胚胎發(fā)育是由多因素參與、由多階段組成的復雜的生理過程，其中任何一個階段受到干擾，都可能導致先天性畸形和異常的病理現(xiàn)象。牙齒發(fā)育異常是其中較為常見的表型，如果誘導牙齒發(fā)育形成的生理過程受到干擾，將會導致牙齒大小、位置、結(jié)構(gòu)和數(shù)量的異常

。

選擇性先天缺牙（selective toothagenesis）指因遺傳因素導致的非綜合征型或綜合征型先天性牙缺失。國際疾病分類第11 次修訂本（ICD-11）依據(jù)恒牙缺失數(shù)目（不含第三磨牙），將先天缺牙分為3 類，包括Ⅰ型先天缺牙（即少數(shù)牙缺失，缺牙數(shù)目＜6）（hypodontia）、Ⅱ型先天缺牙（即多數(shù)牙缺失，缺牙數(shù)目≥6）（oligodontia）和Ⅲ型先天缺牙（即全口無牙）（anodontia）；Ⅱ型或Ⅲ型的缺牙患者被認為是重度缺牙。重度先天缺牙的患者，牙列的缺損甚至缺失會帶來咀嚼效率低下、語音問題和顏面美觀問題等諸多困擾，嚴重影響患者的身心健康。

測試前三份問卷裝訂成冊。得到被試班級班主任協(xié)助后，以班級為單位進行團體施測。測試者采用統(tǒng)一指導語向被試說明填寫要求。被試簽知情同意書后在課堂上統(tǒng)一完成測試當堂收回。

無論是哪一種類型的先天缺牙，遺傳因素都是主要的致病原因

。隨著分子遺傳學技術(shù)的發(fā)展以及研究相關(guān)的動物模型，軸抑制蛋白基因2（axis inhibition protein 2，AXIN2）基因

、外異蛋白（ectodysplasin，EDA）基因

、肌節(jié)同源異性盒基因1（muscle segment homeobox gene 1，MSX1）基因

、配對盒基因9（paired box 9，PAX9）基因

和Wingless-type MMTV integration site family member 10A（WNT10A）基因

已被證實與非綜合征型的先天缺牙有關(guān)。上述基因的突變導致所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響蛋白的正常功能及/或與其他蛋白的相互作用，最終影響成牙相關(guān)細胞和器官，導致牙齒缺失。

Wnt 信號分子在胚胎發(fā)育過程中對多種細胞和器官的增殖分化有重要作用

。Wnt 蛋白通過卷曲跨膜受體（frizzled transmembrane receptors，F(xiàn)z）和共受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6）發(fā)出信號，激活下游β-catenin 依賴的經(jīng)典通路

或β-catenin不依賴的非經(jīng)典通路

，后者包括平面細胞極性通路和Wnt/Ca

通路。牙上皮細胞分泌的Wnt 蛋白（包括Wnt4、Wnt6 和Wnt10）對牙齒發(fā)育十分重要，該過程若受到干擾將破壞Wnt/β-catenin 通路活性，導致牙齒在帽狀期早期發(fā)育停滯。Wnt10A蛋白在牙上皮細胞和間充質(zhì)中表達，WNT10A 基因的突變已在多種外胚層發(fā)育不良綜合征的病例中被報道

，包括牙-指-真皮發(fā)育不良（odonto-onycho-dermal dysplasia，OODD）和Schopf-Schulz-Passarge 綜合征（SSPS），上述兩種綜合征患者可以出現(xiàn)重度先天缺牙和甲發(fā)育不良等相同表型。同時，WNT10A 也是非綜合征型的先天缺牙的主要候選基因

。

其實，這跟年歲一點關(guān)系都沒有。央視有個足球評論員叫張路，說球說了三十多年。我小時候，他就在激情澎湃地說意甲，如今還在激情澎湃地說球，一口氣說出那么多球員的名字，這得多好的記憶力啊。老了的張路先生，依然顯得年輕，依然帥氣，也只有活在自我情趣中的人，才會這么年輕吧。

1 資料和方法

1.1 病例收集

本研究對象為就診于上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院口腔種植科和口腔第二門診的先天性牙缺失患者。通過詢問患者病史、家族遺傳史，口腔檢查及拍攝曲面體層片、根尖片確定研究對象的缺牙數(shù)目、位點。研究對象及其家庭成員均簽署知情同意書。本研究遵照《赫爾辛基宣言》進行，并獲得上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院倫理委員會批準（編號：SH9H-2021-T-340-2）。

1.2 全外顯子測序

本研究對先證者進行全外顯子測序。使用全血基因組DNA 提取試劑盒（Qiagen，美國）并根據(jù)使用說明從外周血樣中提取DNA。使用SureSelect人全外顯子探診試劑盒V6（Agilent，美國）采集DNA 樣品并根據(jù)使用說明在Illumina Hiseq 2000 平臺（Illumina，美國）進行測序。原始數(shù)據(jù)在進行堿基識別和樣品解復用后，以Paired FASTQ 文件進行存儲。

1.3 突變位點過濾和篩選

運用Genome Analysis Toolkit（GATK，Broad Institute，美國）軟件分析測序數(shù)據(jù)以生成先證者基因型。突變位點根據(jù)下列標準進行篩選：①保留位于外顯子區(qū)域的突變位點；②排除同義突變的位點；③排除未報道的序列片段插入/刪除；④保留在Exome Aggregation Consortium（ExAC，http://exac.broadinstitute.org），the 1000 Genome Browsers（1000G）和中國國家基因庫生命大數(shù)據(jù)平臺（CMDB，https://db.cngb.org/cmdb/）中最小等位基因頻率（Minor Allele Frequency，MAF）≤0.05 的突變位點。

一是明確村委會在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域PPP項目運行中的職責。我國《民法總則》第101條賦予農(nóng)村集體經(jīng)濟組織特別法人的主體地位，并規(guī)定在尚未建立農(nóng)村集體經(jīng)濟組織的情形下，村委會可以代行農(nóng)村集體經(jīng)濟組織的職責。據(jù)此，村委會在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域PPP項目中既不能成為社會資本方的附庸，也不能完全等同于農(nóng)民群體，而要代表農(nóng)民群體的利益與政府和社會資本方合作。具體而言，村委會在項目前期主要負責與項目落地有關(guān)的談判、準備工作；在項目運營過程中主要負責資源協(xié)調(diào)、履約監(jiān)督等工作；在項目后期主要負責資產(chǎn)的清算與受領(lǐng)等工作。

1.4 聚合酶鏈式反應(yīng)及Sanger 測序

使用引物設(shè)計軟件Snapgene（Insightful Science，美國）設(shè)計涵蓋WNT10A 基因編碼區(qū)外顯子的引物，對先證者及其家系成員DNA 進行聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后進行Sanger 測序（擎科生物科技有限公司，中國）。使用Chromas 軟件（Technelysium，澳大利亞）對DNA 序列峰圖進行分析。

例如古詩《鄉(xiāng)村四月》，教師引讀：鄉(xiāng)村的四月山陵和原野上到處是一片綠色，稻田里的水色映照著天空的光輝，是水天一色的白。學生讀：綠遍山原白滿川。教師讀：杜鵑鳥在如煙的蒙蒙細雨中一聲一聲地啼叫。學生讀：子規(guī)聲里雨如煙。教師讀：怎么四月的鄉(xiāng)村不見人呢？原來是在干農(nóng)活，才收了蠶桑絲，又去了稻田插秧。學生讀：鄉(xiāng)村四月閑人少，才了蠶桑又插田。這樣可以讓學生在理解詩歌意思的同時，記住詩句。

1.5 突變蛋白功能預測及致病性分級

使用在線軟件Polyphen-2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）、Mutation Taster（https://www.mutationtaster.org/）和Provean（http://provean.jcvi.org/index.php）分別對檢測、篩選出的WNT10A 基因突變進行蛋白質(zhì)功能預測和致病性評估。

1.6 保守性分析及蛋白結(jié)構(gòu)預測

通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）獲得不同物種的Wnt10A 蛋白序列的FASTA 格式數(shù)據(jù)。使用在線軟件T-Coffee（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/）對檢測出的Wnt10A 蛋白突變位點進行保守性分析。

6 例患者中，先證者#4 無恒牙，為Ⅲ型先天缺牙，即全口無牙癥患者；先證者#208 上下頜僅各存留一顆恒磨牙。其余4 位先證者缺牙數(shù)目從6 ～14 顆不等。

通過在線軟件Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）對Wnt10A 蛋白進行同源建模，預測其三維結(jié)構(gòu)。將模板導入到在線 軟 件 Missense3D（http://missense3d.bc.ic.ac.uk/～missense3d/），預測位點突變后的Wnt10A 蛋白結(jié)構(gòu)變化。

該故障案例中，已確認是動力電池內(nèi)部局部損壞，因一時沒有單體電池供應(yīng)，只能更換動力電池總成，更換后該車故障排除。

1.7 種植修復設(shè)計與實施

針對患者的缺牙數(shù)目、部位、間隙、軟硬組織缺損情況進行種植修復方案的設(shè)計。其中，對于無天然恒牙上頜或僅存留極個別畸形天然恒牙且伴有上頜骨發(fā)育性重度萎縮的患者進行顴種植修復。其余患者行常規(guī)種植修復。記錄愈合期種植體成功率，同時在種植修復完成后，對患者進行定期隨訪，記錄種植體的留存率及相關(guān)并發(fā)癥。

2 結(jié) 果

2.1 突變位點檢測及功能預測

梁、王兩人尋碑、拓碑事俱見《嘉泰會稽志》卷十六《碑刻·秦頌德碑》。也可以參考紹興叢書第一輯(地方志叢編①)〔M〕，北京：中華書局，2006，307。

目前，Clinvar 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar）已收錄了200 余種類型的WNT10A 基因突變，新的WNT10A 基因突變?nèi)杂写l(fā)現(xiàn)以豐富突變譜，為產(chǎn)前診斷和遺傳診斷提供新的證據(jù)。本研究擬對近年來在臨床治療中收集到的重度先天缺牙患者進行WNT10A 基因突變篩查以發(fā)現(xiàn)新突變，并隨訪觀察其中這類患者的種植修復療效。

對6 位先證者的家系中可獲得的成員進行WNT10A 基因突變檢測，可發(fā)現(xiàn)有4 位先證者的母親或父親能檢測到與先證者一致的WNT10A 基因突變（圖1）。

本研究納入6 例無血緣關(guān)系的WNT10A 基因突變的重度先天缺牙患者，分別攜帶5 個WNT10A基因突變，包括3 個錯義突變、1 個無義突變和1 個移碼突變。其中，先證者#184 和#203 攜帶相同的WNT10A 基因突變c.1036delT（p.Cys346fs）。在檢出的5 種突變中，有2 種為未見報道的新檢出突變。綜合運用Polyphen-2、Mutation Taster 和Provean預測突變蛋白的功能影響，發(fā)現(xiàn)這些突變表現(xiàn)出一定程度的致病性（表1）。

2.2 突變位點的保守性分析和蛋白結(jié)構(gòu)預測

在系統(tǒng)評估患者余留牙和牙槽骨情況后，先證者#4 無恒牙，為全口無牙患者，上頜采用雙側(cè)顴種植植入，結(jié)合前牙區(qū)4 枚常規(guī)種植體共同行使功能，下頜共計植入5 枚常規(guī)種植體行種植體支持固定修復；先證者#208 上下頜僅各存留一枚恒磨牙，上頜采用雙側(cè)雙顴種植修復，下頜植入5 枚常規(guī)種植體，術(shù)后實施了上下頜即刻負載，骨結(jié)合后行上下頜種植固定修復。先證者#118、#32 和#208 都通過正畸調(diào)整了缺牙間隙，共植入13 枚常規(guī)種植體，種植區(qū)域均分期或同期實施了骨增量手術(shù)（圖3）。種植體骨結(jié)合愈合期未出現(xiàn)植體松動、失敗，所有患者均按計劃完成上部結(jié)構(gòu)修復。

2.3 患者的臨床表型分析

本研究納入的6 例患者中，有5 例表現(xiàn)為單純的口內(nèi)多數(shù)恒牙先天缺失。值得注意的是，先證者#4 除典型的多數(shù)牙缺失外，還表現(xiàn)出皮膚干燥和指甲發(fā)育不良等輕微的外胚層發(fā)育不良癥狀?；颊呔幢憩F(xiàn)出牙齒形態(tài)異常。

在農(nóng)村地籍調(diào)查實際工作中，存在土地坐落、房屋坐落和通訊地址3個需要填寫地址的字段，作業(yè)人員有時會誤把身份證件上的地址填寫為土地坐落和房屋坐落的位置。如身份證件上的地址為天河區(qū)，宗地和房屋卻在從化區(qū)的情況。通過土地和房屋坐落檢測功能，實現(xiàn)快速、準確的檢查出類似錯誤，并導出為Excel表。

本研究中有5 位WNT10A 基因新突變患者接受了種植修復治療，共植入27 枚常規(guī)種植體和6 枚顴種植體。

6 例患者恒牙平均缺牙數(shù)目為（15.33 ± 8.64）顆（6 ～28 顆），其中上頜平均缺牙數(shù)目為（8 ±3.95）顆（4 ～14 顆），下頜平均失牙數(shù)目為（7.30 ±4.97）顆（2 ～14 顆）。上頜牙列中，尖牙缺失率最高，為100%，中切牙缺失率最低，為33.33%（4/12）；下頜牙列中，中切牙、側(cè)切牙和第二磨牙缺失率最高，為66.67%（8/12），第一磨牙缺失率最低，為25%（3/12）（表2）。

2.4 種植修復

由于環(huán)境中Na和Ca含量高，樣品處理過程中非常容易沾污。因此，超純水需要使用現(xiàn)接的水，樣品前處理與相應(yīng)的測定也需盡快完成。

對檢測出的3 個WNT10A 基因錯義突變位點進行保守性分析，發(fā)現(xiàn)這些位點在不同物種間均高度保守。選擇同源性置信度大于90%的結(jié)構(gòu)域模板，對錯義突變p.Ile122Phe 和p.Thr357Ile 進行蛋白三維結(jié)構(gòu)預測分析，發(fā)現(xiàn)氨基酸的替換使蛋白構(gòu)象發(fā)生了改變（圖2）。

本研究中隨訪時間最長為先證者#4，隨訪時間為8 年。其余患者隨訪時間3 至30 個月不等。隨訪期內(nèi)，6 枚顴種植體未發(fā)生機械、生物學及上頜竇相關(guān)的并發(fā)癥。27 枚常規(guī)種植體均無松動，種植體與上部修復體均在位，能行使有效功能，但有3 枚常規(guī)植體出現(xiàn)了不同程度的邊緣骨吸收（1.5 ～3 mm）（圖4）。

3 討 論

哺乳動物的牙齒發(fā)育始于位置和類型的確定，隨后經(jīng)過牙板形成、蕾狀期、帽狀期和鐘狀期等不同的形態(tài)階段，最終完成牙根的形成和牙齒的萌發(fā)。上皮和間充質(zhì)之間有序的相互作用調(diào)控著牙齒發(fā)育的整個進程，在此期間出現(xiàn)的異常會導致牙齒的缺失。分子遺傳學和動物模型的相關(guān)研究已經(jīng)證實WNT10A 基因在胚胎發(fā)育中起著重要作用，調(diào)控了帽狀期早期的牙齒發(fā)育

。

在本研究納入的6 例患者中，平均缺牙數(shù)目為（15.33 ± 8.64）顆。其中缺失率最高的牙位為上頜尖牙，6 例患者一共缺失了12 顆上頜尖牙，缺失率達到100%；缺失率最低的牙位為下頜第一磨牙，6 例患者一共缺失了3 顆下頜第一磨牙，缺失率達到25%。Van Den Boogaard 等

分析了WNT10A 基因突變的19 例非綜合征型的先天缺牙患者和11 例有輕微外胚層發(fā)育不良的患者的缺牙表型，兩類患者平均缺牙數(shù)分別為15.6 顆和15.4 顆（包括第三磨牙）。Zhou 等

分析了74 例WNT10A 基因突變的非綜合征型缺牙患者和28 例WNT10A 基因突變的綜合征型缺牙患者，患者平均缺牙數(shù)為（13.0 ± 6.2）顆。其中，上頜第二前磨牙缺失率最高，上頜中切牙缺失率最低。Van Den Boogaard等

還發(fā)現(xiàn)，缺牙數(shù)超過20 顆的重度缺牙患者中，WNT10A 基因既可能是純合突變，也可能是雜合突變。所有納入患者中，缺牙數(shù)最大為30 顆，是一位WNT10A 基因純合無義突變p.C107X 的患者；缺牙數(shù)最小為6 顆，是一位WNT10A 基因雙等位基因突變患者，包括雜合無義突變p.C107X 和雜合錯義突變p.F228I，該患者同時伴有指甲發(fā)育不良和毛發(fā)輕微卷曲的外胚層癥狀。在Zhou 等

的研究中，缺牙數(shù)超過20 顆的患者為WNT10A 基因純合缺失突變或復合雜合錯義突變。而在本研究中，缺牙數(shù)超過20 顆的患者均為WNT10A 基因純合錯義突變，這說明還需納入更多的相關(guān)病例，以更好地分析WNT10A 基因突變類型與缺牙表型的關(guān)系。

外胚層發(fā)育不良綜合征（ectodermal dysplasia）是一類以出現(xiàn)兩種及兩種以上外胚層結(jié)構(gòu)發(fā)育異常為臨床特征的遺傳性疾病。少汗型外胚層發(fā)育不良綜合征（hypohidrotic ectodermal dysplasia，HED）是外胚層發(fā)育不良綜合征最常見的亞類之一，表現(xiàn)為牙發(fā)育異常（先天缺牙）、毛發(fā)稀少、少汗或無汗等，包括前額凸出、鞍鼻、嘴唇外翻等面部畸形也常與上述臨床三聯(lián)征伴隨出現(xiàn)。HED 被報道最多的為EDA1 基因突變導致的x 連鎖遺傳病例

；EDA1 基因編碼外異蛋白，屬于腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族成員。編碼外異蛋白受體的EDAR 基因和編碼EDAR 相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域的EDARADD 基因的突變也已被證明會導致常染色體顯隱性遺傳的HED

。上述3 種形式的HED 的表型在臨床上難以區(qū)分，可能是因為3 個基因處于同一條信號轉(zhuǎn)導途徑，該通路已被證實在皮膚附件的發(fā)生、形成和分化過程中起著非常重要的作用

。

Cluzeau 等

在65 例外胚層發(fā)育不良的患者中，發(fā)現(xiàn)有WNT10A 基因突變的患者也表現(xiàn)出HED 的表型，證明了WNT10A 基因的突變也會導致常染色體隱性和顯性遺傳的HED。有趣的是，大多數(shù)攜帶WNT10A 基因突變的HED 患者相比于攜帶EDA 基因突變的患者，皮膚及其附件（如毛發(fā)和汗腺）的異常程度更輕，且未見面部畸形。在此之前，已有相當多的文獻報道了WNT10A 突變導致的常染色體隱性遺傳的外胚層發(fā)育不良疾病，除了非綜合征型的4 型選擇性先天缺牙（selective tooth agenesis 4，STHAG4），還包括牙-指-真皮發(fā)育不良（odonto-onycho-dermal dysplasia，OODD）和Schopf-Schulz-Passarge 綜合征（SSPS）

。在本研究中，一例患者除了牙齒缺失，還出現(xiàn)皮膚干燥、指甲發(fā)育不良等較輕微的外胚層發(fā)育不全的表型，再次證明了Wnt/β-catenin 信號通路對外胚層發(fā)育也起著重要的作用。經(jīng)典的Wnt 信號通路被認為在成骨過程中也起著重要的調(diào)控作用

。成骨細胞來源于未分化的間充質(zhì)細胞，具有多向分化潛能；除了骨細胞，也可分化成為軟骨細胞、脂肪細胞、肌細胞和成纖維細胞。Wnt 蛋白通過抑制成骨前體細胞凋亡，從而促進成骨細胞分化。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，Wnt10B 可以促進小鼠的成骨和骨量增加

。體外細胞實驗研究發(fā)現(xiàn)，Wnt6、Wnt10A和Wnt10B 可以抑制間充質(zhì)干細胞向脂肪細胞的分化，并通過典型的Wnt 通路促進間充質(zhì)干細胞向成骨細胞的分化

。而在本研究納入的WNT10A基因發(fā)生突變的患者中，種植體與頜骨、顴骨的愈合期骨結(jié)合似乎未受到影響。這可能存在兩方面原因，一方面，Wnt 家族的其他蛋白可以正常地行使功能并通過經(jīng)典通路調(diào)控成骨；而另一方面，顱頜面骨與長骨的成骨方式不同，細胞來源也有差異，可能存在著不同的調(diào)控骨代謝的方式

。但值得注意的是，這類患者植入常規(guī)種植體后出現(xiàn)邊緣骨吸收的風險。一方面可能與這類患者自身牙槽骨發(fā)育較差，骨弓輪廓屬于不利型植骨居多有關(guān)；另一方面，種植體在這類遺傳性骨代謝通路可能受到影響的患者上的長期表現(xiàn)仍需要大樣本的繼續(xù)觀察隨訪。

對于重度先天缺牙甚至全口無牙的患者，牙齒的缺失同時還伴隨著牙槽骨的嚴重萎縮。相較于進行大范圍的骨增量手術(shù)，顴種植治療具有創(chuàng)傷更小、治療周期加快、可即刻負荷等優(yōu)點，是解決該類上頜骨嚴重萎縮患者功能重建的有效辦法。在本研究中，對一例前牙區(qū)尚有一定骨量的患者進行了雙側(cè)單顴種植修復，對一例前牙區(qū)剩余骨量已經(jīng)不足以放置常規(guī)種植體的患者進行了雙側(cè)雙顴種植修復。隨訪期間顯示兩位患者的顴種植體骨結(jié)合良好，修復體能正常行使功能，成功地解決了患者的咀嚼、發(fā)音和美觀問題。

綜上，本研究豐富了嚴重先天缺牙患者的WNT10A 基因突變譜，為遺傳診斷和產(chǎn)前咨詢提供了新的證據(jù)。同時，對患者進行的相關(guān)治療證實了種植治療能有效地對患者進行功能修復。WNT10A 基因突變類型與患者缺牙表型的關(guān)系尚未明確，未來還需要更多的病例和相關(guān)研究，以更好地助益臨床治療。

【

】 Jiang XK analyzed the data and wrote the article. Kang Y collected the data. Zhou MQ collected the references.Wu YQ and Wang F designed the study and revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

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