樊帥帥 宋磊軍 藺 聰 劉 揚(yáng)

新生兒缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischaemic brain damage,HIBD）是臨床常見病，預(yù)后較差。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄子1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，lncRNA-MALAT1）下調(diào)明顯促進(jìn)小鼠缺血性腦卒中后血管新生[1]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF）及其受體原肌球蛋白相關(guān)激酶B（tropomyosin-related kinase B，TrkB）信號(hào)通路與神經(jīng)細(xì)胞生長、凋亡密切相關(guān)，且該通路已被證實(shí)參與HIBD的調(diào)控[2]。本研究抑制lncRNAMALAT1表達(dá)新生大鼠HIBD模型的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組SPF級(jí)7 d齡SD大鼠40只（雌雄各半，體質(zhì)量在12～16 g），購自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)SCXK（豫）20180001，倫理批號(hào)IACUC20190525001]。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、lncRNA對(duì)照組、silncMALAT1組，每組10只。

1.2 模型制作 以Rice-Vannucci法建立新生大鼠HIBD模型[3]。吸入2%七氟醚維持麻醉，永久結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈（假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎），蘇醒后繼續(xù)喂養(yǎng)2 h，置于有機(jī)玻璃缺氧箱，持續(xù)輸入含8%O2、92%N2的混合氣體，缺氧2 h，觀察大鼠行為，出現(xiàn)夾尾、尖叫、自發(fā)左轉(zhuǎn)圈，則建模成功。模型組造模失敗2只，lncRNA組失敗2只，silncMALAT1組失敗1只，最終35只大鼠納入研究：假手術(shù)組10只，模型組8只，lncRNA對(duì)照組8只，silncMALAT1組9只。

1.3 給藥方法 建模成功后2 h，2%七氟醚麻醉，大鼠腦立體定位儀標(biāo)記左側(cè)側(cè)腦室[4]。lncRNA對(duì)照組、silncMALAT1組緩慢推注空載體重組腺病毒、silnc-MALAT1各5μl（病毒滴度為2.5 ×1013pfu/L，上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供）。假手術(shù)組、模型組推注5μl生理鹽水。停針1 min后緩慢退針，骨臘封閉。

1.4 Morris水迷宮試驗(yàn)評(píng)估空間學(xué)習(xí)和記憶能力[5]造模后7 d進(jìn)行1次適應(yīng)性訓(xùn)練，造模后8～11 d進(jìn)行定位巡航試驗(yàn)，記錄90 s內(nèi)登陸安全平臺(tái)的時(shí)間即為逃避潛伏期，若90 s內(nèi)未找到則引導(dǎo)至安全平臺(tái)，停留30 s，記錄為90 s。造模后12 d撤去安全平臺(tái)，記錄90 s內(nèi)的游泳軌跡，分析目標(biāo)象限停留時(shí)間及穿越目標(biāo)象限內(nèi)安全平臺(tái)的次數(shù)。

1.5 TUNEL染色檢測(cè)海馬神經(jīng)元凋亡情況Morris水迷宮測(cè)試次日處死大鼠，迅速分離海馬組織，4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋，制作4μm冠狀位切片。按照TUNEL試劑盒（美國Roche公司）說明書操作，DAB顯色，蘇木精核染，封片，顯微鏡下觀察細(xì)胞核染棕黃色或黃色顆粒則為凋亡細(xì)胞，記錄每平方毫米凋亡細(xì)胞數(shù)。見圖1。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)mRNA的表達(dá) 取海馬組織70 mg，采用Trizol試劑提取組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再采用SYBR Green I實(shí)時(shí)PCR試劑盒（上海羽朵生物科技有限公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。以β-actin為內(nèi)參，以2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.7 免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá) 取海馬組織50 mg，組織裂解液冰上裂解30 min，4℃預(yù)冷，16 099.2 g離心15 min，取上清液測(cè)定總蛋白濃度。取10μg待測(cè)蛋白和40μg上樣緩沖液混勻，置于沸水中10 min，16 099.2 g心10 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、兔抗大鼠BDNF、TrkB單抗一抗（美國Abcam公司）、HRP標(biāo)記的二抗孵育（美國Abcam公司），顯影、曝光，分析并計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參β-actin灰度值比值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 軟件分析；計(jì)量資料均以x±s表示，采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA-MALAT1對(duì)HIBD大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能的影響Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組、lncRNA對(duì)照組目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)均明顯減少（P＜0.05 ），模型組和lncRNA對(duì)照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05 ）。與lncRNA對(duì)照組相比，silncMALAT1組目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)均明顯增加（P＜0.05 ）。見表1。

表1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)分析下調(diào)lncRNA-MALAT1表達(dá)對(duì)新生大鼠HIBD后學(xué)習(xí)和記憶功能的影響

圖1 TUNEL染色分析新生大鼠缺氧缺血腦損傷后海馬神經(jīng)元凋亡情況

表2 下調(diào)lncRNA-MALAT1表達(dá)對(duì)新生大鼠HIBD后海馬組織mRNA表達(dá)量的影響

圖2 下調(diào)lncRNA-MALAT1表達(dá)對(duì)新生大鼠HIBD后海馬組織蛋白表達(dá)量的影響

2.2 lncRNA-MALAT1對(duì)HIBD大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響 與假手術(shù)組[（24.20 ±2.31 ）個(gè)/mm2]相比，模型組[（146.00 ±12.14 ）個(gè)/mm2]、lncRNA對(duì)照組[（143.60 ±12.54 ）個(gè)/mm2]海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)量明顯增加（P＜0.001 ），模型組和lncRNA對(duì)照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05 ）。與lncRNA對(duì)照組相比，silncMALAT1組[（71.40 ±8.06 ）個(gè)/mm2]海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)量明顯減少（P＜0.05 ）。

2.3 lncRNA-MALAT1對(duì)HIBD大鼠海馬BDNF/TrkB信號(hào)通路的影響 與假手術(shù)組相比，模型組、lncRNA對(duì)照組BDNF、TrkB、ERK1/2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯增高（P＜0.05 ），模型組和lncRNA對(duì)照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05 ）。與lncRNA對(duì)照組相比，silncMALAT1組BDNF、TrkB、ERK1/2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05 ）。見表2、圖2。

3 討論

HIBD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。研究顯示，HIBD后神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞最先受到損害，累及神經(jīng)元軸突及微血管功能系統(tǒng)，進(jìn)一步損害神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)功能。應(yīng)用最廣泛的HIBD動(dòng)物模型為Rice-Vannucci法制作的模型，該模型與臨床HIBD病理基礎(chǔ)相似，與完全缺氧法制作的模型相比，可有效降低死亡率，且成模一致性較高[3]。本文83.33 %的新生大鼠出現(xiàn)異常神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)，提示建模成功率高。

本研究發(fā)現(xiàn)，silncMALAT1組大鼠海馬組織lncRNA-MALAT1表達(dá)量降低、海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)減少，目標(biāo)象限停留時(shí)間延長，穿越平臺(tái)次數(shù)增多，說明下調(diào)lncRNA-MALAT1可抑制HIBD新生大鼠的海馬神經(jīng)元凋亡，改善學(xué)習(xí)和記憶功能。小動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)的建立對(duì)糾正HIBD至關(guān)重要，而多種lncRNA在血管新生方面發(fā)揮重要調(diào)控作用。有研究表明，缺氧可促進(jìn)大鼠腦組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞lncRNA-MALAT1表達(dá)上調(diào)，參與調(diào)節(jié)缺氧性腦損傷，但具體調(diào)控機(jī)制不明[6]。本研究silncMALAT1組海馬組織BDNF、TrkB mRNA和蛋白表達(dá)量，以及p-ERK1/2與ERK1/2比值均降低，說明新生大鼠HIBD發(fā)病機(jī)制可能與激活BDNF/TrkB信號(hào)通路介導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡有關(guān)。TrkB與BDNF結(jié)合后可發(fā)生二聚體化，從而磷酸化激活下游ERK1/2信號(hào)通路，參與調(diào)控細(xì)胞凋亡。Atif等[7]研究表明，BDNF/TrkB信號(hào)通路與小鼠HIBD后急性行為性癲癇和腦梗死面積減少有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)lncRNA-MALAT1可抑制脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化，參與調(diào)控腦內(nèi)炎癥反應(yīng)[8]。這說明lncRNA-MALAT1可能與海馬區(qū)BDNF/TrkB信號(hào)通路存在相互作用，抑制lncRNA-MALAT1表達(dá)可抑制BDNF/TrkB信號(hào)通路，從而調(diào)控HIBD進(jìn)程。

總之，下調(diào)lncRNA-MALAT1表達(dá)對(duì)新生大鼠HIBD具有保護(hù)作用，可能與抑制BDNF/TrkB信號(hào)通路有關(guān)。