李國(guó)丹，楊 勤，李秋燕，陳小誼，符偉玉，蘭柳波，林小聰

結(jié)直腸癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)直腸癌發(fā)病率和病死率在中國(guó)惡性腫瘤中分別位居第3和第5位，并呈逐年上升趨勢(shì)；中國(guó)已經(jīng)成為全球結(jié)直腸癌每年新發(fā)病例數(shù)和死亡病例數(shù)最多的國(guó)家[1]。因此，研究結(jié)直腸癌發(fā)生與發(fā)展的分子機(jī)制，尋找結(jié)直腸癌潛在的治療靶點(diǎn)，具有重要臨床意義。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是片段長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸且無編碼蛋白質(zhì)能力的一類RNA分子，可在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。近年來研究[2-5]表明，LINC01224在肝癌、卵巢癌、胃癌及口腔癌中發(fā)揮促癌作用，其表達(dá)上調(diào)可能是導(dǎo)致上述腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因。研究[6]報(bào)道，LINC01224在結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制中也起重要作用，下調(diào)LINC01224表達(dá)可抑制癌細(xì)胞增殖、侵襲及移植瘤生長(zhǎng)。但LINC01224與結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的關(guān)系尚不明確。該研究通過構(gòu)建靶向干擾LINC01224的重組慢病毒載體，篩選出穩(wěn)定且低表達(dá)LINC01224的LoVo和SW620細(xì)胞，并觀察LINC01224對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為后續(xù)的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料人結(jié)直腸癌細(xì)胞(LoVo、SW620、Caco2、THC-8307、COLO-205、RKO、DLD-1、HCT-116、SW480、HT-29)、正常結(jié)直腸上皮HCOEPic細(xì)胞及人腎胚HEK 293T細(xì)胞均由該課題組實(shí)驗(yàn)室保存。胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)；DH5α感受態(tài)細(xì)胞(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司)；TRIzol試劑、Opti-MEM培養(yǎng)基(美國(guó)Invitrogen公司)；PrimeScript RT試劑盒(日本TaKaRa公司)；SYBR Green qPCR SuperMix試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)；限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和Mulu(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；MTS試劑(美國(guó)Promega公司)；流式凋亡試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；Lipofectamine 3000、酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 正常結(jié)直腸上皮HCOEPic細(xì)胞、結(jié)直腸癌細(xì)胞(LoVo、SW620、Caco2、COLO-205、RKO、DLD-1、SW480、HT-29)培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)和1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中；結(jié)直腸癌細(xì)胞(THC-8307、HCT-116)培養(yǎng)于含10% FBS和1%青-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，所有細(xì)胞均培養(yǎng)于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中。

1.2.2生物信息學(xué)分析 使用GEPIA2(Gene Expression Profiling Interactive AnalysisGene Expression Profiling Interactive Analysis，http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)數(shù)據(jù)庫分析LINC01224在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 由美國(guó)Sigma公司合成3組針對(duì)LINC01224的小干擾RNA(siRNA)序列。根據(jù)Lipofectanmine 3000試劑說明書進(jìn)行Lovo細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染細(xì)胞分為siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組及對(duì)照組(siRNA-NC)，qPCR檢測(cè)3種siRNA抑制細(xì)胞內(nèi)LINC01224表達(dá)的情況。以干擾效果最顯著的siRNA構(gòu)建LINC01224的shRNA。下調(diào)LINC01224表達(dá)的siRNA序列如下：siRNA-1，(F)5′-TGGAATGTGTCCACATGGGdTdT-3′，(R)5′-CCCATGTGGACACATTCCAdTdT-3′； siRNA-2，(F)5′-TTCTCTCCTGCTTTGGTGCdTdT-3′，(R)5′-GCACCAAAGCAGGAGAGAAdTdT-3′； siRNA-3，(F)5′-AGCATTTAGGCCCACTACCdTdT-3′，(R)5′-GGTAGTGGGCCTAAATGCTdTdT-3′；siRNA-NC，(F)5′-GAACUGGGGUGCGUGUGAUdTdT-3′，(R)5′-AUCACACGCACCCCAGUUCdTdT-3′。

1.2.4RT-qPCR TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，使用PrimeScript RT試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照SYBR Green qPCR SuperMix試劑盒說明書進(jìn)行qPCR分析，檢測(cè)LINC01224的表達(dá)水平。以GAPDH作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算LINC01224的相對(duì)表達(dá)量。引物序列：LINC01224，(F)5′- CCAGAGCTGTGCAGATGAGT-3′、(R)5′-CTGCAGCTTCGTCAGCAGGC-3′；GAPDH，(F)5′-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3′、(R)5′-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3′。

1.2.5LINC01224 shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定 選擇LoVo細(xì)胞內(nèi)干擾LINC02114表達(dá)效果最明顯的siRNA序列，以“BamH I酶切位點(diǎn)+siRNA正義鏈+Loop環(huán)序列+siRNA反義鏈+MluI酶切位點(diǎn)”為原則對(duì)LINC01224的shRNA基因序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，蘇州金唯智生物科技有限公司合成shRNA基因序列正義鏈和反義鏈。構(gòu)建慢病毒載體的shRNA基因序列如下：sh-LINC01224，(F)5′-GATCCAG CATTTAGGCCCACTACCTTCAAGAGAGGTAGTGGGC CTAAATGCTTTTTTA-3′，(R)5′-CGCGTAAAAAAG CATTTAGGCCCACTACCTCTCTTGAAGGTAGTGGGC CTAAATGCTG-3′。混合等體積的正義鏈和反義鏈，金屬浴煮沸5 min，隨后72 ℃保溫15 min，冷卻至室溫，所得為雙鏈的LINC01224 shRNA基因序列。使用限制性核酸內(nèi)切酶MluI和BamH I對(duì)pLent-U6-GFP-Puro載體進(jìn)行雙酶切，T4 DNA連接酶回收酶切產(chǎn)物，將其與shRNA基因序列進(jìn)行連接反應(yīng)(16 ℃，1 h)，獲得pLent-U6-sh-LINC01224-GFP-Puro重組質(zhì)粒，定義為sh-LINC01224組(對(duì)照組為pLent-U6-GFP-Puro空載質(zhì)粒，定義為sh-NC組)。使用DH5α大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，進(jìn)行擴(kuò)增后，將感受態(tài)細(xì)胞接種于LB瓊脂培養(yǎng)基(含100 μg/ml氨芐青霉素)，37 ℃倒置培養(yǎng)16 h。挑取單個(gè)抗性菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增，通過質(zhì)粒提取進(jìn)行核酸測(cè)序鑒定。

1.2.6重組慢病毒包裝及滴度測(cè)定 轉(zhuǎn)染前，更換細(xì)胞培養(yǎng)基為無雙抗完全培養(yǎng)基。使用Lipofectamine 3000試劑盒將病毒輔助包裝質(zhì)粒(pHelper 1.0及pHelper 2.0)和LINC01224的重組慢病毒質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK 293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染8～10 h后更換為完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行離心，所得上清液使用0.45 μm濾器過濾，再高速離心(75 000 r/min )進(jìn)行濃縮，0.22 μm過濾器過濾，即可得到高滴度重組慢病毒濃縮液。采用倍比稀釋計(jì)數(shù)法進(jìn)行慢病毒滴度測(cè)定。

1.2.7慢病毒感染靶細(xì)胞及嘌呤霉素篩選 將LoVo及SW620細(xì)胞濃度調(diào)整為7×104個(gè)/ml，接種于24孔板。待細(xì)胞匯合度長(zhǎng)至30%～40%,加入重組慢病毒和終濃度為6 μg/ml的聚凝胺，混勻后常規(guī)培養(yǎng)8 h，更換為不含聚凝胺的完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，以含4 μg/ml嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基連續(xù)篩選2周，獲得抗性細(xì)胞克隆。

1.2.8單克隆穩(wěn)定細(xì)胞株的建立 具有嘌呤霉素抗性的LoVo及SW620細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為2 000～3 000個(gè)/ml，每孔100 μl接種于96孔板。有限稀釋法篩選出單個(gè)且表達(dá)GFP的細(xì)胞，隨后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.9MTS檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為每孔1×104個(gè)細(xì)胞，接種于96孔板。分別培養(yǎng)24、48、72和96 h，每孔加入10 μl CellTiter 96 AQ單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，然后置于酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值。

1.2.10流式細(xì)胞術(shù) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行消化重懸，每個(gè)樣品收集5×105個(gè)細(xì)胞，PBS洗滌3次。離心棄上清液收集沉淀細(xì)胞。按照Annexin V-PE/7-AAD凋亡流式檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，將收集的細(xì)胞重懸于結(jié)合緩沖液中，在細(xì)胞懸液中加入5 μl Annexin V PE，室溫避光孵育5 min，隨后加入10 μl 7-AAD，1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中LINC01224的表達(dá)情況應(yīng)用GEPIA2數(shù)據(jù)庫對(duì)TCGA(The Cancer Genome Atlas)和GTEx(The Genotype Tissue Expression)中結(jié)直腸癌組織的LINC01224 RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，LINC01224在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)(n=275)高于正常結(jié)直腸組織(n=349)(P<0.05)(圖1A)。qPCR結(jié)果顯示，與正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞相比，LINC01224在10種結(jié)直腸癌細(xì)胞(包括LoVo、SW620、Caco2、THC-8307、COLO-205、RKO、DLD-1、HCT-116、SW480和HT-2細(xì)胞)中HCOEPic均呈高表達(dá)(t=81.01、77.34、41.46、47.14、41.20、47.73、94.43、112.58、56.8、100.24，P<0.01)(圖1B)；其中以LoVo和SW620細(xì)胞其LINC01224的表達(dá)上調(diào)最為顯著。因此，選擇LoVo和SW620細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 篩選最佳干擾的siRNA片段qPCR結(jié)果顯示，siRNA-1組、siRNA-2組和siRNA-3組針對(duì)LoVo細(xì)胞的LINC01224 RNA干擾效率分別為8%、75%和86%。與對(duì)照組比較，siRNA-2組和siRNA-3組LINC01224表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=113.00、148.96，P<0.01)(圖2)。其中，siRNA-3組的LINC01224表達(dá)下調(diào)最為顯著。因此，選擇siRNA-3構(gòu)建shRNA慢病毒載體。

2.3 LINC01224 shRNA重組載體的鑒定與LINC01224 shRNA目標(biāo)序列相比，插入序列未發(fā)生堿基插入、突變、缺失等情況，與目標(biāo)序列完全一致(圖3)，提示LINC01224 shRNA慢病毒載體構(gòu)建成功。

圖3 LINC01224 shRNA慢病毒載體測(cè)序結(jié)果

2.4 建立穩(wěn)定靶向干擾LINC01224表達(dá)的LoVo和SW620結(jié)直腸癌細(xì)胞株熒光顯微鏡下sh-LINC01224組與對(duì)照組(sh-NC組)LoVo和SW620細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，均可穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光(圖4)。qPCR結(jié)果表明，sh-LINC01224組LINC01224表達(dá)水平較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=85.21，52.37，P<0.01)，即成功構(gòu)建穩(wěn)定靶向下調(diào)LINC01224表達(dá)的LoVo和SW620結(jié)直腸癌細(xì)胞株。見圖5。

圖4 熒光顯微鏡下觀察穩(wěn)定靶向干擾LINC01224表達(dá)的LoVo和SW620結(jié)直腸癌細(xì)胞株 ×200

圖5 qPCR檢測(cè)LoVo和SW620穩(wěn)定干擾細(xì)胞株中LINC01224的表達(dá)水平

2.5 穩(wěn)定靶向敲低LINC01224對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響MTS結(jié)果顯示，與對(duì)照組(sh-NC組)相比，靶向干擾LINC01224表達(dá)抑制LoVo和SW620細(xì)胞增殖(圖6A、B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LoVo：48 h，t=9.21，P<0.01；72 h，t=45.84，P<0.01；96 h，t=47.42，P<0.01；SW620：48 h，t=15.27，P<0.01；72 h，t=10.98，P<0.01；96 h，t=13.21，P<0.01)；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，在LoVo細(xì)胞中，sh-NC組細(xì)胞凋亡比例為(8.22±0.41)%，低于sh-LINC02114組細(xì)胞凋亡率(24.66±0.93)%；在SW620細(xì)胞中，sh-NC組細(xì)胞凋亡比例為(6.35±0.34)%，低于sh-LINC02114組細(xì)胞凋亡率(23.42±0.63)%(圖6C、D)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LoVo：t=28.05，P<0.01；SW620：t=41.53，P<0.01)。

圖6 下調(diào)LINC01224表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

3 討論

lncRNA是控制基因并影響多種生物學(xué)進(jìn)程的重要表觀遺傳調(diào)控因子。lncRNA能夠在染色質(zhì)水平、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平等多個(gè)層面調(diào)控基因表達(dá)，作用范圍十分廣泛[7]。染色質(zhì)水平的調(diào)控是最早被鑒定的lncRNA功能之一。lncRNA可通過直接募集DNA甲基轉(zhuǎn)移酶或其他復(fù)合物改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)并調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平[8-10]。其次，lncRNA可干擾增強(qiáng)子和啟動(dòng)子的作用進(jìn)而干擾轉(zhuǎn)錄進(jìn)程，如干擾蛋白質(zhì)因子結(jié)合、調(diào)節(jié)關(guān)鍵凋亡基因轉(zhuǎn)錄等[11]。LncRNA還可以通過識(shí)別互補(bǔ)序列，參與信使RNA(mRNA)的轉(zhuǎn)錄后修飾，如充當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)等[10,12-13]。研究[2-6,14]表明，LINC01224在多種腫瘤的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，可能成為潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)。在肝癌中，LINC01224可通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-330-5p上調(diào)CHEK1表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌發(fā)展[2]。在卵巢癌中，LINC01224可作為競(jìng)爭(zhēng)性RNA通過與miR-485-5p結(jié)合，上調(diào)PAK4表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和移植瘤生長(zhǎng)，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡[3]。在胃癌中，LINC01224可通過靶向吸附miR-193a-5p上調(diào)CDK8表達(dá)，加速癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移以及腫瘤形成，并抑制細(xì)胞凋亡[4]。在口腔癌中，LINC01224可通過靶向調(diào)控miR-125b，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖并抑制其凋亡[5]。在腎癌中，LINC01224可通過吸附miR-542-3p上調(diào)MFN2表達(dá)，阻斷Ras-Raf1-ERK1/2信號(hào)通路，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞增殖和遷移[14]。在結(jié)直腸癌中，LINC01224可直接結(jié)合具有抑癌基因活性的miR-2467并下調(diào)miR-2467表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲及移植瘤生長(zhǎng)[6]。但LINC01224對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響，迄今尚無文獻(xiàn)報(bào)道。

該研究通過GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析顯示LINC01224在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)高于正常結(jié)直腸組織，其在10種結(jié)直腸癌細(xì)胞中也呈表達(dá)上調(diào)。鑒于此，設(shè)計(jì)合成3組針對(duì)LINC01224的siRNA，隨后轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞并進(jìn)行qPCR檢測(cè)，由此篩選出最有效的LINC01224干擾片段siRNA-3。鑒于siRNA在細(xì)胞內(nèi)無法進(jìn)行復(fù)制，隨細(xì)胞的增殖和分裂易被降解及稀釋，其介導(dǎo)的基因沉默效應(yīng)持續(xù)時(shí)間短；而shRNA是一段具有緊密發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA序列，在細(xì)胞內(nèi)可被剪切形成siRNA，其所構(gòu)建的載體可在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自主復(fù)制及轉(zhuǎn)錄，穩(wěn)定性更強(qiáng)，促使目的基因的沉默作用可維持時(shí)間更長(zhǎng)[15]。因此，選擇shRNA來構(gòu)建LINC01224的干擾載體。該實(shí)驗(yàn)shRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)原則：① 克隆到shRNA表達(dá)載體中的shRNA 包括兩個(gè)短反向重復(fù)序列，中間由一莖環(huán)(loop)序列分隔開，組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由pol Ⅲ啟動(dòng)子控制，隨后再連接上5～6個(gè)T作為RNA聚合酶Ⅲ的轉(zhuǎn)錄終止子；② 兩個(gè)互補(bǔ)寡核苷酸兩端須帶有限制性酶切位點(diǎn)；③ 在啟動(dòng)子下游的酶切位點(diǎn)下方緊連一個(gè)或兩個(gè)C，使插入片段和啟動(dòng)子有一定空間間隔確保轉(zhuǎn)錄發(fā)生；④ 目的序列的第1個(gè)堿基為G以確保RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，或者緊連正義鏈的上游為G；⑤ 插入片段中的莖環(huán)位置靠近寡核苷酸的中央；⑥ 正義鏈與反義鏈序列上不能出現(xiàn)連續(xù)3個(gè)以上的T。根據(jù)以上原則，利用siRNA-3來設(shè)計(jì)合成針對(duì)LINC01224的shRNA。與質(zhì)粒和其他的病毒載體相比，慢病毒基因轉(zhuǎn)移效率高，可感染非分裂期與分裂期細(xì)胞，免疫原性和細(xì)胞毒性低，表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，為攜帶目的基因干擾序列的理想載體[16-17]。因此，以慢病毒為載體來攜帶LINC01224 shRNA。通過重組病毒包裝、靶細(xì)胞感染、嘌呤霉素處理及有限稀釋法篩選，獲得了穩(wěn)定下調(diào)LINC01224的單克隆細(xì)胞株，qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LoVo和SW620細(xì)胞sh-LINC01224組LINC01224表達(dá)水平較對(duì)照組分別降低80%和81%，熒光顯微鏡下sh-LINC01224組與對(duì)照組(sh-NC組)LoVo和SW620細(xì)胞均可穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光。MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從48 h開始，靶向干擾LINC01224表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌LoVo和SW620細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，穩(wěn)定下調(diào)LINC01224表達(dá)也可誘導(dǎo)LoVo和SW620細(xì)胞凋亡。

綜上所述，該研究通過重組慢病毒包裝shRNA、靶細(xì)胞感染、嘌呤霉素及有限稀釋法篩選細(xì)胞等方法，成功建立了穩(wěn)定靶向干擾LINC01224表達(dá)的LoVo和SW620結(jié)直腸癌細(xì)胞株，并初步探討了LINC01224對(duì)結(jié)直腸癌的增殖及凋亡的影響，為后續(xù)進(jìn)一步研究LINC01224在結(jié)直腸癌凋亡中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。