產(chǎn)翠翠，范心雨，龔鑫

(皖南醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

近年來(lái)，隨著人口老齡化及飲食習(xí)慣的改變，腦血管疾病成為常見(jiàn)病、多發(fā)病，缺血性腦卒中的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)。臨床數(shù)據(jù)表明，缺血性腦損傷患者往往并發(fā)其他器官功能障礙，甚至衰竭[1]?！澳X心綜合征”在臨床上較為常見(jiàn)，即顱腦疾病并發(fā)心臟損害，如心肌損傷、心力衰竭等，會(huì)顯著提高患者的死亡率[2]。而缺血性腦卒中所致的心肌損傷臨床治療規(guī)范性不足，因此迫切需要尋找安全有效的治療藥物。目前認(rèn)為腦缺血致心肌損傷機(jī)制可能與免疫反應(yīng)有關(guān)，腦缺血后通過(guò)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起全身性的炎癥[3]。心肌細(xì)胞往往受累，抗炎治療可以減輕心肌損傷[4]。天麻素(gastrodin)分離提取自中藥天麻，被廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的治療，其抗炎活性可以有效減少心肌細(xì)胞凋亡[5]。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的一種分泌型糖蛋白，可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育、存活和再生[6]，這種調(diào)節(jié)作用主要是通過(guò)結(jié)合高親和力酪氨酸激酶 A(tropomyosin-related kinase A，TrkA)受體產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的[7]。NGF/TrkA可表達(dá)于心肌細(xì)胞中，并且參與心肌梗塞后心肌細(xì)胞的損傷修復(fù)[8]，同時(shí)還參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)[9]。因此天麻素是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)NGF/TrkA緩解腦缺血所致的心肌損傷還有待進(jìn)一步明確。本研究通過(guò)大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)法制備腦缺血大鼠模型，探討天麻素和NGF/TrkA對(duì)腦缺血后心肌損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重200～230 g，購(gòu)買于青龍山動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[合格證號(hào)：SCXK(浙)2019-0002]。遵照中華人民共和國(guó)科技部頒布的2006年版《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》及倫理學(xué)規(guī)定完成實(shí)驗(yàn)中對(duì)大鼠的各種處理。

1.2 主要藥物與試劑 天麻素注射液(天遼，規(guī)格：5 ml：500 mg，西南藥業(yè)股份有限公司)，SABC免疫組化試劑盒、蘇木精-伊紅(hematoxylin-esion，HE) 染色試劑盒、大鼠NGF抗體、大鼠TrkA抗體均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司(貨號(hào)分別為：SA1022、AR1180、BM4100、BA0404)，大鼠TNF-α和IL-10 ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于蘇州卡爾文生物科技有限公司(貨號(hào)分別為：CK-E30635R、CK-E30651R)。

1.3 主要儀器 MCAO線栓(型號(hào)：2432A2，北京西濃科技有限公司)，石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)，Western blot相關(guān)儀器(美國(guó) Bio-Rad公司)，生物顯微鏡(型號(hào)：BX51，日本OLYMPUS公司)。

1.4 研究方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 40只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為4組：正常組(Norm組)、假手術(shù)組(Sham組)、模型組(MCAO組)和天麻素組(Gas組)，每組10只。

1.4.2 模型制備 應(yīng)用MCAO法制備右側(cè)局灶性腦缺血大鼠模型，隔夜禁食的大鼠用戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射進(jìn)行麻醉，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程使大鼠肛溫保持在(37±1) ℃，在頸部作一中線切口，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈的近心端，將線栓由頸內(nèi)動(dòng)脈插入約17.5～18.5 mm至阻力出現(xiàn)，確保線栓到達(dá)大腦中動(dòng)脈起始處后結(jié)扎線栓。假手術(shù)組僅暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，不結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈，不插線栓。結(jié)束手術(shù)后，將大鼠置于適宜溫度，待其完全蘇醒，對(duì)其神經(jīng)功能狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估。如果大鼠出現(xiàn)左側(cè)肢體癱瘓、無(wú)法站立、提起尾巴向一側(cè)轉(zhuǎn)圈等癥狀，則表示造模成功。

1.4.3 干預(yù)方法 造模成功1 d后，Gas組腹腔注射天麻素注射液[10 mg/(kg·d-1)]，干預(yù)14 d。Sham組和MCAO組不進(jìn)行干預(yù)。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 干預(yù)結(jié)束后，每組大鼠取半數(shù)進(jìn)行戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，取股動(dòng)脈血，室溫自然凝固離心后(3000 r/min，10 min)，收集上清液，用于ELISA檢測(cè)。采血完成后斷頭處死，取出心臟，摘取出左心室，分成兩等份，一份用4%多聚甲醛固定，24 h后用于HE染色；另一份裝入凍存管，放入-80 ℃冰箱保存，用于 Western blot 檢測(cè)。每組另半數(shù)大鼠麻醉后將其固定于仰臥位，經(jīng)左心室用4%多聚甲醛和0.9% NaCl溶液先慢后快依次進(jìn)行灌注，取出心臟，將左心室置于4%多聚甲醛固定液中，石蠟包埋后，用于免疫組織化學(xué)染色。

1.5.1 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè) 依次將標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品和HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體加入預(yù)先包被TNF-α、IL-10抗體的包被微孔中，再進(jìn)行溫育和洗滌。最后放入酶標(biāo)儀中，選擇450 nm 波長(zhǎng)，測(cè)定吸光度(OD 值)，計(jì)算出最終樣品濃度。

1.5.2 HE染色 左心室心肌組織塊經(jīng)4%多聚甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋組織，切片后進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察各組大鼠心肌病理學(xué)改變。

1.5.3 免疫組織化學(xué)(IHC)染色 固定后的左心室心肌組織經(jīng)石蠟包埋后切片、脫蠟，用熱修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，再用山羊血清封閉液進(jìn)行封閉，滴加一抗(NGF 1∶50，TrkA 1∶100)， 4 ℃冰箱中保存過(guò)夜，滴加二抗，再滴加 SABC，再用DAB 染色，最后脫水、透明并封片。

1.5.4 Western blot (WB)檢測(cè) 首先將大鼠左心室心肌組織進(jìn)行裂解，再研磨離心后取上清液，用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。配10%的分離膠、5%的濃縮膠，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，常溫下用5%脫脂牛奶封閉，4℃冰箱中孵育一抗(NGF 1∶1000、TrkA 1∶1000、GAPDH 1∶1000)過(guò)夜，孵育二抗后曝光，最后用軟件測(cè)量并計(jì)算出蛋白相對(duì)含量。

2 結(jié)果

2.1 天麻素對(duì)大鼠心肌組織病理形態(tài)的影響 各組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果如圖1所示，正常組和假手術(shù)組心肌纖維排列有序，心肌細(xì)胞胞質(zhì)均勻豐富、間隙正常，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少；模型組心肌纖維斷裂明顯，胞質(zhì)深染，細(xì)胞間隙增大，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；天麻素治療組心肌纖維較模型組排列整齊，細(xì)胞間隙減小，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。

圖1 各組大鼠心肌組織病理形態(tài) (HE 染色，×200)

2.2 天麻素對(duì)大鼠動(dòng)脈血清中炎癥因子含量的影響 ELISA檢測(cè)各組大鼠動(dòng)脈血清炎癥因子TNF-α的含量，結(jié)果如圖2A所示，與正常組和假手術(shù)組相比，模型組大鼠TNF-α的濃度明顯增高(P<0.01)。與模型組相比，天麻素治療組則可以明顯抑制TNF-α的升高(P<0.01)。ELISA檢測(cè)各組大鼠動(dòng)脈血清炎癥因子IL-10的含量，結(jié)果如圖2B所示，與正常組和假手術(shù)組相比，模型組大鼠IL-10濃度未見(jiàn)明顯增高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而天麻素治療組大鼠IL-10濃度有較大程度的增高(P<0.01)。

A：TNF-α的含量；B：IL-10的含量(n=5) ；與Norm組和Sham組相比，**P<0.01；與MCAO組相比，##P<0.01。

2.3 免疫組化法觀察天麻素對(duì)大鼠心肌組織中NGF與TrkA表達(dá)的影響 免疫組化染色檢測(cè)各組大鼠心肌組織NGF和TrkA免疫陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)，結(jié)果如圖3A所示。與正常組和假手術(shù)組相比，模型組和天麻素治療組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量均增高(P<0.01)，見(jiàn)圖3B、圖3C。與模型組相比，天麻素治療組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量進(jìn)一步增高(P<0.01)，見(jiàn)圖3B、圖3C。

2.4 Western blot 觀察天麻素對(duì)大鼠心肌組織NGF與TrkA蛋白表達(dá)的影響 Western blot 檢測(cè)各組大鼠心肌組織NGF和TrkA蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖4所示。與正常組和假手術(shù)組相比，模型組(P<0.05)和天麻素治療組(P<0.01)大鼠心肌組織NGF與TrkA的蛋白表達(dá)均增加；與模型組相比，天麻素治療組大鼠心肌組織NGF(P<0.05)與TrkA(P<0.01)蛋白表達(dá)均進(jìn)一步增加。

A：Western blot 檢測(cè)NGF和TrkA蛋白表達(dá)情況；B：NGF蛋白相對(duì)表達(dá)量；C：TrkA蛋白相對(duì)表達(dá)量(n=5)；與Norm組和Sham組相比，*P<0.05，**P<0.01；與MCAO組相比，#P<0.05，##P<0.01。

A：免疫組化檢測(cè)NGF和TrkA的表達(dá)情況(×400)；B：NGF的平均光密度值；C：TrkA的平均光密度值(n=5)；與Norm組和Sham組相比，**P<0.01；與MCAO組相比，##P<0.01。

3 討論

心肌損傷是缺血性腦卒中患者最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，這一并發(fā)癥的發(fā)生使得腦卒中患者死亡率大大增加，而缺血性腦卒中致心肌損傷與機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)[3]，近期研究表明抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)過(guò)程可以有效減輕心肌損傷程度[4]。天麻素是中藥天麻的提取物，具有抗炎和抗氧化作用，可以減輕小鼠腦缺血損傷[10-11]及過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷[12]；可以通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路抑制小膠質(zhì)細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)[13]；可以通過(guò)上調(diào) MiR-103減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞炎癥損傷[14]；天麻素還可通過(guò)激活PI3K/Akt途徑、抑制核因子κB(NF-κB)和MAPKs通路活性保護(hù)脂多糖誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞的炎性損傷[5]。

炎癥細(xì)胞因子包括促炎和抗炎細(xì)胞因子，其中TNF-α是主要的促炎細(xì)胞因子之一，其與腦缺血致心肌損傷的發(fā)病過(guò)程密切相關(guān)，可引起心肌細(xì)胞的凋亡[15]；IL-10是關(guān)鍵的抗炎細(xì)胞因子，在抑制炎癥反應(yīng)中起重要作用。研究表明，鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ可以通過(guò)調(diào)控IL-10的表達(dá)水平來(lái)減輕脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[16]。在本研究中發(fā)現(xiàn)天麻素對(duì)大鼠動(dòng)脈血清中TNF-α的產(chǎn)生具有抑制作用，而對(duì)IL-10的產(chǎn)生具有明顯促進(jìn)作用。與此同時(shí)HE染色檢測(cè)大鼠心肌組織病理形態(tài)，顯示模型組出現(xiàn)了心肌纖維斷裂，心肌細(xì)胞胞質(zhì)深染，且有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；而天麻素治療組大鼠心肌組織纖維斷裂得到部分修復(fù)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)也大大減少。以上結(jié)果提示天麻素可以通過(guò)上調(diào)血液中抗炎細(xì)胞因子IL-10的濃度、下調(diào)促炎細(xì)胞因子TNF-α的濃度而發(fā)揮抗炎作用，從而保護(hù)腦缺血后受損傷的心肌細(xì)胞。

NGF不僅與神經(jīng)元的生長(zhǎng)有關(guān)，還與心肌組織中血管生成和細(xì)胞的存活有關(guān)[8]，甚至可以作為重要媒介參與神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的相互調(diào)節(jié)[9]。研究表明實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)大鼠NGF水平的上調(diào)，可使腦組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，神經(jīng)損害得到有效控制[17-18]。因此NGF在炎癥性疾病中可以發(fā)揮重要的抗炎作用，這與其對(duì)炎癥因子的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。NGF與其功能性受體TrkA結(jié)合后可以抑制NF-κB通路的活性，使促炎細(xì)胞因子TNF-α產(chǎn)生減少[19]；促進(jìn)PI3K/Akt途徑的活性，使抗炎細(xì)胞因子IL-10產(chǎn)生增加[20]。這與本研究中天麻素治療組結(jié)果一致，免疫組化染色及Western Blot實(shí)驗(yàn)均顯示天麻素治療組大鼠NGF與TrkA表達(dá)水平均上升，ELISA檢測(cè)顯示血TNF-α減少，IL-10升高，因此天麻素對(duì)炎性因子的調(diào)節(jié)可能是通過(guò)上調(diào)NGF/TrkA的水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

本研究還發(fā)現(xiàn)模型組大鼠雖然NGF與TrkA表達(dá)水平上升，但相較于天麻素治療組大鼠上升程度較低，且血液中炎性因子的變化與之相反，即TNF-α水平較高、IL-10水平較低，炎癥反應(yīng)更明顯，心肌損傷也較嚴(yán)重。說(shuō)明NGF與TrkA表達(dá)量不同，對(duì)體內(nèi)炎癥細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用也不同，進(jìn)而影響心肌炎癥性損傷的修復(fù)效果。研究表明，NGF的表達(dá)量與IL-10的水平存在正向相關(guān)關(guān)系，NGF劑量越大，越能上調(diào)IL-10的水平[21]。因此推測(cè)模型組NGF與TrkA的上調(diào)可能是機(jī)體的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，但由于上調(diào)的劑量不足，使得抗炎細(xì)胞因子IL-10升高水平不夠，未能抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng)。而天麻素治療組較大程度地上調(diào)了NGF/TrkA的劑量，使得IL-10的水平明顯升高，同時(shí)TNF-α水平下降，從而對(duì)腦缺血后心肌組織的炎性損傷進(jìn)行保護(hù)。

綜上所述，天麻素可以修復(fù)腦缺血所致的炎癥性心肌損傷，可能與調(diào)節(jié)大鼠心肌組織中NGF/TrkA的表達(dá)、血清中TNF-α和IL-10的水平有關(guān)，這為缺血性腦卒中患者心肌損傷的臨床治療提供了一定思路。