羅真真，田海英，葛建華，紀(jì) 元

慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染所致的慢性肝損傷性疾病。HCV感染慢性化的風(fēng)險(xiǎn)高于其他類型的嗜肝病毒感染[1]。目前認(rèn)為，CHC患者肝纖維化進(jìn)展與HCV基因分型有關(guān)，而基因3型HCV對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響較大，且與肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[2，3]。N-寡糖是結(jié)合糖蛋白的天冬酰胺側(cè)鏈氨基上的分支寡糖鏈，主要由肝臟和B淋巴細(xì)胞合成，可反映肝臟細(xì)胞的生理改變[4]?？偰懼?total bile acid，TBA)是一項(xiàng)靈敏的肝功能檢測(cè)指標(biāo)，在肝細(xì)胞出現(xiàn)輕微損傷時(shí)就表現(xiàn)為明顯的升高趨勢(shì)。有研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者血清TBA異常率很高[5]。肝臟硬度檢測(cè)(liver stiffness measurement，LSM)是使用瞬時(shí)彈性成像技術(shù)檢測(cè)的肝臟硬度變化的物理參數(shù)，具有無(wú)創(chuàng)、高效的特點(diǎn)。慢性乙型肝炎患者LSM隨著肝纖維化程度的增加而升高[6]。本研究檢測(cè)了CHC患者血清N-寡糖和TBA水平的變化，以探討應(yīng)用其判斷肝纖維化的臨床價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2018年6月～2021年6月我院收治的CHC患者84例，男51例，女33例；年齡為43～72歲，平均年齡為(58.7±5.6)歲。符合《丙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[7]的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并乙型肝炎病毒感染；②合并酒精性肝病、自身免疫性肝??；③合并惡性腫瘤。另選擇健康體檢者51例，男29例，女22例；年齡為40～69歲，平均年齡為(57.9±6.1)歲。兩組人群性別和年齡比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

1.2 血清TBA水平檢測(cè) 使用美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司生產(chǎn)的5831型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

1.3 血清N-寡糖水平檢測(cè) 取血清3 μL，加入10 mmol/L NH4HCO3緩沖液2μL和去離子水3μL，加入RCR反應(yīng)板，95℃下加熱5 min，放置于4℃環(huán)境，加入PNGase F(2.2 U/μL)3 μL，于37℃下孵育3 h，4℃水浴后加入去離子水100μL，終止反應(yīng)，記為D板。從D板吸取10μL溶液，加入PCR反應(yīng)板，在60℃下烘干約90 min，直至完全干燥。加入標(biāo)記溶液3 μL，在90℃下反應(yīng)2 h，加入去離子水終止反應(yīng)。取樣本2μL，加入唾液酸酶0.2 μL，震蕩混勻后于42℃下孵育4 h，加去離子水終止反應(yīng)。取10μL溶液，用ABI3500DX測(cè)序儀進(jìn)行N-聚糖圖譜分析，經(jīng)GeneMapper軟件處理，根據(jù)量化后的峰值數(shù)據(jù)計(jì)算N-寡糖相對(duì)水平。

1.4 LSM測(cè)定 使用法國(guó)Echosens 提供的Fibroscan-502 Touch儀器檢測(cè)，于右腋中線第7、8或8、9肋間檢測(cè)，連續(xù)有效檢測(cè)10次，最終成功率大于60%，取均值。

1.5 肝活檢 常規(guī)行肝活檢，參照METAVIR評(píng)分系統(tǒng)[8]將肝纖維化分為S1、S2、S3和S4期。將肝纖維化程度分為進(jìn)展期纖維化(S3～S4)和輕度纖維化(S1～S2)。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清N-寡糖、TBA水平和LSM比較 CHC組血清N-寡糖、TBA水平和LSM值顯著大于對(duì)照組(P<0.05，表1)。

表1 兩組血清N-寡糖、TBA水平和比較

2.2 不同纖維化分期的CHC患者血清N-寡糖、TBA水平和LSM值比較 隨著肝纖維化程度的加重，CHC患者血清N-寡糖、TBA水平和LSM值逐漸顯著升高或增大(P<0.05，表2)。

表2 不同纖維化分期患者血清N-寡糖、TBA水平和LSM值比較

2.3 血清N-寡糖、TBA水平和LSM值評(píng)估進(jìn)展期肝纖維化的價(jià)值情況 進(jìn)展期纖維化患者血清N-寡糖和TBA水平顯著高于輕度纖維化患者，LSM值顯著大于輕度纖維化患者(P<0.05)。繪制血清N-寡糖、TBA水平和LSM值診斷進(jìn)展期肝纖維化的ROC曲線，結(jié)果顯示，聯(lián)合檢測(cè)評(píng)估CHC患者進(jìn)展期肝纖維化的AUC大于各指標(biāo)單項(xiàng)檢測(cè)(P<0.05，表3、圖1)。

表3 血清指標(biāo)和LSM評(píng)估進(jìn)展期肝纖維化的效能(%)情況

圖1 血清N-寡糖、TBA水平和LSM值評(píng)估進(jìn)展期肝纖維化的ROC曲線分析

3 討論

N-寡糖是一種新型肝臟疾病血清標(biāo)志物，主要由肝臟和B淋巴細(xì)胞合成，可反映肝臟或B淋巴細(xì)胞的生理和病理學(xué)改變。健康人體血液糖蛋白上連接的寡糖結(jié)構(gòu)是相對(duì)穩(wěn)定的，其相對(duì)含量也基本固定。當(dāng)肝臟功能出現(xiàn)異常時(shí)，肝臟的糖蛋白合成代謝也會(huì)有所改變，使寡糖的結(jié)構(gòu)和含量發(fā)生變化[9,10]。膽汁酸的前體為膽固醇，屬于一種有機(jī)酸，由多種成份構(gòu)成，其合成和分解代謝主要在肝臟中完成。血清TBA的合成和分泌由肝細(xì)胞完成，是組成膽汁的主要成分，與脂類的消化、吸收密切相關(guān)[11，12]。當(dāng)發(fā)生肝纖維化時(shí)，正常肝細(xì)胞遭到破壞，功能性肝細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始下降，從而使對(duì)TBA的汲取量降低[13]。同時(shí)，門(mén)靜脈回流而來(lái)的TBA未得到充分的吸收。因?yàn)閭?cè)支循環(huán)的出現(xiàn)使門(mén)靜脈中部分血液進(jìn)入體循環(huán)，導(dǎo)致血清TBA水平升高。本研究發(fā)現(xiàn)，CHC患者血清N-寡糖和TBA水平升高，LSM值增大，與相關(guān)研究結(jié)果相符。在肝纖維化形成過(guò)程中，肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，導(dǎo)致肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉淀而引發(fā)肝臟硬度增大[14]。本研究結(jié)果顯示，進(jìn)展期肝纖維化患者血清N-寡糖和TBA水平及LSM值較輕度肝纖維化患者升高，提示肝纖維化越嚴(yán)重，這些指標(biāo)的水平就越高。

肝組織學(xué)檢查依然是臨床上診斷肝病患者肝纖維化的金標(biāo)準(zhǔn)，但其具有創(chuàng)傷性，可能存在一定的不良后果，可重復(fù)性差[15]。血清肝纖維化標(biāo)記物檢測(cè)是一種無(wú)創(chuàng)性檢查方法，雖具有無(wú)創(chuàng)性、操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，但易受其他條件的影響，準(zhǔn)確性相對(duì)偏低[16]。相關(guān)研究指出，在血清學(xué)檢查的基礎(chǔ)上給予影像學(xué)聯(lián)合檢查，或可起到提高診斷準(zhǔn)確度的作用[17，18]。本研究對(duì)不同肝纖維化患者血清N-寡糖、TBA水平及LSM值進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)隨著肝纖維化程度的加重，CHC患者血清N-寡糖、TBA水平逐漸升高，LSM值逐漸增大，表明血清N-寡糖、TBA水平及LSM值與肝纖維化程度相關(guān)，主要是因?yàn)檠錘-寡糖水平越高，表示肝臟受損越嚴(yán)重。TBA是肝臟分泌產(chǎn)物，其進(jìn)入腸道后大部分被重吸收，從門(mén)靜脈再次進(jìn)入肝臟，而肝纖維化患者因肝細(xì)胞受損嚴(yán)重，導(dǎo)致其攝取TBA的功能下降，且側(cè)支循環(huán)的存在使得富含TBA的血液繞過(guò)肝臟進(jìn)入體循環(huán)，最終導(dǎo)致血清TBA水平增高[19，20]，提示或可通過(guò)檢測(cè)血清指標(biāo)及LSM值來(lái)評(píng)估肝纖維化程度。本研究發(fā)現(xiàn)，血清N-寡糖、TBA水平及LSM值聯(lián)合檢測(cè)評(píng)估CHC患者進(jìn)展期肝纖維化的AUC為0.918，顯著高于各單項(xiàng)檢測(cè)，提示聯(lián)合檢測(cè)對(duì)CHC患者肝纖維化程度具有評(píng)估價(jià)值。本研究經(jīng)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，確立血清N-寡糖和TBA水平及LSM的診斷截?cái)帱c(diǎn)，評(píng)估CHC患者肝纖維化程度，具有可操作性，臨床應(yīng)用價(jià)值值得進(jìn)一步探討。肝纖維化是一個(gè)動(dòng)態(tài)的發(fā)展過(guò)程，CHC患者肝功能受損程度隨纖維化程度的加重而加重，故本研究認(rèn)為，用于反映肝臟受損程度的血清N-寡糖和TBA水平或也同樣可用于評(píng)估肝纖維化程度。

綜上所述，CHC患者血清N-寡糖和TBA水平升高，LSM值增加，應(yīng)用血清N-寡糖和TBA水平聯(lián)合LSM評(píng)估CHC患者肝纖維化程度具有臨床價(jià)值，值得進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。