王恒，鄒純才，鄢海燕

(皖南醫(yī)學院藥學院，安徽 蕪湖 241002)

藥物性肝損傷 (drug-induced liver injury，DILI) 是指由各類處方或非處方的化學藥物、生物制劑、天然藥物及其代謝產(chǎn)物等誘發(fā)的肝損傷[1]。DILI易發(fā)展成肝衰竭，致死率可達75%。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計：藥物引起的肝功能異常已經(jīng)上升為全球肝病死亡病原的第五位[2]。在我國，DILI發(fā)病率僅次于病毒性肝炎、脂肪性肝病[3]。近年來，隨著抗腫瘤藥物的不斷研發(fā)，惡性腫瘤患者的預后有了明顯的提高，生存期也大大延長，但其不良反應也為腫瘤患者的治療帶來了新的問題。腫瘤藥物治療時易引起藥物性肝損傷，特別是在肝炎發(fā)病率較高的中國，尋找有效藥物降低或預防藥物性肝損傷值得研究。

決明子是豆科植物決明CassiaobtusifoliaL.或小決明CassiatoraL的成熟干燥種子，其味甘、苦、咸，性微寒，善入肝、腎、大腸經(jīng)，具有清肝明目、潤腸通便的功效[4]，始載于《神農(nóng)草本經(jīng)》，列為上品?，F(xiàn)代研究表明，決明子具有降血壓、降血脂、保肝、明目、抗氧化、抑菌等作用[5]。決明子作為我國常用中藥，同時也是藥食同源物質(zhì)之一，藥理作用廣泛，在臨床疾病的預防及養(yǎng)生等方面具有顯著的作用，但其作用機制尚不明確，本文通過網(wǎng)絡藥理學對決明子抗腫瘤藥致肝損傷作用靶點進行預測分析，明確決明子對5-FU致肝損傷保護作用機制，為深入研究其治療抗腫瘤藥致肝損傷提供理論依據(jù)與參考。

1 材料與方法

1.1 決明子蒽醌類活性成分的篩選及靶點的整理 通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)、 CNKI數(shù)據(jù)庫及PubMed等數(shù)據(jù)庫收集決明子蒽醌類成分，繪制結(jié)構(gòu)式并以MDL SDfile(*.sdf)格式保存。將繪制的結(jié)構(gòu)式導入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http：//www.swisstargetprediction.ch/)，檢測匹配得到藥物的預測靶點，設置Probability≥ 0.05，獲得決明子蒽醌類的活性成分靶點蛋白。

1.2 收集疾病相關(guān)靶點 通過CooLGeN(http：//ci.smu.edu.cn/CooLGeN/Home.php)、GeneCards(https：//www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫，以“Liver injury caused by fluorouracil”和“Liver injury”為關(guān)鍵詞進行檢索，獲取疾病相關(guān)靶點。利用Venny2.1.0(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)將“1.1”項下的決明子蒽醌類成分的預測靶點去重后與疾病相關(guān)靶點取交集靶點。

1.3 構(gòu)建靶點的蛋白互作網(wǎng)絡圖 為了解釋目的蛋白之間的相互作用，將“1.2”項下得到的交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫( https：//string-db.org/)中，選擇物種為人，初步獲得決明子蒽醌類成分抗5-Fu致肝損傷保護作用的PPI網(wǎng)絡信息。導出數(shù)據(jù)庫中生成的PPI網(wǎng)絡信息的“TSV”文件，導入Gephi0.9.2軟件中進行分析，獲得網(wǎng)絡中節(jié)點的度值，篩選核心靶點，度值越大表明靶點所起的作用越大。

1.4 GO功能富集分析及KEGG信號通路富集分析 為了闡明決明子蒽醌類成分中目標化合物的功能及其在信號轉(zhuǎn)導中的作用，利用DAVID數(shù)據(jù)庫(https：//david．ncifcrf．gov)對參與PPI網(wǎng)絡的蛋白的GO功能和KEGG通路富集進行了分析，并介紹靶蛋白的細胞組成、分子功能、生物學過程和信號通路。

1.5 化學成分-靶點蛋白-通路網(wǎng)絡的構(gòu)建 通過Gephi0.9.2建立了“成分-疾病-靶點通路”相互作用的網(wǎng)絡模型。將“1.1”項下的決明子蒽醌類成分及靶點、“1.3”項下的交集靶點、“1.4”項下的通路信息導入Gephi0.9.2，構(gòu)建活性成分-蛋白靶點-通路的網(wǎng)絡圖。

1.6 分子對接驗證 通過SYBYL-X 2.1.1軟件進行重要靶點和成分的分子對接，以PPI網(wǎng)絡中度值前十的靶點為受體，與其對應的活性成分為配體，對氟尿嘧啶致肝損傷靶點與決明子蒽醌類成分的相互作用進行研究。在PDB數(shù)據(jù)庫(http：//www.rcsb.org / )中下載靶點的蛋白結(jié)構(gòu)，分別將小分子與蛋白結(jié)構(gòu)導入Sybyl軟件中進行預處理，去除配體，水分子，進行加氫，以蛋白的配體小分子為口袋，與成分分子進行對接處理，得到靶點與其對應成分對接后的Total Score分值，Total Score值換算結(jié)合自由能公式為△G0=-2.303 RT×Total Score(其中R為分子的理想氣體常數(shù)，T為理想氣體的熱力學溫度)，因此 Total Score 值越大，配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定[6]，再通過PyMol進行受體配體的相互作用模式分析。

2 結(jié)果

2.1 決明子蒽醌類成分的收集及靶點的整理 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫與文獻檢索[6-7]，共獲得35種決明子蒽醌類成分，經(jīng)篩選，共有27個活性成分符合條件，作為候選化合物納入研究，見表1。篩選得到成分相關(guān)靶點2 711個，設置篩選條件Probability≥0.05，刪除無效重復的靶點，最終得到?jīng)Q明子蒽醌類有效活性成分的靶點349個[7-8]。

表1 決明子中27個蒽醌類成分信息

2.2 疾病靶點的預測 通過Gene Cards數(shù)據(jù)庫獲得肝損傷靶點1 399個，CooLGeN數(shù)據(jù)庫獲得1 895個，結(jié)合已獲得的決明子蒽醌類成分的作用靶點，應用Venny2.1.0，制作成分靶點與疾病靶點的韋恩圖，共得到103個交集靶點，作為決明子蒽醌類成分抗5-Fu致肝損傷保護作用潛在的靶點，見圖1。

圖1 決明子蒽醌類成分靶點與疾病靶點的交集靶點

2.3 靶點蛋白PPI網(wǎng)絡的構(gòu)建與分析 將“2.2”項下得到的103個交集靶點導入String數(shù)據(jù)庫中，選擇物種“Homo sapiens”，得到成分與靶點的蛋白互作網(wǎng)絡，見圖2。PPI網(wǎng)絡中，共103個節(jié)點，1 383條邊，其中節(jié)點代表目標蛋白，每條邊代表蛋白-蛋白相互作用。在網(wǎng)絡中，每個節(jié)點的度表示連接到該靶點的數(shù)量，因此，程度越大，該節(jié)點對應的目標蛋白在網(wǎng)絡中的作用就越強，表明該目標蛋白在整個相互作用網(wǎng)絡中起著重要的作用，將它們作為核心靶點[9]。下載其“TSV”格式的網(wǎng)絡信息，導入Gephi 0.9.2軟件，利用其統(tǒng)計分析功能對網(wǎng)絡節(jié)點中的度值進行計算，篩選核心靶點。如圖3展示了GAPDH、AKT1、STAT3、MAPK1、EGFR、TP53、HSP90AA1、SRC、CASP3等度值較高的前二十位核心靶點，現(xiàn)代研究表明，這些靶點多是參與細胞增殖、分化、凋亡、分裂、新陳代謝、氧化還原、免疫調(diào)節(jié)和癌癥發(fā)展等過程[10-13]。

圖2 決明子蒽醌類成分與疾病靶點的PPI網(wǎng)絡

圖3 PPI中degree值較高的靶點

表1(續(xù)) 決明子中27個蒽醌類成分信息

2.4 目的蛋白GO功能注釋和KEGG通路分析 對103個關(guān)鍵靶點進行細胞學組分、分子功能與生物學過程及信號通路富集分析。設置篩選條件(P<0.05)，由GO富集結(jié)果得到共有77條生物學功能，其中有37條涉及生物學過程，決明子蒽醌類成分主要參與蛋白質(zhì)自身磷酸化，跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路，凋亡過程的負調(diào)控，細胞增殖調(diào)節(jié)，磷脂酶C活性正調(diào)控，凋亡信號通路的負調(diào)控，神經(jīng)元凋亡過程的負調(diào)控，肽基蘇氨酸磷酸化，ERK1和ERK2級聯(lián)的正調(diào)節(jié)，負性調(diào)節(jié)等生物學過程，表明決明子蒽醌類成分主要參與涉及細胞凋亡、細胞增殖、炎癥途徑、細胞信號傳導、調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能等反應。細胞成分富集了17條，主要參與質(zhì)膜細胞質(zhì)側(cè)的外源成分、胞質(zhì)、細胞外基質(zhì)、受體復合體、磷脂酰肌醇3-激酶復合物、細胞質(zhì)、細胞外間隙等。分子功能共富集了23條，主要參與ATP結(jié)合、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、激酶活性、金屬內(nèi)肽酶活性、非跨膜蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、血紅素結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等生物功能，見圖4。由KEGG富集分析得到92條通路(P<0.05)，得知決明子蒽醌類成分主要涉及癌癥的途徑、前列腺癌、PI3K-Akt信號通路、癌癥的中樞碳代謝、癌癥中的蛋白多糖、HIF-1信號通路、胰腺癌、乙型肝炎、ErbB信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、大腸癌、神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路等多種重要通路，對KEGG前二十條重要通路進行可視化分析，見圖5。PI3K-Akt 信號通路作為前三的核心通路，與肝損傷密切相關(guān)，因此將此信號通路作為決明子蒽醌類成分抗5-Fu致肝損傷保護作用的通路之一，具體通路見圖6，紅色代表靶點作用的部位，可知決明子蒽醌類成分抗肝損傷作用涉及多條通路，且多個靶點在不同通路中發(fā)揮作用，如EGFR、AKT1、MAPK1在前十的通路中涉及7個以上的通路，這些通路主要關(guān)于細胞增殖、遷移、凋亡與分化、癌癥的途徑、炎癥反應等生物功能。

圖4 關(guān)鍵靶點的GO富集分析

圖5 關(guān)鍵靶點的 KEGG 通路富集分析

圖6 PI3K-Akt 信號通路

2.5 化學成分-靶點蛋白-通路網(wǎng)絡的構(gòu)建 利用Gephi 0.9.2 軟件構(gòu)建活性成分-靶點蛋白-通路網(wǎng)絡(見圖7)。在網(wǎng)絡交互中，存在154個節(jié)點，881條邊，點表示藥物、疾病、靶點、成分和通路，邊表示彼此的交互?；诰W(wǎng)絡模型圖，初步探索疾病中活性成分和靶點的作用。

圖7 決明子蒽醌類成分(黃色)-靶點(紅色)-通路(藍色)網(wǎng)絡

2.6 分子對接結(jié)果 利用SYMBL軟件，將PPI網(wǎng)絡中排名前十的核心靶點與其對應的化學成分進行分子對接，并通過Total Score值評價靶點與化學成分的結(jié)合能力，Total Score值>5，表明該成分分子與相應蛋白靶點有較強的相互作用，Total Score值>7則表明成分與靶點的相互作用強烈[14]。對接結(jié)果顯示，決明子蒽醌類成分Alatemin-1-O-β-D-glucoovranoside與AKT1有較好的結(jié)合能力，4，6，7-三甲氧基蘆薈大黃素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷與MAPK1有較好的結(jié)合活性，1-去甲基鈍葉決明素與EGFR有較好的結(jié)合活性，通過PyMol繪制其靶點與成分分子對接模式圖進行分析。Alatemin-1-O-β-D-glucoovranoside-AKT1通過Ser-205氨基酸殘基發(fā)揮作用(見圖8)，4，6，7-三甲氧基蘆薈大黃素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷-MAPK1的結(jié)合位點為Lys-54、Gln-105、Ser-153、Lys-151氨基酸殘基(見圖9)，1-去甲基鈍葉決明素與EGFR結(jié)合位點為Lys-721、Met-769氨基酸殘基(見圖10)。

圖8 AKT1與Alatemin-1-O-β-D-glucoovranoside對接模式(Total Score值=7.3062)

圖9 MAPK1與4，6，7-三甲氧基蘆薈大黃素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對接模式(Total Score值=8.0385)

圖10 EGFR與1-去甲基鈍葉決明素對接模式(Total Score值=7.1642)

3 討論

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，蒽醌類成分是決明子抗肝損傷的主要活性成分[15-16]，通過調(diào)節(jié)肝細胞增殖和凋亡，從而促進肝組織的再生修復[17]，本文經(jīng)文獻資料查詢，發(fā)現(xiàn)橙黃決明素(aurantio-obtusin)、蘆薈大黃素(aloe-emodin)、大黃酸(rhein)、大黃素(emodin)、大黃素甲醚(physcion)、大黃酚(chrysophanol)、決明素(obtusin)等27種具有潛在抗肝損傷的蒽醌類成分，其治療機制與炎癥反應、細胞凋亡、代謝的調(diào)控等密切相關(guān)[18]。

以PPI網(wǎng)絡互作圖中度值前二十的靶點為核心靶點，作為決明子蒽醌類成分治療氟尿嘧啶致肝損傷的主要靶點，并通過文獻資料查詢，對GAPDH、AKT1、STAT3、MAPK1、EGFR、HSP90AA1等度值較大的靶點進行分析?，F(xiàn)有研究表明，AKT1抑制肝細胞和肝星狀細胞(HSC)的纖維化，同時在藥理學上阻斷AKT1和AKT2可以抑制纖維化前標志物的表達和纖維化的進展，表明Akt亞型在炎癥、細胞增殖、遷移和纖維形成中發(fā)揮獨特的作用[19-20]，且AKT1在肝細胞癌(HCC)細胞中異常表達，并與細胞行為(包括增殖、生存、代謝和腫瘤發(fā)生)高度相關(guān)[21]。絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)的高表達促進了細胞的增殖、遷移和侵襲，與肝細胞癌和肝臟脂肪變性有關(guān)，長鏈非編碼RNA CRNDE通過miR 217/MAPK1軸促進肝癌細胞增殖、遷移和侵襲，MAPK1激活可增加自噬通量和ATG7水平，對肝臟脂肪變性中由ATG7依賴的自噬介導起有益作用[22-23]。EGFR信號軸已被證明在急性和慢性肝損傷后的肝臟再生以及肝硬化和肝細胞癌(HCC)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，表皮生長因子受體(EGFR)主要控制增殖、分化和生存，可保護肝細胞凋亡，從而發(fā)揮作用，也可作為肝臟再生的有用標志物，強調(diào)了EGFR在肝病發(fā)展中的重要性[24]。熱休克蛋白90AA1(HSP90AA1)可誘導ALD并調(diào)節(jié)促炎細胞因子、腫瘤壞死因子α和IL-6，和NLRP3炎性小體基因在酒精性肝病中存在正相關(guān)關(guān)系，抑制HSP90可以降低NLRP3炎性小體活性從而減少炎癥因子的分泌，促進酒精性肝硬化的恢復[25]。綜上所述，所選擇的核心靶點與肝損傷密切相關(guān)，決明子蒽醌類成分可能通過這些靶點起到治療作用。

由KEGG通路分析得到藥物的靶點主要富集在癌癥信號通路(pathways in cancer)、癌癥蛋白多糖信號通路(proteoglycans in cancer)、ErbB信號通路(ErbB signaling pathway)、乙型肝炎病毒信號通路(hepatitis B)、癌癥MicroRNAs信號通路(MicroRNAs in cancer)、PI3K-Akt信號傳導通路(PI3K-Akt signaling pathway)等信號通路，這些通路與肝損傷的形成與發(fā)展密切相關(guān)，其中PI3K-Akt通路調(diào)控廣泛的細胞活動，包括細胞存活、增殖、代謝、血管生成等[26]，是同時具有蛋白激酶活性和脂類激酶活性的胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶[27]，研究證明[28]，抑制PI3K-Akt信號傳導可以降低氧化應激和炎癥因子水平，起到抑制活化的肝星狀細胞的作用，從而阻止肝纖維化的發(fā)生，因此以該通路為切入點進一步挖掘決明子蒽醌類成分抗氟尿嘧啶致肝損傷的作用靶標。

本文基于網(wǎng)絡藥理學與分子對接的方法，構(gòu)建藥物-疾病-通路網(wǎng)絡圖顯示了決明子多成分、多靶點和多信號通道協(xié)同發(fā)揮抗氟尿嘧啶致肝損傷的保護作用，確定決明子蒽醌類成分的藥效物質(zhì)，探討了蒽醌類成分發(fā)揮抗肝損傷的作用機制，并通過分子對接技術(shù)，初步驗證了靶點預測的可靠性，為后續(xù)深入研究決明子蒽醌類成分抗肝損傷的作用機制提供了理論依據(jù)。