王凱 李偉偉 王佳

食管癌為臨床常見消化道腫瘤，發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高趨勢(shì)，其惡性程度高，死亡率高，食管癌的治療手段主要為手術(shù)和放化療，但患者預(yù)后不佳，5年生存率較低，因此，研究食管癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制對(duì)其臨床治療具有重要意義[1,2]。白頭翁皂苷是從白頭翁中提取的具有生物活性的天然產(chǎn)物，具有抗炎、抗腫瘤的作用，白頭翁皂苷有多種有效單體成分，其中白頭翁皂苷D(pulsatilla saponin D)具有抗多種腫瘤的作用[3]。王冰等[4]研究表明，白頭翁皂苷D可通過(guò)調(diào)控Wnt信號(hào)通路而抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖。腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)是細(xì)胞能量代謝的調(diào)節(jié)器，AMPK的激活可抑制人食管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。環(huán)氧合酶-2(cyclo-oxygenase-2，COX-2)作為一種誘導(dǎo)酶，在食管癌等多種腫瘤組織中表達(dá)水平升高，具有促癌的作用[6]。研究顯示，吲哚類化合物GY3可激活A(yù)MPK并抑制COX-2的表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡[7]。因此，本研究觀察白頭翁皂苷D對(duì)EC9706細(xì)胞凋亡及AMPK/COX-2通路的影響，初步探討白頭翁皂苷D對(duì)食管癌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 白頭翁皂苷D(純度≥98%)購(gòu)自南京春秋生物工程有限公司，人食管癌細(xì)胞EC9706購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，AMPK抑制劑Compound C購(gòu)自德國(guó)Merck公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)與DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，胰蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑盒購(gòu)自Sigma公司；異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)素Ⅴ/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人Bax、Bcl-2、p53、COX-2單克隆抗體及羊抗兔IgG單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；兔抗人p-AMPKα、p-ACC多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；ELx800型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek公司。

1.2 方法

1.2.1 EC9706細(xì)胞培養(yǎng)與處理:EC9706細(xì)胞復(fù)蘇后，將細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔48 h換液傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期EC9706細(xì)胞，使用濃度為5、10、20、40、80 μmol/L白頭翁皂苷D處理細(xì)胞，對(duì)照組加入等體積的PBS緩沖液，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加10 μl濃度為5 mg/ml的MTT溶液，37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入DMSO溶液，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490 nm處檢測(cè)各孔吸光度(OD)值，繪制生長(zhǎng)曲線，計(jì)算白頭翁皂苷D的半數(shù)抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)。

1.2.2 分組與干預(yù):將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC9706細(xì)胞分為5組，分別為對(duì)照組(不做任何處理)，白頭翁皂苷D(PSD)低、中、高劑量組，PSD高劑量+AMPK抑制劑(Compound C)組，PSD白頭翁皂苷D低、中、高劑量組分別加入含終濃度10、20、40 μmol/L白頭翁皂苷D的DMEM培養(yǎng)液，PSD高劑量+Compound C組使用40 μmol/L白頭翁皂苷D與10 μmol/L Compound C共同處理細(xì)胞，各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn):取各組處理的EC9706細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，以每孔1×103個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，于37℃條件下培養(yǎng)14 d，PBS洗滌后，使用4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，顯微鏡觀察細(xì)胞克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:取各組EC9706細(xì)胞，胰酶消化后，使用結(jié)合緩沖液binding buffer調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，分別加入5 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI溶液混合均勻，室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)EC9706細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)Bax、Bcl-2、p53、p-AMPKα、p-ACC、COX-2蛋白表達(dá)：各組處理的EC9706細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，加入100 μl的RIPA裂解液，裂解30 min后取上清，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，取20 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%的BSA封閉1 h，分別加入稀釋過(guò)的兔抗人Bax(1∶2 000)、Bcl-2(1∶2 000)、p53(1∶2 000)、p-AMPKα(1∶1 000)、p-ACC(1∶800)、COX-2(1∶2 000)單克隆抗體，室溫孵育2 h，再加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶1 000稀釋)，室溫孵育1 h，ECL試劑顯色，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，SigmaScan Pro 5軟件分析各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 白頭翁皂苷D對(duì)EC9706細(xì)胞活性的影響 使用濃度為5、10、20、40、80 μmol/L白頭翁皂苷D分別處理EC9706細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，細(xì)胞存活率逐漸降低。經(jīng)計(jì)算，白頭翁皂苷D處理EC9706細(xì)胞48 h時(shí)IC50約為20 μmol/L，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇10、20、40 μmol/L的濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)用藥劑量。見圖1，表1。

圖1 EC9706細(xì)胞增殖曲線

表1 不同濃度白頭翁皂苷D處理后EC9706細(xì)胞活性

2.2 白頭翁皂苷D對(duì)EC9706細(xì)胞克隆形成能力的影響 與對(duì)照組比較，PSD低、中、高劑量組EC9706細(xì)胞克隆形成率顯著降低，并呈濃度依賴性(P<0.05)；與PSD高劑量組(85.47±4.25)%比較，PSD高劑量+Compound C組的細(xì)胞克隆形成率(113.35±3.94)%顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2，圖2。

表2 白頭翁皂苷D對(duì)EC9706細(xì)胞克隆形成率的影響

對(duì)照組 PSD低劑量組 PSD中劑量組 PSD高劑量組 PSD高劑量+Compound C組

2.3 白頭翁皂苷D對(duì)EC9706細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較，PSD低、中、高劑量組EC9706細(xì)胞凋亡率顯著升高，并呈濃度依賴性(P<0.05)；與PSD高劑量組比較，PSD高劑量+Compound C組細(xì)胞凋亡率顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3，表3。

對(duì)照組 PSD低劑量組 PSD中劑量組 PSD高劑量組 PSD高劑量+Compound C組

表3 白頭翁皂苷D對(duì)EC9706細(xì)胞凋亡的影響

2.4 白頭翁皂苷D對(duì)EC9706細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，PSD低、中、高劑量組EC9706細(xì)胞Bax、p53蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，并呈濃度依賴性(P<0.05)；與PSD高劑量組比較，PSD高劑量+Compound C組細(xì)胞Bax、p53蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖4，表4。

圖4 5組EC9706細(xì)胞Bax、Bcl-2、p53蛋白表達(dá);A 對(duì)照組；B PSD低劑量組；C PSD中劑量組；D PSD高劑量組；E PSD高劑量+Compound C組

表4 白頭翁皂苷D對(duì)EC9706細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5 白頭翁皂苷D對(duì)EC9706細(xì)胞AMPK/COX-2通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，與PSD低、中、高劑量組p-AMPKα、p-ACC表達(dá)水平顯著升高，COX-2蛋白表達(dá)顯著降低，并呈濃度依賴性(P<0.05)；與PSD高劑量組相比，PSD高劑量+Compound C組p-AMPKα、p-ACC蛋白表達(dá)水平顯著降低，COX-2蛋白表達(dá)顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5，圖5。

表5 白頭翁皂苷D對(duì)EC9706細(xì)胞AMPK/COX-2通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖5 5組EC9706細(xì)胞p-AMPKα、p-ACC、COX-2蛋白表達(dá)；A 對(duì)照組；B PSD低劑量組；C PSD中劑量組；D PSD高劑量組；E PSD高劑量+Compound C組

3 討論

白頭翁具有清熱解毒、涼血止痢等功效，其提取物白頭翁皂苷有A、B4、D、E等多種單體成分，具有抗炎、舒張血管、抗腫瘤等多種藥理作用，在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分化與凋亡、抗血管生成活性、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥等方面發(fā)揮重要作用，對(duì)肝癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤具有體外抑制作用[8-10]。Zhu等[11]研究表明，白頭翁皂苷E通過(guò)負(fù)調(diào)控Akt/FASN信號(hào)通路，抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移、侵襲和凋亡。鄒曉靜等[12]研究表明，白頭翁皂苷A通過(guò)調(diào)控miR-24-3p/環(huán)指蛋白2抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)細(xì)胞的放射敏感性。

本研究結(jié)果顯示，濃度為5、10、20、40、80 μmol/L白頭翁皂苷D能顯著抑制EC9706細(xì)胞活性，處理48 h 時(shí)IC50約為20μmol/L，故選擇10、20、40 μmol/L的濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用不同濃度白頭翁皂苷D處理EC9706細(xì)胞后，EC9706細(xì)胞克隆形成率、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，EC9706細(xì)胞凋亡及Bax、p53蛋白表達(dá)水平顯著升高，且呈藥物濃度依賴性，表明白頭翁皂苷D可顯著抑制EC9706細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，然而其機(jī)制尚不清楚。

AMPK是調(diào)節(jié)能量代謝的酶，可調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝與腫瘤進(jìn)展，AMPK可以有效地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)與遷移[13]。多項(xiàng)研究顯示，AMPK與食管癌細(xì)胞的凋亡有關(guān)，激活A(yù)MPK可誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞的凋亡[14]。另有研究顯示，蟲草素通過(guò)誘導(dǎo)AMPK的激活和抑制AKT信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)食管癌細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性[15]。COX-2在食管癌等多種腫瘤中高表達(dá)，具有抗腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，可通過(guò)AKT信號(hào)通路依賴的方式促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[16,17]。AMPK的激活可抑制COX-2的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，研究表明，熊果酸可通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK/STAT-3/COX-2信號(hào)通路抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移與侵襲[18]。

本研究使用白頭翁皂苷D處理EC9706細(xì)胞后，細(xì)胞中p-AMPKα、p-ACC蛋白表達(dá)水平顯著升高，COX-2蛋白表達(dá)顯著降低，并呈濃度依賴性，提示白頭翁皂苷D可能激活A(yù)MPK通路，而抑制COX-2的表達(dá)。在白頭翁皂苷D處理基礎(chǔ)上加入AMPK抑制劑Compound C后，細(xì)胞存活率、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率、Bax、p53蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明抑制AMPK通路可部分逆轉(zhuǎn)白頭翁皂苷D對(duì)EC9706細(xì)胞的增殖抑制作用和凋亡促進(jìn)作用，進(jìn)一步證實(shí)白頭翁皂苷D具有激活A(yù)MPK通路的作用。因此推測(cè)白頭翁皂苷D可通過(guò)激活A(yù)MPK通路，抑制COX-2表達(dá)進(jìn)而抑制EC9706細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，白頭翁皂苷D抑制EC9706細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，可能與激活A(yù)MPK通路，抑制COX-2表達(dá)有關(guān)。但由于細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制涉及通路復(fù)雜，其具體作用機(jī)制仍需做進(jìn)一步研究。