劉微，戴凌燕，苗青，彭輝，張東杰，李志江，3

1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江大慶 163319；3.黑龍江省雜糧加工及質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，黑龍江大慶 163319

酵母作為最簡單的真核生物，因代謝途徑特殊， 遺傳操作方法簡單等優(yōu)勢而被廣泛應(yīng)用于生理生化功能的研究［1］。同時，酵母也是人類實(shí)踐中應(yīng)用較早的一類微生物。早在1978 年，就建立了酵母菌遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)［2］。以酵母作為模式生物，人們對真核生物的認(rèn)知取得了巨大進(jìn)展［3-4］。許多研究是以敲除內(nèi)源基因或表達(dá)外源基因的方式對酵母進(jìn)行遺傳改造，為了獲取酵母基因組中的目的基因片段或篩選酵母轉(zhuǎn)化后的陽性轉(zhuǎn)化子，通常需提取基因組作為PCR 模板［5］。但酵母基因組提取耗時長，通常根據(jù)酵母的生長周期（100 ~ 300 min），需要1 ~ 3 d 的時間以積累足夠的菌體；提取過程一般為2 ~ 6 h，操作復(fù)雜，試劑用量大，而且使用的氯仿、苯酚等試劑如操作不當(dāng)，會對身體健康造成一定危害。

菌落PCR 是一種無需提取基因組，直接使用單菌落菌體進(jìn)行基因型鑒定與分析的方法，可用于基因擴(kuò)增［6-7］、菌株鑒定［8-9］、陽性轉(zhuǎn)化子篩選［10-11］等多種分子生物學(xué)領(lǐng)域，操作簡便、快捷，無需進(jìn)行菌體積累，生長至肉眼可見的單菌落即可作為實(shí)驗(yàn)材料，極大地縮短了培養(yǎng)時間。但不同于普通細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，酵母細(xì)胞壁中多糖占比達(dá)85% ~ 90%，其次是10% ~ 15%的蛋白質(zhì)。而通過0-糖苷鍵相連的甘露聚糖和蛋白質(zhì)中的蘇氨酸或絲氨酸則構(gòu)成甘露糖蛋白，覆蓋于細(xì)胞表層，使得酵母細(xì)胞具有良好的韌性［12-13］。因此，若直接使用普通的細(xì)菌菌落PCR 方法擴(kuò)增目的基因或鑒定酵母陽性轉(zhuǎn)化子，通常因破壁效果差，基因組無法釋放而不能得到理想結(jié)果，成功率低［14］。目前常用的酵母破壁方法有酶解法、高溫法、凍融法、超聲波法、液氮研磨法、商品試劑盒等，酶解法DNA 損傷小，但操作繁瑣，酶試劑價格高且不易存儲；高溫法操作簡便，設(shè)備要求低，但易造成基因組DNA 降解；凍融法DNA損傷小，但操作繁瑣，耗時長，設(shè)備要求高；超聲波法破壁效果較好，但菌體積累時間長，實(shí)驗(yàn)效果不穩(wěn)定；液氮研磨法成本低，效果好，但耗時、費(fèi)力，不適于大規(guī)模操作；商品試劑盒效果良好，但耗時長，成本高。

為改進(jìn)酵母菌落PCR 效果，通常要在進(jìn)行PCR反應(yīng)之前對酵母細(xì)胞進(jìn)行預(yù)先的破壁處理。但目前常用的破壁方法效果均不理想，從實(shí)驗(yàn)效果和實(shí)驗(yàn)成本上來說，并不適用于大規(guī)模的陽性轉(zhuǎn)化子篩選。酵母菌落PCR 仍存在適用性窄，成功率低的問題。為解決這一難題，本研究對以往文獻(xiàn)報道過的酵母菌落PCR 技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，建立了一種經(jīng)濟(jì)高效的酵母菌落PCR 模板DNA 制備方法，以期提高工作效率，降低實(shí)驗(yàn)成本。

1 材料與方法

1.1菌株及載體 魯氏酵母菌株購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（編號：CICC 32899）；磷酸丙糖異構(gòu)酶（triosephosphate isomerase，TPI，EC：5.3.1.1）基因過表達(dá)載體TPI-pECS-URA（MCS1）由轉(zhuǎn)導(dǎo)精進(jìn)（武漢）生物技術(shù)有限公司構(gòu)建。

1.2主要試劑及儀器 2 × Taq PCR Master Mix 購自北京天根生化科技有限公司；乙酸乙酯、酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（YPD）、氯仿、異丙醇、Tris、EDTA、濃鹽酸、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純試劑；電擊轉(zhuǎn)化儀購自美國BTX 公司（ECM830 型）；PCR 擴(kuò)增儀（T100 型）和凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc XR+型）購自美國Bio-Rad 公司。

1.3引物設(shè)計及合成 通過NCBI 數(shù)據(jù)庫的Nucleotide（www.ncbi.nlm.nih.gov）獲得魯氏酵母菌目的基因序列，利用Primer 5.0 軟件設(shè)計引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息見表1。

表1 基因克隆及陽性轉(zhuǎn)化子篩選所用引物序列Tab.1 Primer sequences for gene cloning and positive transformant screening

1.4菌株培養(yǎng)與重組菌株構(gòu)建 在無菌條件下將魯氏酵母菌接種于YPD 瓊脂平板，28 ℃，培養(yǎng)2 ~3 d，直至長出直徑0.5 mm 左右的菌落，用于菌落PCR。挑取菌體，接入無菌液體YPD 培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r ／ min 條件下培養(yǎng)24 h，積累菌體，用于基因組DNA 提取后進(jìn)行PCR。

將載體TPI-pECS-URA（MCS1）通過電擊轉(zhuǎn)入魯氏酵母感受態(tài)細(xì)胞中構(gòu)建重組菌株，涂布于YPD 平板，28 ℃培養(yǎng)至長出肉眼可見的直徑0.5 mm 左右的菌落，備用。

1.5酵母基因組DNA 提取 將單菌落接入無菌液體YPD 培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后，15 294 ×g 離心1 min，收集菌體，于液氮中充分研磨至白色、均勻細(xì)粉狀，向離心管中加入不超過100 mg 菌體和600 μL DNA 提取液［1 mol ／ L Tris·HCl（pH = 8.0）10.0 mL，5 mol ／ L NaCl 2.5 mL，0.5 mol ／ L EDTA（pH = 8.0）2.5 mL，10% SDS 2.5 mL，去離子水32.5 mL］，60 ℃水浴30 min；4 ℃，15 294 × g 離心5 min，移取上清液，加入等體積氯仿，混勻并靜置10 min；4 ℃，15 294 × g 離心5 min，再次移取上清液至新離心管，加入等體積異丙醇，混勻后在-20 ℃下靜置30 min；4 ℃，15 294 × g 離心5 min，棄上清液，向離心管中加入1 mL 70%乙醇，搖動清洗，再次離心5 min，棄上清液，于超凈臺風(fēng)干后，向離心管中加入100 μL 無菌水，60 ℃水浴溶解，搖勻即得基因組DNA，-20 ℃保存。

1.6乙酸乙酯-高溫破壁法制備模板 向1.5 mL 離心管中加入乙酸乙酯100 μL，挑取酵母單菌落適量菌體（肉眼可見即可，避免菌體過量或帶入培養(yǎng)基影響試驗(yàn)結(jié)果）加入離心管中，充分?jǐn)嚢?，渦旋振蕩5 min 后，于90 ～100 ℃水浴加熱至乙酸乙酯全部蒸發(fā)，得到提取物；向離心管中加入50 μL 無菌水，渦旋振蕩5 min 后，于90 ～100 ℃水浴加熱5 min，得到酵母單菌落DNA，作為處理組模板，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7高溫破壁法制備模板 向1.5 mL 離心管中加入無菌水50 μL，挑取酵母單菌落適量菌體加入離心管中，充分?jǐn)嚢?，?0 ～100 ℃水浴加熱5 min，得到酵母單菌落DNA，-20 ℃保存。

1.8PCR 反應(yīng) 反應(yīng)體系：2 × PCR Mix 20 μL，上下游引物各2 μL，基因組DNA 模板3 μL，加入超純水至終體積為50 μL。反應(yīng)條件：95 ℃5 min；95 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃1 min，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳液為1×TAE，每個加樣孔點(diǎn)樣5 μL，恒壓100 V，電泳45 min 后，使用凝膠成像儀記錄結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1目的基因的擴(kuò)增 隨機(jī)選擇10 個菌落，分別以菌液提取的基因組DNA、菌落通過高溫破壁法以及乙酸乙酯-高溫破壁法制備的DNA 為模板，利用3對基因引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示，引物1488 和1248 在以菌落制備DNA 和菌液基因組DNA 為模板的PCR 結(jié)果相同，均擴(kuò)增出特異性目的基因條帶，且條帶清晰、明亮，無明顯拖尾或彌散現(xiàn)象（圖1A、B、D、E）。引物944 僅3 號菌的菌落PCR 未擴(kuò)增出目的基因條帶，其他菌落均與菌液PCR 結(jié)果一致（圖1G、H）。而以高溫破壁法制備的DNA 為模板進(jìn)行目的基因擴(kuò)增時，僅2 號、7 號菌落擴(kuò)增出特異性目的基因條帶，且條帶亮度較低（圖1C、F、I）。

2.2陽性轉(zhuǎn)化子篩選 隨機(jī)挑選TPI 基因過表達(dá)魯氏酵母重組菌的10 個單克隆，利用引物754 進(jìn)行菌落制備DNA 和菌液基因組DNA 為模板的PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示，采用乙酸乙酯-高溫法制備模板進(jìn)行菌落PCR 時，2、5、8 號轉(zhuǎn)化子有明顯特異性擴(kuò)增條帶；以菌液基因組DNA 為模板再次對相應(yīng)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR 鑒定，結(jié)果顯示，2、5、6、8 號轉(zhuǎn)化子有明顯特異性擴(kuò)增條帶。同時，另選取10 個經(jīng)驗(yàn)證為陽性的轉(zhuǎn)化子，以高溫破壁法制備DNA 為模板再次進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，僅5 號菌落擴(kuò)增出特異性目的基因條帶。見圖2。

圖2 酵母陽性克隆的篩選Fig.2 Screening of positive clones of yeast

A：引物1448 的菌落PCR；B：引物1448 的基因組DNA PCR；C：引物1448 的高溫破壁菌落PCR；D：引物1248 的菌落PCR；E：引物1248 的基因組DNA PCR；F：引物1248 的高溫破壁菌落PCR；G：引物944 的菌落PCR；H：引物944 的基因組DNA PCR；I：引物944 的高溫破壁菌落PCR；M：DNA marker DL2000；1：空白對照（以去離子水為模板）；2 ～11：10 個隨機(jī)挑選的菌落。

3 討 論

乙酸乙酯作為常見的萃取溶劑，具有溶解細(xì)胞壁的功能；渦旋振蕩及水浴也會使細(xì)胞壁出現(xiàn)不同程度的破損；以上方法結(jié)合使用，既能使酵母細(xì)胞充分破碎，釋放其基因組DNA，又不會因加熱時間過長，引起基因組DNA 的降解。

本研究對常規(guī)酵母菌落PCR 模板制備方法進(jìn)行了改進(jìn)，將乙酸乙酯法與高溫法相結(jié)合。直接挑取單菌落菌體加入乙酸乙酯中，充分渦旋振蕩后，將乙酸乙酯徹底蒸發(fā)，加入無菌水后再次渦旋振蕩并加熱，即可得到菌落基因組DNA，可直接作為菌落PCR 模板。此方法的優(yōu)勢在于，首先，效率高，在基因克隆中可達(dá)96.7%（29 ／ 30），陽性克隆篩選中可達(dá)90%；其次，耗時短，操作簡單，成本低，制取1 個單菌落的PCR 模板所需時長僅為20 min 左右，所需試劑與耗材僅為100 μL 乙酸乙酯（約0.01 元），1.5 mL 離心管1 個（約0.04 元），制取1 個單菌落的PCR 模板總價不超過0.1 元，具有極大的成本優(yōu)勢。此外，與各種機(jī)械破壁法相比，所用儀器均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器，易于操作。相比于傳統(tǒng)的高溫破壁法［15］，或葉玲等［16］采取的酵母菌落水溶液直接PCR 法，本實(shí)驗(yàn)提供的方法結(jié)果更加穩(wěn)定。胡榮飛等［17］利用研磨儀對菌體進(jìn)行破壁處理，效果良好。但相比于乙酸乙酯-高溫法，所需儀器、試劑種類較多，操作復(fù)雜。與唐巧玲［18］等報道的利用SDS 和醋酸鋰進(jìn)行破壁，并提取酵母基因組的方法相比，本實(shí)驗(yàn)建立的方法更加高效便捷，易于操作。

綜上所述，與現(xiàn)有的菌落PCR 模板制備方法相比，本實(shí)驗(yàn)為酵母基因組中目的基因克隆和大規(guī)模的酵母轉(zhuǎn)化子篩選及鑒定提供了快速、經(jīng)濟(jì)有效的新方法，可解決基因組提取費(fèi)時費(fèi)力及大規(guī)模篩選轉(zhuǎn)化子高價試劑用量大的問題。