張?zhí)m蘭，毛志遠(yuǎn)，李向敏，李 燕，于海燕，晉 穎，夏秀玲，樊再雯

肺癌是最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率、病死率呈逐年升高的趨勢(shì)，其中非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌的85%[1]。近年來(lái)有研究報(bào)道，腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）共同影響腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[2]。TME由內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞等組成，TME中的免疫細(xì)胞包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAMs）、中性粒細(xì)胞和骨髓來(lái)源的抑制細(xì)胞等[2]。與CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞等適應(yīng)性免疫細(xì)胞不同，NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是2種主要?dú)[瘤細(xì)胞的固有免疫細(xì)胞，為了探討NSCLC患者TME中NK細(xì)胞和TAMs的分布特點(diǎn)，本研究檢測(cè)了87例NSCLC患者組織標(biāo)本中CD56、CD68和CD163蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步探討腫瘤微環(huán)境與患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，為肺癌術(shù)后患者的治療方案提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2016年1月—2018年12月在空軍特色醫(yī)學(xué)中心（原空軍總醫(yī)院）手術(shù)切除，經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為NSCLC且臨床資料完整的患者87例。根據(jù)Chen等[3]研究定義腫瘤微環(huán)境免疫分型（tumor micro-enviroment type，TMIT），TMIT Ⅰ型：CD8+PD-L1+；TMIT Ⅱ型：CD8-PD-L1-；TMIT Ⅲ型：CD8-PD-L1+；TMIT Ⅳ型：CD8+PD-L1-。本研究TMIT分型在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了補(bǔ)充及完善[4]。所有患者術(shù)前均未接受過(guò)治療，并且無(wú)其他惡性腫瘤、自身免疫性疾病及嚴(yán)重感染性疾病，樣本收集及研究方案得到醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，所有參與患者或家屬均告知并簽署知情同意書(shū)，隨訪方式主要以電話、門(mén)診、住院等對(duì)患者進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間截止2020年10月。

1.2 主要試劑 CD56抗體試劑（ZM-0057）、CD68抗體試劑（ZM-0060）、CD163抗體試劑（ZM-0428）、通用二步法試劑盒（PV-9000）、DAB顯色試劑盒（ZLI-9018）均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物蛋白-過(guò)氧化物酶連接（streptavidin-perosidase，SP）方法 石蠟組織4 μm連續(xù)切片，撈于防脫片上，于65 ℃烤箱烘烤1～2 h脫蠟，切片置于pH 6.0檸檬酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，置入3% H2O2室溫孵育15 min封閉抗原，滴加一抗（CD56抗體1：200，CD68抗體1：200，CD163抗體1：400），置于試劑盒中37 ℃ 30 min；PBS沖洗5次，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育30 min；PBS沖洗后二氨基聯(lián)苯胺(3，3-diaminobezidin，DAB)顯色，洗滌，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，自動(dòng)封片機(jī)下封片，鏡下觀察。陰性對(duì)照：用PBS代替一抗。

1.4 結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn) 染色后所有切片由2位病理科醫(yī)師按雙盲法進(jìn)行讀片，選取5個(gè)具有代表性的視野。判斷結(jié)果：CD56 陽(yáng)性染色位于細(xì)胞膜和/或細(xì)胞質(zhì)，按照染色強(qiáng)度計(jì)分，未染色計(jì)為0分、淡黃色計(jì)為1分、棕黃色計(jì)為2分、棕褐色計(jì)為3分；按陽(yáng)性細(xì)胞染色比例計(jì)分，未染色計(jì)為0分、陽(yáng)性細(xì)胞＜25%計(jì)為1分、25%～50%計(jì)為2分、＞50%計(jì)為3分。兩項(xiàng)積分相乘，0分為陰性、≥1分為陽(yáng)性[5]。CD68標(biāo)記的TAMs以細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)，CD163標(biāo)記的M2型TAMs以細(xì)胞的胞質(zhì)或胞膜呈現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)，判定標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)TAMs浸潤(rùn)密度進(jìn)行評(píng)分，即每視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占所有細(xì)胞數(shù)的50%；≥50%的陽(yáng)性細(xì)胞為高浸潤(rùn)，＜50%的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為低浸潤(rùn)。TAMs浸潤(rùn)腫瘤微環(huán)境間質(zhì)區(qū)域定義為邊緣型巨噬細(xì)胞，TAMs浸潤(rùn)至癌巢中心部位定義為中心型巨噬細(xì)胞。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 25.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，率的比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，應(yīng)用Kaplan-Meier繪制生存曲線，單因素分析用Log-rank檢驗(yàn)，以COX回歸進(jìn)行多因素生存分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征 87例中男53例（60.92%），女34例（39.0 8%）。年齡39～84歲。有吸煙史者39 例（44.83%），無(wú)吸煙史者48例（55.17%）。TNM分期：Ⅰ期45例（51.72%），Ⅱ期19例（21.84%），Ⅲ期23例（26.44%）。腺癌58例（66.67%），鱗癌29例（33.33%）。EGFR突變者35例（40.23%），EGFR野生型52例（59.17%）。TMIT分型結(jié)果：TMIT Ⅰ型29例（33.33%），TMIT Ⅱ型12例（13.79%），TMIT Ⅲ型 11例（12.64%），TMIT Ⅳ型35例（40.23%）。

2.2 CD56、CD68和CD163蛋白在NSCLC中的表達(dá)特點(diǎn)及其與臨床病理學(xué)因素分析 CD56+NK細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)27例（31.03%），陰性表達(dá)60例（68.97%）。CD56+NK細(xì)胞主要表達(dá)在腫瘤間質(zhì)，癌巢幾乎沒(méi)有CD56+NK細(xì)胞（圖1）。CD56+NK細(xì)胞在Ⅲ期、EGFR野生型的NSCLC組織中高表達(dá)（P＜0.05）。CD68+TAMs與CD163+TAMs在腫瘤間質(zhì)與癌巢中心中均有浸潤(rùn)（圖2、3），邊緣型和中心型CD68+TAMs在Ⅲ期的NSCLC組織中高浸潤(rùn)（P＜0.05）。邊緣型CD163+TAMs在Ⅲ期、腺癌的NSCLC患者組織中高浸潤(rùn)（P＜0.05）；中心型CD163+TAMs在吸煙、腺癌、Ⅲ期、EGFR野生型的NSCLC患者組織中高浸潤(rùn)（P＜0.05），在性別、年齡和TMIT分型的NSCLC組織中表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 CD56+NK 細(xì)胞、CD68+TAMs和CD163+TAMs表達(dá)與NSCLC患者臨床病理學(xué)因素分析（例）

圖1 CD56+NK細(xì)胞在NSCLC患者組織中免疫組化的檢測(cè)結(jié)果（SP，×400）

圖2 CD68+TAMs在NSCLC患者組織中免疫組化的檢測(cè)結(jié)果（SP，×400）

2.3 CD56、CD68和CD163蛋白表達(dá)與NSCLC患者DFS相關(guān)性分析 截至2020年10月隨訪結(jié)束，87例中44例術(shù)后復(fù)發(fā)，中位無(wú)病生存期（disease free survival，DFS）為43.0個(gè)月。經(jīng)Log-rank單因素分析顯示，邊緣型CD68+TAMs高浸潤(rùn)、邊緣型CD163+TAMs高浸潤(rùn)的NSCLC患者的DFS較短（P＜0.05）（圖4、5）。將所有指標(biāo)納入COX模型進(jìn)行多因素回歸分析，邊緣型CD163+TAMs高浸潤(rùn)是影響DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。

圖3 CD163+TAMs在NSCLC患者組織中免疫組化的檢測(cè)結(jié)果（SP，×400）

圖4 邊緣型CD68+TAMs不同浸潤(rùn)程度與NSCLC患者生存曲線

圖5 邊緣型CD163+TAMs不同浸潤(rùn)程度與NSCLC患者生存曲線

3 討論

TME是一個(gè)復(fù)雜的環(huán)境，在腫瘤細(xì)胞的周圍有免疫細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等各種細(xì)胞和豐富的細(xì)胞因子，這些物質(zhì)形成一個(gè)具有缺氧、慢性炎癥和免疫抑制性的TME[2]。多數(shù)免疫細(xì)胞的功能在TME中發(fā)生改變，如NK細(xì)胞不能發(fā)揮直接殺傷腫瘤細(xì)胞的功能[6]，TAMs也不能發(fā)揮有效的吞噬異己的能力，甚至發(fā)生極化，其中發(fā)生極化的M2型TAMs有促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的能力，有研究發(fā)現(xiàn)M2型TAMs與新生血管和微淋巴管密度相關(guān)[7-8]，可能是TAMs分泌的物質(zhì)刺激腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[9]。多種癌癥均有報(bào)道，TAMs的高浸潤(rùn)影響患者預(yù)后，如非小細(xì)胞肺癌、胃癌和乳腺癌等[10-12]。NK細(xì)胞的亞群在細(xì)胞毒性、細(xì)胞因子產(chǎn)生和歸巢能力方面表現(xiàn)出功能差異，根據(jù)NK細(xì)胞表面CD56的表達(dá)水平，NK細(xì)胞分為CD56bright和CD56dim 2種不同的表型：CD56bright NK細(xì)胞具有產(chǎn)生豐富細(xì)胞因子的能力，而CD56dim NK細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，肺內(nèi)約10%～20%的淋巴細(xì)胞為NK細(xì)胞，絕大多數(shù)NK細(xì)胞為CD56dim表型[14-15]，故本研究選取CD56做為NK細(xì)胞的標(biāo)記物。以往研究?jī)H對(duì)CD68進(jìn)行免疫染色，CD68是最常見(jiàn)的泛巨噬細(xì)胞標(biāo)志物[16-17]。TAMs可分化成不同的表型，如抑制腫瘤的M1型巨噬細(xì)胞和促進(jìn)腫瘤的M2型巨噬細(xì)胞[7]。M2型TAMs主要表達(dá)CD163蛋白、CD204蛋白和CD206蛋白[18-19]，故本研究選擇CD68抗體和CD163抗體作為研究TAMs的指標(biāo)。有研究報(bào)道，巨噬細(xì)胞分布在肺癌組織的不同區(qū)域中，如在癌組織與間質(zhì)組織中的TAMs可能表現(xiàn)出不同的生物學(xué)特性[20-21]。本研究主要觀察CD56+NK細(xì)胞、CD68+TAMs和CD163+TAMs在NSCLC腫瘤組織的分布。

本研究結(jié)果顯示，NSCLC組織中CD56+NK細(xì)胞多數(shù)呈陰性表達(dá)，EGFR野生型NSCLC腫瘤間質(zhì)高浸潤(rùn)，與既往研究結(jié)果相似[22-23]。首先，可能是NK細(xì)胞數(shù)量少，NK細(xì)胞在NSCLC癌組織和腫瘤間質(zhì)之間分布呈顯著的異質(zhì)性，癌組織中心區(qū)幾乎沒(méi)有NK細(xì)胞，而在腫瘤間質(zhì)中NK細(xì)胞也呈選擇性地分布[23]；其次，NK細(xì)胞在TME中受到免疫抑制作用，腫瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子能抑制NK細(xì)胞的功能，如IL-6、IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor-β，TGF-β）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、吲哚胺-2，3-雙加氧酶（idoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）等[24]。本研究未發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞對(duì)DFS的影響，但有研究發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中NK細(xì)胞高浸潤(rùn)的患者化療預(yù)后較好[25]，考慮肺癌與胃癌存在生物學(xué)差異以及樣本量的關(guān)系，有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量和納入不同腫瘤進(jìn)一步研究；也有研究認(rèn)為影響患者生存的是NK細(xì)胞的表型和功能，而不是NK細(xì)胞的浸潤(rùn)密度[23]。

本研究Ⅲ期的NSCLC患者，其邊緣型和中心型CD68+TAMs呈高浸潤(rùn)，可能是腫瘤細(xì)胞與CD68+TAMs能夠通過(guò)旁分泌細(xì)胞因子形成旁分泌環(huán)，為NSCLC的侵襲和疾病進(jìn)展提供了適宜的微環(huán)境[26-27]。邊緣型CD163+TAMs在Ⅲ期、腺癌的NSCLC組織中以高浸潤(rùn)多見(jiàn)，可能是腺癌和鱗癌的TME之間存在差異性造成的。中心型CD163+TAMs在Ⅲ期、吸煙、EGFR野生型的NSCLC患者中高浸潤(rùn)。吸煙患者CD163+TAMs高浸潤(rùn)，可能是煙草能刺激多種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞等[28]。一項(xiàng)研究報(bào)道，EGFR野生型NSCLC患者腫瘤間質(zhì)的TAMs計(jì)數(shù)更高[29]，而另一項(xiàng)研究中心型CD204+（M2型）TAMs在EGFR野生型的NSCLC患者中低浸潤(rùn)[30]，可能是EGFR野生型與腫瘤中的巨噬細(xì)胞遷移有關(guān)，但其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究明確。

邊緣型CD68+TAMs、CD163+TAMs高浸潤(rùn)的NSCLC患者DFS較短，在COX回歸模型的多因素分析中，發(fā)現(xiàn)邊緣型CD163+TAMs是影響DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。可能是早期肺癌患者的TME中M2型TAMs數(shù)量較少，CD68+TAMs在NSCLC進(jìn)展期間可分化為CD163+TAMs促進(jìn)腫瘤的侵襲性，且M2型TAMs主要分布于腫瘤間質(zhì)，隨著病情的進(jìn)展可移入癌巢，故CD163是一個(gè)較CD68預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后更佳的指標(biāo)。

在本研究納入了免疫分型四分型法，未發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞、TAMs與免疫分型的相關(guān)性，可能是TME中存在多種免疫細(xì)胞，需要納入更多的免疫細(xì)胞共同定義TME的性質(zhì)。

綜上所述，NSCLC患者TME中的NK細(xì)胞數(shù)量少，可能是肺癌微環(huán)境對(duì)NK細(xì)胞有抑制作用，導(dǎo)致其數(shù)量和比例明顯下降。CD163+TAMs較CD68+TAMs更能反映TME具有免疫抑制性。對(duì)于邊緣型和中心型CD163+TAMs高浸潤(rùn)的腫瘤患者，即使是早期患者，可能也需要術(shù)后輔助化療或靶向治療。本研究樣本量較小，故下一步將進(jìn)行大樣本量的統(tǒng)計(jì)，并且完善國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中涉及而本研究未完成的統(tǒng)計(jì)，以此為了解NSCLC腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的分布特點(diǎn)，并進(jìn)一步探索其臨床意義。