熊向英，趙艷飛,2，王志成

(1.廣西海洋研究所有限責(zé)任公司，廣西 北海 536000；2.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院 甲殼動(dòng)物遺傳育種與增養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088)

魚(yú)類(lèi)腸道中存在著由大量細(xì)菌構(gòu)成的微生物群落，是動(dòng)物長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果。宿主為腸道菌群提供了棲息生存環(huán)境，腸道微生物則對(duì)宿主的免疫、健康、營(yíng)養(yǎng)等有積極的影響[5]。魚(yú)類(lèi)腸道菌群組成及平衡狀態(tài)與機(jī)體健康密切相關(guān)，如腸道微生物中的益生菌具有免疫刺激因子的作用，通激免疫器官發(fā)育、促進(jìn)淋巴細(xì)胞免疫功能，進(jìn)而提高機(jī)體的免疫水平[6]。同時(shí)養(yǎng)殖環(huán)境中存在大量有益微生物類(lèi)群，這些微生物類(lèi)群參與養(yǎng)殖系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和水質(zhì)調(diào)節(jié)，能直接影響?zhàn)B殖動(dòng)物的健康狀況[7-8]。

1 材料與方法

1.1 養(yǎng)殖管理和水質(zhì)檢測(cè)

試驗(yàn)在廣西合浦縣黨江鎮(zhèn)南域村叉尾魚(yú)科技扶貧示范基地開(kāi)展，養(yǎng)殖池塘面積約0.67 hm2，水深約1.3 m，放苗約4.2萬(wàn)尾，養(yǎng)殖時(shí)間自8月初至次年7月底。每日早晚2次投喂漂浮性顆粒配合飼料，投喂量約為魚(yú)體質(zhì)量的3%。養(yǎng)殖期間每隔2個(gè)月采用多功能水質(zhì)分析儀YSI professional series測(cè)定池塘水溫、pH、溶解氧含量。采用TA-90紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(深圳市清時(shí)捷科技有限公司)測(cè)定氨氮和亞硝態(tài)氮含量。

1.2 樣品采集

試驗(yàn)樣品采于2019年7月，分別收集成魚(yú)腸道和養(yǎng)殖水體2類(lèi)樣品。隨機(jī)捕撈成魚(yú)3尾，平均體長(zhǎng)30.1 cm，平均體質(zhì)量294 g，樣品標(biāo)記為N1～N3。采集水樣時(shí)池塘一周未換水，養(yǎng)殖水體取3個(gè)點(diǎn)，分別用有機(jī)玻璃采水器在池塘對(duì)角線兩側(cè)離岸1.5 m處及正中間位置采集水樣，每個(gè)點(diǎn)取樣1 L，分別標(biāo)記為W1～W3。

1.3 樣品DNA提取、PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用FLASH 1.2.11軟件對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行拼接，使用Trimmomatic 0.33軟件將拼接得到的序列進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾，并用UCHIME 8.1軟件去除嵌合體，得到高質(zhì)量序列(Tags)。分析過(guò)程中刪除了古菌、葉綠體、未知序列以及只檢測(cè)到1次的序列。

1.4.1 運(yùn)算分類(lèi)單元聚類(lèi)和物種注釋

利用USEARCH 10.0軟件對(duì)所有樣品的高質(zhì)量序列進(jìn)行聚類(lèi)，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類(lèi)成為運(yùn)算分類(lèi)單元，參考SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其進(jìn)行物種注釋分析。

1.4.2 多樣性分析

通過(guò)Alpha多樣性分析，統(tǒng)計(jì)各樣品在97%相似性水平下的Ace、Chao1、Shannon及Simpson指數(shù)，繪制樣品稀釋曲線和等級(jí)豐度曲線，研究單個(gè)樣品內(nèi)部的物種多樣性。

1.4.3 功能基因預(yù)測(cè)

將測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Greengenes database 13.8數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后生成得運(yùn)算分類(lèi)單元表, 根據(jù)其16S rDNA拷貝數(shù)劃分的每個(gè)運(yùn)算分類(lèi)單元豐度將其均一化，通過(guò)PICRUSt預(yù)測(cè)微生物表型，如氧耐受、革蘭氏染色、致病潛力等。

2 結(jié)果與分析

2.1 養(yǎng)殖池塘水質(zhì)指標(biāo)

養(yǎng)殖期間池塘水質(zhì)指標(biāo)見(jiàn)表1，水溫、pH和溶解氧質(zhì)量濃度(除2018年11月)均保持在穩(wěn)定狀態(tài)。到養(yǎng)殖后期，池塘的氨氮和亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度明顯升高，但均維持在較低水平。

表1 斑點(diǎn)叉尾池塘養(yǎng)殖水質(zhì)指標(biāo)

2.2 腸道和水環(huán)境中菌群的多樣性

表2 各樣品Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)

等級(jí)分布曲線在橫軸的跨度表示樣品中細(xì)菌多樣性的豐富程度，在縱軸的平滑程度反映樣品中細(xì)菌分布的均勻程度。水體樣品細(xì)菌多樣性高于腸道，而腸道中則存在相對(duì)豐度明顯占優(yōu)的細(xì)菌種類(lèi)(圖1)。

圖1 各樣品中細(xì)菌多樣性的等級(jí)分布曲線Fig.1 Rank-abundance curves based on the OTU species number in each sample

2.3 腸道和水環(huán)境中菌群的相關(guān)性分析

圖2 腸道和水體中細(xì)菌數(shù)目的韋恩分析Fig.2 Venn analysis of bacterial number in intestine and pond water

2.4 微生物群落分析

圖3 基于門(mén)水平的樣品細(xì)菌相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of phylum-level bacterial communities in different samples

圖4 樣品菌群在屬水平上的細(xì)菌相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of genus-level bacterial communities in different samples

2.5 細(xì)菌表型的預(yù)測(cè)

3 討 論

3.1 斑點(diǎn)叉尾腸道和養(yǎng)殖水體菌群多樣性和相關(guān)性分析

圖5 Bugbase預(yù)測(cè)細(xì)菌群落表型分析Fig.5 Bugbase prediction of bacterial community phenotype3條線自下而上分別代表下四分位、平均值和上四分位.The three lines represent the lower quartile, mean and upper quartile from bottom to top, respectively.

3.2 斑點(diǎn)叉尾腸道優(yōu)勢(shì)菌群分析

3.3 斑點(diǎn)叉尾腸道和水體菌群表型預(yù)測(cè)

4 結(jié) 論