涂羽昂 蔡沛燃 余嘉懿 羅云彥 蔣欽楊 黃艷娜

摘要：【目的】明確核因子NF-E2相關(guān)因子（Nrf2）基因生物學(xué)特性，并探究其在陸川豬和杜長大豬背最長肌中的表達(dá)差異，為深入研究陸川豬優(yōu)質(zhì)肌肉抗氧化性能的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)?！痉椒ā恳?50日齡的陸川豬和杜長大豬背最長肌組織總RNA為模板，分段克隆Nrf2基因編碼區(qū)（CDS）序列，并通過ExPASy ProtScale、ExPASy ProtParam及SWISS-MODEL等在線軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting檢測Nrf2基因在150日齡陸川豬和杜長大豬背最長肌中的表達(dá)差異。【結(jié)果】陸川豬和杜長大豬Nrf2基因CDS序列長1686 bp，與GenBank中已公布的野豬、杜長大豬、牛、綿羊、黑猩猩、獼猴、狼、人類、家鼠、大白鼠、鴕鳥和普通家雞的Nrf2基因CDS序列的同源相似性分別為99.7%、99.5%、91.2%、90.6%、90.5%、90.1%、89.5%、86.5%、81.9%、81.7%、72.0%和70.6%。陸川豬與杜長大豬的遺傳距離最近，與狼的遺傳距離最遠(yuǎn)。陸川豬和杜長大豬的Nrf2蛋白都由561個(gè)氨基酸組成，且以絲氨酸含量最高，占比12.5%，色氨酸含量最低，僅占0.4%，均具有較強(qiáng)的親水性。在Nrf2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中，杜長大豬Nrf2蛋白的無規(guī)則卷曲占57.75%，α-螺旋占34.05%，延伸鏈占5.35%，β-轉(zhuǎn)角占2.85%;陸川豬Nrf2蛋白的無規(guī)則卷曲占57.93%，α-螺旋占33.51%，延伸鏈占6.06%， β-轉(zhuǎn)角占2.50%。150日齡陸川豬背最長肌中Nrf2基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于同日齡杜長大豬背最長肌中Nrf2基因的相對(duì)表達(dá)量（P<0.05）;且陸川豬Nrf2蛋白表達(dá)量極顯著高于同日齡杜長大豬背最長肌中Nrf2蛋白表達(dá)量（P<0.01）。【結(jié)論】成功克隆陸川豬和杜長大豬Nrf2基因CDS序列，陸川豬背最長肌中Nrf2基因表達(dá)量顯著高于同日齡杜長大豬，推測陸川豬肌肉具有比杜長大豬更加優(yōu)良的抗氧化性能。

關(guān)鍵詞： 陸川豬;杜長大豬;核因子NF-E2相關(guān)因子;基因克隆;生物信息學(xué)分析;抗氧化性能;實(shí)時(shí)熒光定量PCR

中圖分類號(hào)： S828.89? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2022）04-0908-10

Cloning and expression analysis of Nrf2 gene in longissimus dorsi of Luchuan pig and Duroc×Landrace×Yorkshire pig

TU Yu-ang， CAI Pei-ran， YU Jia-yi， LUO Yun-yan， JIANG Qin-yang， HUANG Yan-na*

（College of Animal Science and Technology， Guangxi University， Nanning， Guangxi? 530004， China）

Abstract：【Objective】To clarify biological characteristics of NF-E2-related factor （Nrf2） gene in Luchuan pig and Duroc×Landrace×Yorkshire（DLY）pig，and to explore the expression difference of Nrf2 gene in longissimus dorsi muscle of Luchuan pig and DLY pig， so as to lay a foundation for further study on the molecular mechanism of antioxidant properties of high-quality Luchuan pig muscle. 【Method】The coding DNA sequence（CDS）， sequence of Nrf2 gene was cloned from the total RNA of longissimus dorsi muscle of 150-day-old Luchuan pigs and the same day old DLY pigs，and the bioinformatics analysis was carried out through online softweres ExPASy ProtScale，ExPASy ProtParam and SWISS-MODEL. The expression difference of Nrf2 gene in the longissimus dorsi muscle of 150-day-old Luchuan pigs and the DLY pigs of the same age was detected by qRT-PCR and Western-blotting. 【Result】The length of the CDS of Nrf2 gene of Luchuan pig and DLY pig was 1686 bp，which was compared with the CDS sequences of Sus scrofa， DLY pig， cattle，sheep， Chimpanzee，macaque，wolf，human，domestic rat，Rattus norvegicus，ostrich，ordinary domestic chicken that published in GenBank. The similarity were， 99.7%， 99.5%， 91.2%， 90.6%， 90.5%， 90.1%， 89.5%， 86.5%， 81.9%， 81.7%， 72.0% and 70.6%，respeetively. The genetic distance between Guangxi Luchuan pig and DLY pig was the nearest，and the farthest was Canis lupus. Nrf2 protein of DLY pig and Luchuan pig was composed of 561 amino acids，and serine was the highest in the amino acid content，accounting for 12.5%，and tryptophan was the lowest，accounting for only 0.4%. In the secondary structure of Nrf2 protein，random coil accounted for 57.75%，α-helix accounted for 34.05%，extended strand accounted for 5.35%，β-turn accounted for 2.85% in DLY pig Nrf2 protein. The percentage of random coil，α-helix，extended strand and β-turn were 57.93%，33.51%，6.06% and 2.50% respectively in Luchuan pig Nrf2 protein;The relative expression of Nrf2 gene in longissimus dorsi muscle of 150-day-old Luchuan pigs was significantly higher than that of DLY pigs（P<0.05）;The expression of Nrf2 protein in the longissimus dorsi muscle of 150-day-old Luchuan pigs was extremely significantly higher than that of DLY pigs（P<0.01）. 【Conclusion】Nrf2 gene CDS seqnence of Luchuan pig and DLY pig are cloned successfully，and the expression of Nrf2 in Luchuan pig is significantly higher than that in DLY pig at the same age. It is suggested that the muscle of Luchuan pig has better antioxidant activity than that of DLY pig.

Key words： Luchuan pig; Duroc×Landrace×Yorkshire（DLY） pig; nuclear factor erythroid 2-related factor 2; gene cloning; bioinformatics analysis; oxidation resistance;real-time fluorescence quantitative PCR

Foundation items： National Natural Science Foundation of China（31760672）; Guangxi Natural Science Foundation Project（2022GXNSFAA035525）

0 引言

【研究意義】畜禽機(jī)體在遭受某種氧化反應(yīng)刺激時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生過量的親電體和活性氧自由基（ROS），抗氧化系統(tǒng)清除這些親電體和ROS時(shí)可引起機(jī)體內(nèi)氧化還原態(tài)破壞、抗氧化系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)失衡（Harrison，2002），導(dǎo)致體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平顯著升高、核苷酸和染色體氧化損傷及氨基酸和蛋白質(zhì)損傷破壞等，使機(jī)體產(chǎn)生各種組織生理性病變，胴體品質(zhì)嚴(yán)重下降（Hernández et al.，2004;Rowe et al.，2004）。面對(duì)氧化應(yīng)激，機(jī)體形成一套復(fù)雜的抗氧化防御機(jī)制，能有效控制ROS水平，防止其水平過高和在機(jī)體內(nèi)累積，其中核因子NF-E2相關(guān)因子（NF-E2-related factor 2，Nrf2）是重要的轉(zhuǎn)錄因子，具有氧化還原敏感性，可通過Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路誘導(dǎo)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)I/II/III相解毒酶和抗氧化酶等抗氧化性基因的轉(zhuǎn)錄激活，使細(xì)胞由氧化應(yīng)激狀態(tài)逐漸恢復(fù)至常規(guī)細(xì)胞狀態(tài)（竇彩霞等，2019）。細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激關(guān)鍵性通路是Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路（Sajadimajd and Khazaei et al.，2017），普遍認(rèn)為Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路是預(yù)防和治療因氧化應(yīng)激和炎癥引發(fā)疾病的關(guān)鍵（Goldstein et al.，2016）。因此，研究陸川豬Nrf2并克隆Nrf2序列信息，利用生物信息學(xué)方法分析Nrf2基因結(jié)構(gòu)，探明其在肌肉組織中的表達(dá)規(guī)律，對(duì)揭示陸川豬優(yōu)良肌肉抗氧化能力的分子機(jī)制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路的活化機(jī)制分為兩種：第一種是減弱對(duì)Nrf2的泛素化降解作用，當(dāng)氧化物和親電基團(tuán)與Keap1蛋白的IVR鏈接結(jié)構(gòu)域反應(yīng)時(shí)，273Cys和288Cys 2個(gè)半胱氨酸殘基發(fā)生突變，導(dǎo)致Nrf2泛素化和抑制作用降低，從而促使Nrf2基因活化（齊曉龍，2013;李慧和楊林，2018）;第二種是Nrf2的磷酸化作用，Nrf2在蛋白激酶途徑中發(fā)生磷酸化作用，Neh2的Ser-40磷酸化導(dǎo)致Keap1-Nrf2連接破壞，從而致使Nrf2活化（Jain and Jaiswal，2007）。Nrf2廣泛存在于機(jī)體細(xì)胞和組織內(nèi)（Manna et al.，2019），可調(diào)節(jié)畜禽抗氧化應(yīng)激和代謝功能，在腎損傷和糖尿病保護(hù)中起關(guān)鍵作用（Wu et al.，2015）;還可阻止和預(yù)防腫瘤的形成（Wang et al.，2017），缺乏Nrf2的小鼠更易患化學(xué)致癌物引發(fā)的癌癥（Xu，2006），Nrf2能阻止小鼠肺癌基因的表達(dá)（Shibata et al.，2008）;但也有研究表明癌細(xì)胞會(huì)利用Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增生和增長，從而幫助癌癥基因的激活導(dǎo)致細(xì)胞增殖，在癌癥發(fā)生過程中具有兩面性（DeNicola et al.，2011;Kim and Keum，2016）;Nrf2還可調(diào)控畜禽抗炎癥能力，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和大量的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)（Wu et al.，2012），抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)（Subedi et al.，2019）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】Nrf2基因由于在抗氧化應(yīng)激保護(hù)動(dòng)物健康中發(fā)揮重要作用而日益受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，但目前針對(duì)陸川豬與商用豬種抗氧化性能差異的研究較少，也未見關(guān)于陸川豬Nrf2基因克隆及其在肌肉組織內(nèi)表達(dá)規(guī)律的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】分別克隆陸川豬和杜長大豬Nrf2基因編碼區(qū)（CDS）序列，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blotting檢測Nrf2基因或蛋白在陸川豬和杜長大豬背最長肌中的相對(duì)表達(dá)差異，為深入研究陸川豬優(yōu)良肌肉抗氧化能力的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

選取150日齡的陸川豬和杜長大豬各6頭，取其背最長肌組織，屠宰取樣后液氮速凍，后置于冰箱 -80 ℃存儲(chǔ)，備用。SYBR? Premix Ex TaqTM II、Taq酶、總RNA抽提試劑、RT-PCR試劑盒、pMD19-T載體等購自日本TaKaRa公司;聚丙烯酰胺凝膠、無RNA酶水、裂解液、PVDF膜、5×預(yù)配電泳液、20×預(yù)配TBST等購自北京索萊寶科技有限公司;DL2000 DNA Marker購自廣州東盛生物科技有限公司;Protein Ladder購自賽默飛世爾科技公司;通用型DNA回收試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司;感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;瓊脂糖購自上海博晗生物科技有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;ECl顯色液購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;GAPDH Monoclonal、HRP Goat Anti-Mouse IgG（H+L），Nrf2 Rabbit pAb，HRP Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）購自武漢愛博泰克生物科技有限公司;2×Taq Master Mix購自江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司。主要儀器設(shè)備：電子分析天平購自上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;ChemiDoc MP全能型成像系統(tǒng)、普通PCR儀、CFX96熒光定量PCR儀、垂直電泳系統(tǒng)、96孔板等購自美國Bio-Rad公司;超微量分光光度計(jì)購自Quawell公司;超低溫冰箱購自青島海爾集團(tuán)有限公司;低溫組織研磨儀購自寧波新芝生物科技股份有限公司;數(shù)顯型恒溫水浴鍋購自江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;高速低溫離心機(jī)、移液槍購自德國艾本德股份公司;超凈工作臺(tái)購自蘇州凈化設(shè)備有限公司;恒溫鼓風(fēng)干燥箱、恒溫培養(yǎng)箱購自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;凝膠電泳自動(dòng)成像系統(tǒng)購自美國UVP公司;溫控?fù)u床、細(xì)胞培養(yǎng)箱購自賽默飛世爾科技公司;高壓滅菌鍋購自日本HIRAYAMA公司;電泳儀EC250-90、轉(zhuǎn)印電泳儀、雙穩(wěn)定型電泳儀電源購自北京六一生物科技有限公司。

1. 2 引物設(shè)計(jì)與合成

依照GenBank中野豬Nrf2基因序列（登錄號(hào)：XM_021075133.1），利用 Oligo 7設(shè)計(jì)2對(duì)克隆特異性引物和熒光定量PCR引物，參考黃艷娜（2011）的方法設(shè)計(jì)18S rRNA序列（登錄號(hào)AY_265350.1）擴(kuò)增引物（表1）。所有引物均委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 3 總RNA提取及cDNA合成

采用TRIzol法分別提取陸川豬和杜長大豬背最長肌總RNA，并進(jìn)行RNA濃度測定分析和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇濃度和純度合適的RNA樣品進(jìn)行RT-PCR。定量反轉(zhuǎn)錄體系（分為2個(gè)程序）總體積20.0 μL：第一步反應(yīng)體系（去除基因組DNA）：無RNA酶水5.0 μL，5×gRNA Eraser Buffer 2.0 μL，總RNA 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，共10.0 μL;42 ℃ 120 s，4 ℃保存。第二步反應(yīng)體系（反轉(zhuǎn)錄）：上一步反應(yīng)液10.0 μL，5×Primescript Buffer II 4.0 μL，無RNA酶水4.0 μL，Primescript RT Enzyme Mix 1.0 μL，RT Primer Mix 1.0 μL，共20.0 μL;37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。cDNA置于4 ℃保存。

1. 4 陸川豬和杜長大豬Nrf2基因PCR擴(kuò)增

對(duì)陸川豬和杜長大豬背最長肌Nrf2基因分2段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系10.0 μL：2×Taq Master Mix 5.0 μL，無RNA酶水3.0 μL，cDNA模板 1.0 μL，上、下游引物各0.5 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s，56.1 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢驗(yàn)，在成像儀上使用紫外線燈標(biāo)識(shí)目標(biāo)條帶，切取目的片段，使用膠回收試劑盒進(jìn)行凝膠回收純化。

1. 5 陸川豬和杜長大豬Nrf2基因測序

將純化產(chǎn)物與克隆載體連接，連接體系10.0 μL：Solution I 5.0 μL，擴(kuò)增純化產(chǎn)物4.0 μL，pMD19-T載體1.0 μL。取過夜的10.0 μL連接產(chǎn)物，加入30.0～50.0 μL已融化的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，冰上靜置轉(zhuǎn)化后熱休克，再將帶有克隆片段的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇和增殖，LA培養(yǎng)基上涂板培養(yǎng)，12 h后挑選形態(tài)規(guī)則的單個(gè)菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，再以挑取菌液為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證。反應(yīng)體系：2×Taq MasterMix 5.0 μL，無RNA酶水 3.5 μL，菌液0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，共10.0 μL，擴(kuò)增程序與1.3相同。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，將鑒定呈陽性的克隆菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1. 6 陸川豬和杜長大豬Nrf2基因生物信息學(xué)分析

1. 6. 1 基因序列比對(duì)分析 克隆菌液經(jīng)測序后，利用Lasergene 10拼接杜長大豬和陸川豬Nrf2基因核苷酸序列，再將陸川豬Nrf2基因CDS序列與杜長大豬和GenBank中登錄的野豬Nrf2基因（XM_003133500.6）CDS序列進(jìn)行比對(duì)和翻譯。

1. 6. 2 同源比對(duì)分析及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建 使用MegAlign檢測陸川豬和杜長大豬Nrf2基因的CDS序列，與GenBank上已公布的野豬（XM_003133500.6）、白鱀豚（XM_007451098.1）、獨(dú)角鯨（XM_00292255 16.1）、維基尼亞鹿（XM_020871000.1）、印度瘤牛（XM_019970314.1）、黃牛（XM_005202312.4）、人類（NM_006164.5）、黑猩猩（XM_009443801.3）、東非狒狒（XM_031651381.1）和狼（XM_038447161.1）的Nrf2基因CDS序列進(jìn)行同源比對(duì)分析，根據(jù)相似性構(gòu)建Nrf2基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 6. 3 Nrf2蛋白基本理化性質(zhì)及親/疏水性分析

采用ExPASy ProtScale（https：//web.expasy.org/prots-cale/）和ExPASy ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）分別預(yù)測分析陸川豬和杜長大豬Nrf2蛋白的親/疏水性和氨基酸組成、一級(jí)結(jié)構(gòu)、理論等電點(diǎn)（pI）和蛋白分子親水性的總平均值等基本信息。

1. 6. 4 Nrf2蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過NPS@的SOPMA SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD在線程序（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL在線程序（https：//swissmodel.expasy.org/）分別預(yù)測分析陸川豬和杜長大豬Nrf2蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1. 7 陸川豬和杜長大背最長肌組織中Nrf2基因表達(dá)量檢測

使用轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，選用18S rRNA為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Nrf2基因在150日齡陸川豬和杜長大豬背最長肌中的表達(dá)情況。反應(yīng)體系10.0 μL：SYBR? Premix Ex Taq TM II 5.0 μL，cDNA模板2.5 μL，無RNA酶水 2.0 μL，上、下游引物各0.25 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。采用2-ΔΔCt 法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，利用IBM SPSS Statistics 23進(jìn)行單因素分析（ANOVA），以GraphPad Prism 8作圖。

1. 8 Western blotting檢測

提取陸川豬和杜長大豬背最長肌組織蛋白，采用BCA法進(jìn)行總蛋白濃度測定，取統(tǒng)一濃度為1～2 μg/μL的蛋白樣品加入4×Loading Buffer（含二硫蘇糖醇）95～100 ℃水浴鍋煮沸5～10 min，然后上樣，通過10%聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電行進(jìn)行分離，電泳后濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上，加入5%脫脂奶粉，置于37 ℃、200 r/min恒溫?fù)u床封閉1.5 h，1×TBST搖床振蕩洗滌3次，每次10 min;加入一抗4 ℃冰箱孵育10～12 h（Nrf2一抗稀釋比為1∶1000，磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）一抗稀釋比為1∶10000），1×TBST搖床振蕩洗滌3次，每次10 min;加入二抗恒溫?fù)u床孵育1 h（Nrf2二抗稀釋比例為1∶4000，GAPDH二抗稀釋比例為1∶2000），1×TBST搖床振蕩洗滌3次，每次10 min。ECl試劑顯色，GAPDH蛋白為內(nèi)參，在成像系統(tǒng)曝光成像，最后通過Image J和Graphpad Prism 8對(duì)Western blotting條帶進(jìn)行灰度分析和蛋白相對(duì)半定量分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 陸川豬和杜長大豬Nrf2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果在1500和1000 bp附近出現(xiàn)清晰的目的條帶，與預(yù)測的2條克隆條帶的1473和1146 bp相符合（圖1）。

2. 2 陸川豬和杜長大豬Nrf2基因CDS序列克隆及測序結(jié)果

測序結(jié)果通過DNAMAN 9.0拼接，拼接結(jié)果通過Lasergene 10生物軟件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示測序所得的陸川豬和杜長大豬Nrf2基因CDS序列長度完全一致，CDS序列全長1686 bp，與GenBank中登錄的野豬Nrf2基因（XM_003133500.6）相似性為99.7%和99.8%，表明克隆成功。CDS序列比對(duì)結(jié)果（圖2）和氨基酸突變位點(diǎn)（圖3）顯示，陸川豬Nrf2基因CDS與杜長大豬和野豬Nrf2基因CDS序列相比，存在第424位點(diǎn)T→C，導(dǎo)致色氨酸（W）突變?yōu)榫彼幔≧）;第739位點(diǎn)C→T，導(dǎo)致脯氨酸（P）突變?yōu)榻z氨酸（S）;第1023位點(diǎn)A→G，為同義突變;第1309位點(diǎn)T→G，導(dǎo)致苯丙氨酸（F）突變?yōu)槔i氨酸（V）;第1469位點(diǎn)A→G，導(dǎo)致天冬氨酸（D）突變?yōu)楦拾彼幔℅），上述5個(gè)位點(diǎn)的堿基C、T、G、G、G均是陸川豬所特有。與杜長大豬相比，陸川豬還存在第1162位點(diǎn)G→A，導(dǎo)致纈氨酸（V）突變?yōu)楫惲涟彼幔↖）;第1190位點(diǎn)C→T，導(dǎo)致絲氨酸（S）突變?yōu)楸奖彼幔‵）;第1188位點(diǎn)G→A、第1330位點(diǎn)A→G均為同義突變。

2. 3 陸川豬和杜長大豬Nrf2基因同源比對(duì)分析及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建

由圖4可知，陸川豬Nrf2基因CDS序列與GenBank公布野豬（XM_003133500.6）、杜長大豬、牛（NM_001011678.2）、綿羊（XM_012132956.4）、黑猩猩（XM_009443801.3）、獼猴（NM_001257607.1）、狼（XM_038447161.1）、人類（NM_001313903.2）、家鼠（NM_010902.5）、大白鼠（NM_001399173.1）、鴕鳥（XM_009672697.1）和普通家雞（XM_046921129.1）的Nrf2基因CDS序列相似性分別為99.7%、99.5%、91.2%、90.6%、90.5%、90.1%、89.5%、86.5%、81.9%、81.7%、72.0%和70.6%。圖5顯示，陸川豬、杜長大豬和野豬聚為同一支，陸川豬與杜長大豬的遺傳距離最近，與狼的遺傳距離最遠(yuǎn)。

2. 4 陸川豬和杜長大豬Nrf2蛋白基本理化性質(zhì)

經(jīng)在線軟件系統(tǒng)分析可知，杜長大豬Nrf2蛋白分子式為C2741H4319N747O920S14，分子量為62906.74 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為4.75。其氨基酸組成比例（表2）顯示，絲氨酸含量最高，占比12.5%;色氨酸含量最低，僅占0.4%。預(yù)測所得的蛋白分子親水性總平均值（GRAVY）為-0.757。陸川豬Nrf2蛋白分子式為C2739H4316N746O920S14，分子量為62865.69 kD，（pI）為4.73。其氨基酸組成比例（表2）顯示，絲氨酸含量最高，占比12.5%;色氨酸含量最低，僅占0.4%。預(yù)測所得的GRAVY為-0.740。

2. 5 陸川豬和杜長大豬Nrf2蛋白親/疏水性分析預(yù)測

使用ExPASy ProtScale在線分析系統(tǒng)進(jìn)行杜長大豬和陸川豬Nrf2蛋白親/疏水性預(yù)測，由圖6可知，杜長大豬和陸川豬Nrf2蛋白在0以下的氨基酸區(qū)域面積明顯多于在0以上的區(qū)域面積，存在大片親水性高的區(qū)域，即Nrf2蛋白中親水性氨基酸的總分值高于疏水性氨基酸，因此陸川豬和杜長大豬Nrf2蛋白呈較強(qiáng)的親水性，與預(yù)測的GRAVY值為-0.740和 -0.757相符合。

2. 6 陸川豬和杜長大豬Nrf2蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

經(jīng)在線蛋白分析系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)杜長大豬Nrf2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中，無規(guī)則卷曲占57.75%，α-螺旋占34.05%，延伸鏈占5.35%，β-轉(zhuǎn)角占2.85%（圖7）;陸川豬Nrf2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中，無規(guī)則卷曲占57.93%，α-螺旋占33.51%，延伸鏈占6.06%，β-轉(zhuǎn)角占2.50%（圖8）。

利用蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析平臺(tái)SWISS-MODEL在線分析，通過分析和構(gòu)建模型預(yù)測得到陸川豬和杜長大豬Nrf2蛋白可能存在的三級(jí)結(jié)構(gòu)，預(yù)測結(jié)果如圖9所示。

2. 7 陸川豬與杜長大豬背最長肌中Nrf2基因表達(dá)差異

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果（圖10）顯示，150日齡陸川豬背最長肌中Nrf2基因的相對(duì)表達(dá)量高于同日齡的杜長大豬，且差異達(dá)顯著水平（P<0.05）。

2. 8 陸川豬與杜長大豬背最長肌中Nrf2蛋白表達(dá)差異

由圖11可知，150日齡陸川豬背最長肌中Nrf2蛋白表達(dá)量高于同日齡的杜長大豬，且差異達(dá)極顯著水平（P<0.01）。

3 討論

Nrf2又名NFE2L2，屬于CNC（Cap‘n’collar）家族轉(zhuǎn)錄因子中的一種，在機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)Nrf2主要通過Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路誘導(dǎo)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)II型解毒酶和抗氧化酶等抗氧化性基因的表達(dá)，使機(jī)體從氧化應(yīng)激狀態(tài)恢復(fù)到正常的生理狀態(tài)（樊卓，2018）。因此，Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路被認(rèn)為是預(yù)防和治療因氧化應(yīng)激和炎癥引起疾病的關(guān)鍵。目前，由于Nrf2基因在抗氧化應(yīng)激保護(hù)動(dòng)物健康中發(fā)揮重要作用而日益受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，經(jīng)過試驗(yàn)已分別獲得人類、鼠、雞、果蠅和草魚的Nrf2基因cDNA全長（Moi et al.，1994;Chui et al.，1995;Itoh et al.，1995;于雪，2015;馮燕等，2018）。迄今為止有關(guān)豬Nrf2基因的研究還較少，僅有劉宗立（2018）、劉宗立等（2019）、徐秋良等（2020）的研究分別得到大蒲蓮豬和杜長大豬Nrf2基因完整的cDNA序列和杜長大豬在肝臟上Nrf2基因全編碼序列。本研究成功克隆陸川豬和杜長大豬Nrf2基因CDS序列，同時(shí)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)CDS序列與野豬等哺乳動(dòng)物的Nrf2基因CDS序列相似性高于99%，表明本研究所克隆的陸川豬Nrf2基因cDNA序列正確，為陸川豬Nrf2基因的研究打下了基礎(chǔ)。

關(guān)于不同物種Nrf2基因表達(dá)的規(guī)律也有相關(guān)研究報(bào)道。閆文相（2015）研究表明，與正常人類腦組織為標(biāo)本的對(duì)照組相比，膠質(zhì)瘤組織中Nrf2基因mRNA和蛋白的表達(dá)量明顯增高，且隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的增加，表達(dá)量增高越明顯;張素響（2013）利用H2O2處理SH-SY5Y細(xì)胞，損傷前使用不同濃度的人促紅細(xì)胞生成素（rH-Epo）預(yù)處理24 h，結(jié)果表明200 μmol/L H2O2處理使Nrf2相對(duì)表達(dá)量下降，但rH-Epo預(yù)處理24 h后，Nrf2基因相對(duì)表達(dá)量增加;盤文靜等（2016）研究表明口服高糖（3 g/kg）可使團(tuán)頭魴幼魚Nrf2基因相對(duì)表達(dá)量極顯著上調(diào)。以上研究結(jié)果間接證明了Nrf2的抗氧化機(jī)制。但關(guān)于Nrf2基因在豬組織內(nèi)表達(dá)量的研究較少，徐秋良等（2020）研究表明，在35日齡仔豬中，背最長肌組織Nrf2基因的相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于其他各組，表明Nrf2在背最長肌中發(fā)揮重要作用;劉宗立等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，相同體重下大蒲蓮豬腎臟、肌肉、肺臟和心臟組織中Nrf2基因的mRNA表達(dá)量顯著高于長白豬，相同日齡下大蒲蓮豬肌肉和脾臟組織中Nrf2基因的mRNA表達(dá)量顯著高于長白豬。本研究發(fā)現(xiàn)，陸川豬背最長肌中Nrf2基因表達(dá)量顯著高于同日齡杜長大豬，與上述研究中Nrf2基因在地方豬肌肉組織中的表達(dá)規(guī)律一致，證實(shí)了陸川豬肌肉潛在的抗氧化性能和抗氧化機(jī)制，有助于下一步深入探究陸川豬優(yōu)質(zhì)肌肉抗氧化性能的分子機(jī)制。但本研究僅對(duì)陸川豬Nrf2基因進(jìn)行克隆和基礎(chǔ)的生物信息學(xué)預(yù)測分析，同時(shí)揭示其在肌肉組織中的表達(dá)規(guī)律，而針對(duì)Nrf2基因在陸川豬背最長肌中的抗氧化作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

本研究分別成功克隆陸川豬和杜長大豬Nrf2基因CDS序列，且陸川豬背最長肌中Nrf2基因mRNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)量均高于同日齡杜長大豬背最長肌中的表達(dá)量，推測陸川豬肌肉具有比杜長大豬更加優(yōu)良的抗氧化性能。

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收稿日期：2022-01-09

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31760672）;廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2022GXNSFAA035525）

通訊作者：黃艷娜（1980-），https：//orcid.org/0000-0001-9376-3311，博士，副教授，主要從事動(dòng)物營養(yǎng)與肉質(zhì)調(diào)控研究工作，E-mail：huangyn@gxu.edu.cn

第一作者：涂羽昂（1999-），https：//orcid.org/0000-0003-4984-7141，研究方向?yàn)閯?dòng)物營養(yǎng)與肉質(zhì)調(diào)控，E-mail：2650004006@qq.com