劉漢成，李慧明，張 杰，孟慶來(lái)，丁 實(shí)，馬立輝

乳腺癌是世界范圍內(nèi)女性癌癥死亡的主要原因[1]。三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)作為乳腺癌的亞型之一，具有高轉(zhuǎn)移、高侵襲、高復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，并且是所有乳腺癌類(lèi)型中預(yù)后最差的一種[2]。TNBC由于雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)及人類(lèi)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2(human epithelial growth factor receptor 2，Her2)表達(dá)均為陰性，導(dǎo)致患者無(wú)法從內(nèi)分泌治療及Her2靶向治療中獲益。目前，放化療仍是治療TNBC的主要手段，但耐藥性、并發(fā)癥以及毒副作用的產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致患者預(yù)后不佳，并不能有效延長(zhǎng)患者的生存期。因此，尋找新型、安全、有效的抗腫瘤藥物，提高治療效果，是當(dāng)今TNBC研究的熱點(diǎn)。圣草酚(eriodidoyol，Eri)是一種天然化合物，不僅對(duì)部分腫瘤細(xì)胞有明顯的抗腫瘤活性[3-5]，而且還對(duì)人體毒副作用小。此外，原癌基因c-Myc作為一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]。雄激素受體(androgen receptor，AR)是核受體家族的一員，在10%～43%的TNBC患者中均有表達(dá)[7]。已有研究[8]表明，激活c-Myc/AR軸可促進(jìn)ER(-)/Her2(+)乳腺癌的惡性發(fā)展，但其對(duì)TNBC的影響還尚未見(jiàn)報(bào)道。該研究基于c-Myc/AR軸，探究Eri對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以期為臨床TNBC的治療開(kāi)拓更多的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞 三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

1.1.2主要試劑 Eri(純度≥98%，批號(hào)：Y12O8H4553)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；4%多聚甲醛固定液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜(DMSO)、MTT試劑盒、姬姆薩染色原液(×10)、AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；L15培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司；引物序列購(gòu)自武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司；siRNA購(gòu)自上海吉瑪基因科技有限公司；TRIzol、Lipofectamine? RNAiMAX、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Introvigen公司；Cleaved-caspase-3抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體、c-Myc抗體、AR抗體、GAPDH抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶(HPR)標(biāo)記的山羊抗兔/鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.1.3主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(型號(hào)：MCO-18AC)購(gòu)自日本松下公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(型號(hào)：MR-96A)購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；流式細(xì)胞儀(型號(hào)：NovoCyte 2040R)購(gòu)自美國(guó)ACEA公司；熒光定量PCR儀(型號(hào)：ABI 7300)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；化學(xué)發(fā)光成像儀(型號(hào)：Tanon-5200)購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231細(xì)胞用含有10%胎牛血清的L15培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，細(xì)胞密度達(dá)90%以上時(shí)，用胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)期MDA-MB-231細(xì)胞消化接種于6孔板中，待細(xì)胞密度生長(zhǎng)至70%～80%，使用Lipofectamine? RNAiMAX將含有c-Myc干擾RNA序列(si-c-Myc)的質(zhì)粒載體及其陰性對(duì)照質(zhì)粒載體(si-NC)轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞中，將細(xì)胞依次分為si-c-Myc組和si-NC組，另設(shè)置對(duì)照組(Control組)。置于培養(yǎng)箱6 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后采用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3細(xì)胞分組及處理 將MDA-MB-231細(xì)胞分為空白組(blank組)：MDA-MB-231細(xì)胞未經(jīng)任何處理；Eri組：MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)50 μmol/L Eri處理48 h；si-c-Myc組：MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-c-Myc質(zhì)粒載體；si-c-Myc+Eri組：MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-c-Myc質(zhì)粒載體后再經(jīng)50 μmol/L Eri處理48 h。

1.2.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 以2 000個(gè)/孔的細(xì)胞密度將對(duì)數(shù)期MDA-MB-231細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)過(guò)夜。加入終濃度為0、1.0、7.5、15.0、30.0、60.0和120.0 μmol/L的Eri分別培養(yǎng)12、24、48 h或按照上述分組處理；提前4 h向每孔中加入20 μl MTT溶液，避光孵育4 h，吸掉上清液，每孔中加入150 μl DMSO，暗處振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)570 nm處的吸光度值，計(jì)算IC50值。

本文主要針對(duì)上海市典型的城市道路施工產(chǎn)生的噪聲和揚(yáng)塵影響提出有針對(duì)性的環(huán)境保護(hù)措施，為工程建設(shè)和環(huán)境管理提供科學(xué)依據(jù)，做到既發(fā)展經(jīng)濟(jì)又保護(hù)環(huán)境，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展，同時(shí)為城市道路工程施工期的環(huán)境保護(hù)提供相關(guān)技術(shù)和方法參考。

1.2.5平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖克隆能力 取對(duì)數(shù)期MDA-MB-231細(xì)胞以1 000個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板，待細(xì)胞完全貼壁后分別加入0、12.5、25和50 μmol/L Eri處理細(xì)胞48 h，更換新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每4 d換液1次，并于顯微鏡下觀察細(xì)胞群落形成情況。待孔板中細(xì)胞群落形成足夠明顯，棄培養(yǎng)基，加入PBS洗滌3次，加入4%多聚甲醛固定液固定20 min，棄固定液，避光條件下加入姬姆薩染色工作液(×1)，室溫染色20 min，棄染色液，用蒸餾水洗滌殘留染色液，充分晾干，在顯微鏡下觀察后用高清相機(jī)拍照，并計(jì)算每組細(xì)胞的克隆數(shù)量。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)期MDA-MB-231細(xì)胞以2.0×104個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板，待細(xì)胞完全貼壁后分別加入0、12.5、25和50 μmol/L Eri處理細(xì)胞48 h或按照上述分組處理。收集各組細(xì)胞，加入PBS清洗1次后，按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，使用400 μl緩沖液制備細(xì)胞懸液，依次加入AnnexinV-FITC、PI染色液各5 μl，混懸細(xì)胞后避光孵育15 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.7qRT-PCR檢測(cè)c-Myc表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，使用TRIzol試劑提取細(xì)胞中總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并使用qRT-PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將10 μl qPCR混合物及每種引物0.5 μl混合均勻，配制成最終的20 μl反應(yīng)混合物。用于擴(kuò)增的熱循環(huán)參數(shù)如下：94 ℃變性2 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；25 ℃ 5 min終止反應(yīng)，構(gòu)建熔解曲線并在62 ℃和95 ℃之間進(jìn)行分析，采用2-△△Ct法計(jì)算c-Myc相對(duì)于內(nèi)參基因GAPDH的表達(dá)水平。c-Myc引物F：5′-CAGAAAUGUCCUGAGCAAUUU-3′，R：5′-AUUG CUCAGGACAUUUCUGUU-3′。GAPDH引物F：5′-CCCACATGGCCTCCAAGGAGT-3′，R：5′-GTGTACAT GGCAACTGT-GAGG-3′。

1.2.8Western blot法檢測(cè) 收集細(xì)胞沉淀，使用RIPA緩沖液冰上充分裂解30 min，然后以14 652 r/min離心15 min，收集上清液，使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)含量。取30 μg蛋白經(jīng)沸水浴變性后，采用SDS-PAGE電泳，分離蛋白，再將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，經(jīng)50 g/L脫脂奶粉溶液室溫封閉 2 h，加入Cleaved-aspase-3、Bax、Bcl-2、c-Myc、AR、GAPDH抗體(1 ∶500)在4 ℃下孵育過(guò)夜。TBST清洗3次，將膜與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔/鼠二抗(1 ∶10 000)在室溫下孵育1 h，TBST清洗3次，滴加ECL顯影液顯色。用Image J軟件分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

圖1 Eri對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響與0.0 μmol/L Eri組比較：*P<0.05

2.2 Eri對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞克隆能力的影響如圖2所示，不同濃度Eri處理后，MDA-MB-231細(xì)胞克隆數(shù)量逐漸降低(F=171.291，P<0.05)。與0 μmol/L組比較，12.5、25.0、50.0 μmol/L Eri處理后MDA-MB-231細(xì)胞群落變小，細(xì)胞克隆數(shù)量顯著減少(P<0.05)。

圖2 Eri對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞克隆能力的影響與0.0 μmol/L Eri組比較：*P<0.05

2.3 Eri對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響如圖3、4所示，不同濃度(0、12.5、25.0、50.0 μmol/L)Eri處理后，MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率逐漸升高(F=73.392，P<0.05)，Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平逐漸上調(diào)(F=188.351、167.587，P<0.05)，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)水平逐漸下調(diào)(F=53.894，P<0.05)。

圖3 Eri對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響與0.0 μmol/L Eri組比較：*P<0.05

2.4 Eri對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中c-Myc和AR表達(dá)的影響如圖5所示，不同濃度(0、12.5、25.0、50.0 μmol/L)Eri處理后，MDA-MB-231細(xì)胞中c-Myc和AR蛋白表達(dá)水平逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=483.772、476.831，P<0.05)。

圖5 Eri對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中c-Myc和AR蛋白表達(dá)水平的影響與0.0 μmol/L Eri組比較：*P<0.05

2.5 Eri和沉默c-Myc對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖、凋亡及c-Myc/AR軸的影響如圖6所示，與Control組比較，si-c-Myc組細(xì)胞中c-Myc mRNA和c-Myc蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，而si-NC組無(wú)顯著變化(P>0.05)。如圖7所示，與blank組比較，Eri組和si-c-Myc組細(xì)胞增殖活性顯著降低(P<0.05)，凋亡率顯著升高(P<0.05)，c-Myc和AR蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)；與Eri組比較，si-c-Myc+Eri組細(xì)胞增殖活性顯著降低(P<0.05)，凋亡率顯著升高(P<0.05)，c-Myc和AR蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)；與si-c-Myc組比較，si-c-Myc+Eri組細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞凋亡率、c-Myc和AR蛋白表達(dá)水平均無(wú)顯著變化(P>0.05)。

圖6 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中c-Myc mRNA和蛋白表達(dá)水平

圖7 Eri和沉默c-Myc對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖、凋亡及c-Myc/AR軸的影響與blank組比較：*P<0.05；與Eri組比較：#P<0.05

3 討論

Eri是一種廣泛存在于蔬菜、水果及中藥中的天然二氫黃酮化合物，具有抗炎、抗氧化以及保護(hù)神經(jīng)等多種藥理活性。此外，有研究指出，Eri具備一定的抗腫瘤活性，如Tang et al[9]研究表明，Eri通過(guò)抑制MEK/ERK信號(hào)通路激活來(lái)抑制鼻咽癌CNE1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。Lv et al[10]研究表明，Eri通過(guò)阻斷P38 MAPK/GSK-3β/ZEB1信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤A172和U87 MG細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用。但Eri對(duì)TNBC的影響還尚不知曉。該研究結(jié)果顯示，Eri可呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)控c-Myc/AR軸有關(guān)。

圖4 Eri對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響與0.0 μmol/L Eri組比較：*P<0.05

AR是核受體家族的一員，屬于配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，易被睪酮及其代謝物二氫睪酮等雄激素所激活，活化后的AR會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核中，與下游的靶基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，最終影響細(xì)胞的功能[11]。目前，已有大量研究顯示，AR在多種癌癥發(fā)病機(jī)制中起到關(guān)鍵作用，例如，王長(zhǎng)林 等[12]報(bào)道AR抑制劑氟他胺能明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251細(xì)胞的侵襲與遷移。Wang et al[13]研究顯示AR通過(guò)調(diào)控ASS1P3/miR-34a-5p/ASS1信號(hào)通路促進(jìn)腎細(xì)胞癌RCC細(xì)胞增殖。該研究結(jié)果顯示，Eri可呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖，提高凋亡率，上調(diào)Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平，說(shuō)明Eri對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)揮促凋亡作用。進(jìn)一步研究表明，不同濃度Eri處理可降低MDA-MB-231細(xì)胞中AR蛋白表達(dá)水平，提示Eri抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡可能與AR有關(guān)。任秋宇 等[14]研究也表明抑制AR的活性可一定程度上誘導(dǎo)三陰性乳腺癌BT549細(xì)胞凋亡。隨后，該研究還表明不同濃度Eri酚處理可下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中c-Myc蛋白表達(dá)水平，表明Eri可抑制MDA-MB-231細(xì)胞中c-Myc的表達(dá)。

c-Myc作為原癌基因Myc家族成員之一，參與細(xì)胞增殖、代謝、蛋白質(zhì)合成等重要生命活動(dòng)，尤其是在腫瘤中。以往研究[15]指出，c-Myc在多種腫瘤細(xì)胞中處于高活化狀態(tài)，敲低其表達(dá)可抑制癌細(xì)胞增殖進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)展。為進(jìn)一步研究Eri是否是經(jīng)c-Myc/AR軸對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)揮抗癌作用，該研究沉默c-Myc基因表達(dá)后聯(lián)合Eri進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，c-Myc基因沉默可顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖活性，促進(jìn)其凋亡，并下調(diào)AR蛋白表達(dá)。然而，Eri聯(lián)合處理不能增強(qiáng)c-Myc基因沉默對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用和凋亡的促進(jìn)作用，表明阻斷c-Myc/AR軸后Eri不能經(jīng)過(guò)其他途徑對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖和凋亡產(chǎn)生影響。

綜上所述，Eri可抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其作用機(jī)制可能與調(diào)控c-Myc/AR軸有關(guān)。該研究結(jié)果可為T(mén)NBC的臨床用藥提供新的思路，但仍需更多的研究進(jìn)行探討和驗(yàn)證。