后BDNF、Snaptophysin、Snapsin-1、PSD-95表達(dá)下調(diào)，提示七氟烷對(duì)海馬神經(jīng)元的突觸前、突觸后可塑性均有抑制作用。

線粒體是維持能量平衡的重要細(xì)胞器，參與細(xì)胞凋亡、突觸發(fā)育和突觸可塑性的調(diào)節(jié)。Yang et al[12]研究表明抑制線粒體膜電位的下降可以降低細(xì)胞凋亡發(fā)生率。在突觸形成關(guān)鍵期進(jìn)行吸入麻醉藥暴露可引起線粒體融合和分裂失衡，造成氧自由基過(guò)量生成，誘發(fā)新生突觸的能量代謝障礙，最終對(duì)樹(shù)突棘以及突觸的形成、穩(wěn)定和正常功能造成損害[13]。線粒體功能異?？赡苁瞧叻槁樽硪鹕窠?jīng)細(xì)胞凋亡和突觸受損的共同靶點(diǎn)。該研究中七氟烷暴露使線粒體JC-1發(fā)生從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變，表明線粒體膜電位下降，線粒體功能受損。

Bernardi et al[14]在心肌缺血再灌注模型中證明了MPTP的正常開(kāi)閉在維持線粒體功能穩(wěn)定中發(fā)揮至關(guān)重要作用。MPTP開(kāi)放有兩種狀態(tài)，生理性(低電導(dǎo))MPTP開(kāi)放可以維持線粒體功能，而病理性(高電導(dǎo))MPTP開(kāi)放則會(huì)造成線粒體膜電位崩潰、線粒體腫脹和線粒體外膜破裂，隨之釋放膜間線粒體促凋亡蛋白，包括細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子等，這些物質(zhì)進(jìn)入胞質(zhì)后引發(fā)細(xì)胞凋亡。MPTP主要由電壓依賴性陰離子通道(VDAC)、腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶(ANT)以及CypD構(gòu)成。而ANT和VDAC基因敲除(KO)動(dòng)物/細(xì)胞模型的研究[15-16]表明VDAC、ANT不參與MPTP開(kāi)放的調(diào)節(jié)，CypD是調(diào)節(jié)MPTP開(kāi)放的主要調(diào)控因子。該研究顯示，與對(duì)照組相比，七氟烷處理細(xì)胞后，線粒體內(nèi)綠色熒光發(fā)生淬滅，表明MPTP開(kāi)放增多，同時(shí)MPTP調(diào)節(jié)因子CypD的表達(dá)增加。

中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷和阿爾茨海默病等動(dòng)物模型的研究表明低濃度的CsA具有神經(jīng)保護(hù)作用[5,7]，而高濃度的CsA可能造成肝腎功能受損和神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)[17]。該研究檢測(cè)了不同濃度的CsA對(duì)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的影響，結(jié)果表明最低濃度0.1 μmol/L CsA的保護(hù)效果相對(duì)較好。運(yùn)用0.1 μmol/L CsA處理細(xì)胞可以適當(dāng)恢復(fù)細(xì)胞活力，降低細(xì)胞凋亡率，增加突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)，維持細(xì)胞膜電位穩(wěn)定，下調(diào)CypD蛋白表達(dá)。

綜上所述，細(xì)胞凋亡增加、突觸可塑性降低及線粒體功能損傷參與七氟烷引起神經(jīng)毒性的過(guò)程，其機(jī)制可能與促進(jìn)MPTP開(kāi)放，上調(diào)CypD表達(dá)有關(guān)。CsA能夠通過(guò)抑制MPTP開(kāi)放發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，有可能為預(yù)防七氟烷暴露導(dǎo)致神經(jīng)損傷提供一種新的保護(hù)思路。