王曉， 黃曉平， 黎玲， 劉嘉， 刁勇

(1. 華僑大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 福建 泉州 362021； 2. 泉州師范學(xué)院 化工與材料學(xué)院， 福建 泉州 362000)

腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)是一種無包膜、單鏈的DNA病毒，需要腺病毒或單純皰疹病毒輔助才可進行復(fù)制，AAV基因組可以在細胞和組織中長期存在，迄今未發(fā)現(xiàn)AAV與任何人類疾病相關(guān)[1-2].而重組AAV(recombinant adeno-associated virus，rAAV)載體，因具有免疫原性小、宿主范圍廣、理化性質(zhì)穩(wěn)定、能長期表達外源基因等優(yōu)點，被公認為是基因治療的理想載體[3-4].2017年12月，以rAAV為載體治療遺傳性視網(wǎng)膜病變的基因藥物L(fēng)uxturna在美國上市，這無疑給以rAAV為載體的基因治療帶來了前所未有的光明[5-7].

但在臨床實驗中，rAAV也遇到表達效率低的問題，提高rAAV的表達效率成為基因治療領(lǐng)域需解決的一個問題[8-9].血清型篩選、衣殼蛋白突變和修飾、基因組改造等生物技術(shù)在提高表達效率方面取得了一定進展[10-11].除了生物技術(shù)策略外，現(xiàn)已有多種非生物技術(shù)策略可提高rAAV載體表達效率，如DNA損傷劑(紫外線、γ-射線、順鉑)、泛素蛋白酶體抑制劑(MG132，LnLL)、DNA合成酶抑制劑(巴菲敵柯林、羥基脲)、DNA拓撲異構(gòu)酶抑制劑(喜樹堿、依托泊苷)等[12-14].這些手段可以影響rAAV載體在細胞質(zhì)內(nèi)的傳遞，或影響其在核內(nèi)的行為，在表達效率優(yōu)化方面表現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景.

氧化應(yīng)激會造成生物膜不飽和脂肪酸過氧化、DNA損傷等，而DNA損傷劑已證實可促進rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)，但氧化應(yīng)激促進rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)的機制目前尚未研究清楚.在細胞中，過氧化氫(H2O2)的初始產(chǎn)物通常認為是活性氧(ROS)或超氧陰離子，H2O2也被認為是活性氧中間體(ROI)介導(dǎo)的細胞損傷的關(guān)鍵物質(zhì).H2O2產(chǎn)物羥基自由基(HO·)可以氧化DNA、蛋白質(zhì)和膜脂質(zhì)，導(dǎo)致細胞損傷.本文以重組腺相關(guān)病毒2型(rAAV2)為材料，研究H2O2和鐵過載(Fe-NTA)處理前、后，細胞中rAAV2轉(zhuǎn)基因表達量、陽性細胞數(shù)和基因組數(shù)目的變化，從ROS角度揭示氧化應(yīng)激促進rAAV2轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機制.

1 材料與方法

1.1 材料

聚乙烯亞胺(PEI，美國Polysciences公司)；蛋白羅丹明標(biāo)記試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)；超氧化物陰離子熒光探針(Dihydroethidium，美國Invitrogen公司)；硝酸鐵(Fe(NO3)3)、次氮基三乙酸(NTA)、H2O2(美國Amresco公司)；DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)；核酸酶Benzonase(德國Merk公司)；DNeasy Blood & Tissue試劑盒(德國QIAGEN公司)；Sybr Green Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司).

1.2 rAAV2載體的制備

參照本實驗室的rAAV制備方法[15-16]：待293T細胞密度達到85%時，將三質(zhì)粒與PEI按照質(zhì)量比為1∶3進行混合后共轉(zhuǎn)染293T細胞；轉(zhuǎn)染72 h后收獲細胞，裂解并用Benzonase處理；氯化銫密度梯度離心分離、透析和濃縮制備符合實驗要求的rAAV2載體；最后，進行實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)分析.

1.3 rAAV2載體的標(biāo)記

參考文獻[17]的方法，利用蛋白羅丹明標(biāo)記試劑盒對rAAV2進行四甲基羅丹明(TAMRA)的熒光標(biāo)記，并用于共聚焦成像.將物質(zhì)的量比為1∶5 000的rAAV2載體和mono-NHS-TAMRA分子在室溫下孵育45 min，然后通過SpinOUT GT-600型色譜柱去除未結(jié)合的染料，再利用qPCR對rAAV2進行定量分析.H2O2刺激Hela細胞12 h后，TAMRA-rAAV2以感染復(fù)數(shù)(MOI)為1∶2 000轉(zhuǎn)導(dǎo)Hela細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次；采用質(zhì)量濃度為0.04 g·mL-1的多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌2次，再用雙蒸水洗滌；最后，用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)進行復(fù)染，利用Zeiss LSM 710型激光共聚焦顯微鏡分析TAMRA-rAAV2病毒載體的亞細胞定位.

1.4 轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗

按照每孔1×105個將細胞接種至24孔板，根據(jù)設(shè)置的時間在轉(zhuǎn)導(dǎo)前進行氧化應(yīng)激，隨后用表達熒光素酶(Gaussia luciferase，Gluc)或綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)轉(zhuǎn)基因的rAAV2進行轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)導(dǎo)后利用IncuCyte實時動態(tài)細胞成像分析系統(tǒng)檢測陽性細胞數(shù)、熒光強度或取上清測定Gluc的表達量.

1.5 rAAV2基因組提取和qPCR定量

rAAV2轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞12 h后，通過胰蛋白酶消化收集細胞，利用DNeasy Blood & Tissue試劑盒收集總DNA，采用qPCR方法分析rAAV2基因組數(shù)目，按照文獻[18]的方法進行病毒基因組定量.以GFP(正向引物，5′-GAGCGCACCATCTTCTTCAA-3′；反向引物，5′-TCCTTGAAGTCGATGCCCTT-3′)、Gluc(正向引物，5′-AATGCCCGGAAAGCTGGCTG-3′；反向引物，5′-CGATGAACTGCTCCATGGGC-3′)、人β肌動蛋白(正向引物，5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3；反向引物，5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′)為引物，以Sybr Green Master Mix為染料進行qPCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃，2 min，之后按95 ℃，10 s；60 ℃，10 s；72 ℃，10 s循環(huán)40次.

1.6 H2O2應(yīng)激模型

以每孔4.0×103個細胞接種于96 孔板，細胞貼壁后，加入終濃度分別為25，50，100，200，400，800 μmol·L-1的H2O2，按照設(shè)定的時間進行rAAV2轉(zhuǎn)導(dǎo)，利用IncuCyte實時動態(tài)細胞成像分析系統(tǒng)監(jiān)測細胞中綠色熒光表達情況，統(tǒng)計分析陽性細胞數(shù)和熒光強度.

1.7 Fe-NTA應(yīng)激模型

參照文獻[19]的方法，取20 mL 100 mmol·L-1Fe(NO3)3溶液與20 mL 300 mmol L-1NTA溶液混合，用1 mol·L-1碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)至pH=7.4，定容至100 mL，配成20 mmol·L-1的Fe-NTA母液.以每孔4.0×103個細胞接種于96孔板，細胞貼壁后，加入終濃度分別為12.5，25.0，50.0，100.0，200.0，400.0 μmol·L-1的Fe-NTA溶液，按照設(shè)定的時間和MOI進行rAAV2轉(zhuǎn)導(dǎo)，利用IncuCyte實時動態(tài)細胞成像分析系統(tǒng)監(jiān)測細胞中綠色熒光表達情況，統(tǒng)計分析陽性細胞數(shù)和熒光強度.

1.8 細胞內(nèi)ROS檢測

細胞經(jīng)過氧化應(yīng)激和轉(zhuǎn)導(dǎo)處理后，去除培養(yǎng)液，用PBS沖洗2 遍；然后，加入10 μmol·L-1超氧化物陰離子熒光探針(Dihydroethidium，DHE)工作液，37 ℃孵育60 min，用PBS清洗2 遍；熒光顯微鏡觀察拍照，利用Image-Pro Plus軟件進行熒光強度分析.

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(x±s)表示，結(jié)果采用SPSS統(tǒng)計學(xué)分析，*P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，**P<0.01表示差異極具統(tǒng)計學(xué)意義.

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 H2O2和Fe-NTA對細胞活力的影響

氧化應(yīng)激對細胞活力的影響，如圖1所示.圖1中：c為濃度；η為細胞活力.

(a) H2O2 (b) Fe-NTA圖1 氧化應(yīng)激對細胞活力的影響Fig.1 Effect of oxidative stress on cell viability

由圖1(a)可知：當(dāng)加入的H2O2濃度c(H2O2)=400 μmol·L-1時，細胞活力為(86.3±4.3)%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；當(dāng)c(H2O2)=800 μmol·L-1時，細胞活力為(65.7±3.9)%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；而當(dāng)c(H2O2)=200 μmol·L-1時，細胞活力為(93.6±3.9)%，與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義.

由圖1(b)可知：當(dāng)c(Fe-NTA)=400.0 μmol·L-1時，細胞活力為(84.6±4.6)%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；而c(Fe-NTA)=200.0 μmol·L-1時，細胞活力為(92.9±5.4)%，與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義.

2.2 H2O2促進rAA2轉(zhuǎn)導(dǎo)

不同細胞中添加H2O2對rAAV2轉(zhuǎn)基因表達的影響，如圖2所示.圖2中：N1為不同H2O2濃度處理組rAAV2轉(zhuǎn)基因表達量與對照組rAAV2轉(zhuǎn)基因表達量的比值.由圖2可知：H2O2能夠促進rAAV2轉(zhuǎn)基因在293T細胞中表達，隨著H2O2濃度的增高，Gluc的表達量增大，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.50 μmol·L-1組Gluc的表達量是對照組的1.4倍；100 μmol·L-1組Gluc的表達量是對照組的2.5倍；200 μmol·L-1組Gluc的表達量是對照組的3.6倍(圖2(a)).在LO-2，Hela，A549細胞中，H2O2均能促進rAAV轉(zhuǎn)基因的表達，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2(b)～(d)).

(a) 293T細胞 (b) LO-2細胞

(c) Hela細胞 (d) A549細胞圖2 不同細胞中添加H2O2對rAAV2轉(zhuǎn)基因表達的影響Fig.2 Effects of adding H2O2 in different cells on rAAV2 transgene expression

不同H2O2濃度對rAAV2轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，如圖3所示.圖3中：n為GFP陽性表達細胞數(shù)；N2為不同H2O2濃度處理組病毒基因組數(shù)與對照組病毒基因組數(shù)的比值.圖3(a)～(e)為GFP陽性表達細胞及其數(shù)量的統(tǒng)計結(jié)果.由圖3(e)可知：H2O2處理組陽性表達細胞數(shù)與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；當(dāng)H2O2濃度分別為50，100，200 μmol·L-1時，其陽性表達細胞數(shù)分別為(183±16)，(248±22)，(421±25)個·mm-2.rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞12 h后提取基因組的結(jié)果，如圖3(f)所示.由圖3(f)可知：H2O2氧化應(yīng)激處理組的基因組數(shù)明顯比對照組多；濃度為50，100，200 μmol·L-1H2O2處理組的基因組數(shù)分別是對照組的(1.55±0.21)，(2.33±0.25)，(3.28±0.25)倍.

(a) 對照組 (b) c(H2O2)=50 μmol·L-1

(c) c(H2O2)=100 μmol·L-1 (d) c(H2O2)=200 μmol·L-1

(e) 陽性細胞數(shù) (f) 基因組數(shù)圖3 不同H2O2濃度對rAAV2轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響Fig.3 Effects of different H2O2 concentrations on rAAV2 transduction

2.3 Fe-NTA氧化應(yīng)激促進rAAV2轉(zhuǎn)導(dǎo)

不同細胞中添加Fe-NTA對rAAV2轉(zhuǎn)基因表達的影響，如圖4所示.圖4中：N3為不同F(xiàn)e-NTA濃度處理組rAAV2轉(zhuǎn)基因表達量與對照組rAAV2轉(zhuǎn)基因表達量的比值.

(a) 293T細胞 (b) LO-2細胞

(c) Hela細胞 (d) A549細胞圖4 不同細胞添加Fe-NTA對rAAV2轉(zhuǎn)基因表達的影響Fig.4 Effects of adding Fe-NTA in different cells on rAAV2 transgene expression

由圖4可知：在293T細胞中，25 μmol·L-1Fe-NTA能促進Gluc表達，其表達量是對照組的1.5倍，50 μmol·L-1Fe-NTA促進Gluc表達量是對照組的2.3倍，100 μmol·L-1Fe-NTA促進Gluc表達量是對照組的3.6倍，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；在LO-2，Hela，A549細胞中，F(xiàn)e-NTA氧化應(yīng)激同樣能促進rAAV2轉(zhuǎn)基因表達.

不同F(xiàn)e-NTA濃度對rAAV2轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，如圖5所示.圖5中：N4為不同F(xiàn)e-NTA濃度處理組病毒基因組數(shù)與對照組病毒基因組數(shù)的比值.由圖5(a)～(e)可知：在Fe-NTA氧化模型中，25，50，100 μmol·L-1Fe-NTA處理組的GFP陽性細胞數(shù)分別為(178±14)，(288±24)，(428±28)個·mm-2，與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義.經(jīng)Fe-NTA處理后，提取細胞中rAAV2基因組進行定量分析，結(jié)果如圖5(f)所示.由圖5(f)可知：25，50，100 μmol·L-1Fe-NTA處理組的病毒基因組數(shù)目分別是對照組的(1.45±0.19)，(2.45±0.23)，(3.29±0.31)倍.

(a) 對照組 (b) c(Fe-NTA)=25 μmol·L-1

(c) c(Fe-NTA)=50 μmol·L-1 (d) c(Fe-NTA)=100 μmol·L-1

(e) 陽性細胞數(shù) (f) 基因組數(shù) 圖5 不同F(xiàn)e-NTA濃度對rAAV2轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響Fig.5 Effects of different Fe-NTA concentrations on rAAV2 transduction

2.4 ROS促使rAAV2在細胞中的積累

有研究表明，rAAV2首先轉(zhuǎn)運至核周區(qū)域的微管上，然后一部分rAAV2顆粒進入細胞核，在細胞核內(nèi)脫殼[18，20-21].利用熒光標(biāo)記的rAAV2(TAMRA-rAAV2)結(jié)合共聚焦顯微鏡的方法，對rAAV2在氧化應(yīng)激細胞中的運輸及分布進行分析.不同處理組TAMRA-rAAV2的亞細胞定位，如圖6所示.

(a) PBS處理3 h (b) PBS處理6 h (c) PBS處理12 h (d) PBS處理24 h

(e) H2O2處理3 h (f) H2O2處理6 h (g) H2O2處理12 h (h) H2O2處理24 h圖6 不同處理組TAMRA-rAAV2的亞細胞定位Fig.6 Subcellular localization of TAMRA-rAAV2 in different treatment groups

由圖6可知：在轉(zhuǎn)導(dǎo)后3 h，對照組和H2O2處理組的TAMRA-rAAV2在細胞內(nèi)的定位差異非常小(圖6(a)，(e))；然而，轉(zhuǎn)導(dǎo)后6 h，對照組細胞核周圍有一些TAMRA-rAAV2載體聚集(圖6(b))，但H2O2處理的細胞中TAMRA-rAAV2載體在核周的積累量更多(圖6(f))；轉(zhuǎn)導(dǎo)后12 h，對照組TAMRA-rAAV2載體急劇減少(圖6(c))，而H2O2處理組TAMRA-rAAV2載體聚集在核孔附近(圖6(g))；轉(zhuǎn)導(dǎo)后24 h，這種作用更加明顯，對照組的細胞中幾乎沒有殘留TAMRA-rAAV2病毒載體(圖6(d))，而H2O2處理的細胞中仍然有TAMRA-rAAV2載體在核周區(qū)域聚集(圖6(h)).這些數(shù)據(jù)表明，H2O2可防止轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中細胞內(nèi)rAAV2的損失.

氧化應(yīng)激過程會產(chǎn)生大量的ROS，ROS被認為是氧化應(yīng)激對細胞產(chǎn)生損傷的主要物質(zhì)，而ROS是否是促進rAAV2轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要物質(zhì)還需進一步驗證.不同F(xiàn)e-NTA濃度對ROS產(chǎn)生的影響，如圖7所示.圖7中：RLU為相對光單位.由圖7可知：Fe-NTA處理后的細胞都會在細胞內(nèi)形成ROS，而且隨著Fe-NTA濃度的增大，熒光強度增高，細胞中ROS水平增高.

(a) 對照組 (b) c(Fe-NTA)=25 μmol·L-1 (c) c(Fe-NTA)=50 μmol·L-1

用N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)清除細胞內(nèi)ROS，考察ROS是否介導(dǎo)rAAV2轉(zhuǎn)導(dǎo)，結(jié)果如圖8所示.由圖8可知：H2O2誘導(dǎo)生成的ROS隨著NAC濃度的增大而逐漸減少，其中，10 mmol·L-1NAC處理后細胞內(nèi)的ROS水平與對照組相比， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義； 而陽性細胞數(shù)目和GFP表達量也隨著NAC濃度的增大而逐漸減少.結(jié)果表明，H2O2通過ROS的形成介導(dǎo)促進rAAV2轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少rAAV2在細胞運輸過程中的損失，從而促進了rAAV2的轉(zhuǎn)導(dǎo).

(a) 對照組 (b) H2O2 (c) H2O2+1 mmol·L-1 NAC

(d) H2O2+5 mmol·L-1 NAC (e) H2O2+10 mmol·L-1 NAC

(f) ROS定量分析 (g) 陽性細胞數(shù)目 (h) GFP熒光強度圖8 ROS對rAAV2轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響Fig.8 Effect of ROS on rAAV2 transduction

3 結(jié)論

研究H2O2和Fe-NTA兩種氧化應(yīng)激對rAAV2體外轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，實驗結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激能夠促進rAAV2轉(zhuǎn)導(dǎo)，在293T，LO-2，Hela和A549細胞中，其表達GFP細胞數(shù)、Gluc表達量、病毒基因組數(shù)等與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義；H2O2處理后，rAAV2在胞質(zhì)內(nèi)明顯增多，且長時間聚集在核周圍；當(dāng)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS被NAC清除時，H2O2促進rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)作用明顯減弱，說明ROS是H2O2促進rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要物質(zhì).

rAAV2進入細胞后首先被網(wǎng)格蛋白包裹進入細胞，形成早期內(nèi)含體、晚期內(nèi)含體、蛋白酶體，最終進入細胞核，脫殼、單鏈合成雙鏈[14].氧化應(yīng)激能夠激活細胞中的p53，NF-κB，JNKNF-κB等信號通路，電離輻射、紫外線激活NF-κB，激活的NF-κB能夠增強與DNA結(jié)合力和激活蛋白磷酸酶/激酶途徑，促進rAAV2的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而NAC在電離輻射和紫外線暴露后能阻止NF-κB的活化，對rAAV2轉(zhuǎn)導(dǎo)無明顯作用[22]，電離輻射產(chǎn)生的ROS可能是促進rAAV2轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要因素.實驗進一步證實，ROS越多，則促轉(zhuǎn)導(dǎo)能力越強，ROS促使rAAV2在細胞核周圍聚集的時間越長，說明ROS在rAAV2轉(zhuǎn)導(dǎo)過程可以防止rAAV2被清除.

研究證實，H2O2和Fe-NTA氧化應(yīng)激模型可促進rAAV2轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進轉(zhuǎn)基因的表達、增加細胞中病毒基因組數(shù)目等，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS可延長rAAV2在細胞核周聚集，延緩rAAV2的降解，揭示了氧化應(yīng)激促使rAAV2轉(zhuǎn)導(dǎo)的機制，為體外提高rAAV2轉(zhuǎn)導(dǎo)提供方法.