馮小艷　王俊剛　王文治　沈林波　趙婷婷　馮翠蓮　張樹(shù)珍

摘? 要：甘蔗線條花葉病毒（， SCSMV）是引起甘蔗花葉病的一種主要病原。SCSMV編碼的P1蛋白是RNA沉默抑制子，在SCSMV抑制寄主的RNA沉默防御中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但其作用機(jī)制尚未清楚。與寄主蛋白互作是RNA沉默抑制子發(fā)揮其抑制作用的主要途徑之一，因此鑒定與病毒RNA沉默抑制子互作的寄主蛋白是研究抑制子作用機(jī)制的一個(gè)重要方法。為探究SCSMV P1抑制寄主RNA沉默的機(jī)制，本研究首先將SCSMV 基因連接到質(zhì)粒pGBKT7上構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-P1，然后對(duì)pGBKT7-P1進(jìn)行毒性和自激活檢測(cè)，最后以pGBKT7-P1為誘餌，采用酵母雙雜交技術(shù)從甘蔗cDNA文庫(kù)中篩選與P1互作的寄主蛋白。結(jié)果顯示，成功構(gòu)建pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒。將pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Y2H Gold酵母菌株后，酵母菌株在SD/-Trp平板及液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，表明pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒對(duì)Y2H Gold酵母菌株無(wú)毒性。含pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒的酵母菌株在SD/-Trp/X-α-Gal平板上長(zhǎng)出白色菌落未變藍(lán)，在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA和SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，表明pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒無(wú)自激活活性。用pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒對(duì)甘蔗cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，經(jīng)SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA平板篩選1次及SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA平板篩選3次后，獲得42個(gè)陽(yáng)性酵母克隆，提取陽(yáng)性酵母質(zhì)粒并導(dǎo)入大腸桿菌中擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)測(cè)序及blastx比對(duì)分析，獲得13個(gè)可能與SCSMV P1互作的寄主甘蔗蛋白，分別是生長(zhǎng)素應(yīng)答蛋白IAA1、IAA15，轉(zhuǎn)錄因子NAC、GATA4、OFP4，真核翻譯起始因子eIF5A，分子伴侶DnaJ，輔分子伴侶SBA1，重金屬相關(guān)異戊二烯化植物蛋白HIPP35，mec-8和unc-52蛋白同系物抑制子SMU2，外膜孔蛋白OEP24，及2個(gè)未表征蛋白?；谶@些蛋白的功能，推測(cè)P1可能通過(guò)與寄主蛋白互作來(lái)調(diào)控寄主防御反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，和/或通過(guò)與寄主蛋白互作來(lái)影響寄主RNA沉默相關(guān)蛋白的合成、加工或轉(zhuǎn)運(yùn)，從而發(fā)揮其RNA沉默抑制子的功能。研究結(jié)果為后續(xù)深入解析P1抑制RNA沉默的作用機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甘蔗線條花葉病毒;RNA沉默抑制子;P1蛋白;互作蛋白中圖分類號(hào)：S435.661 ??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Identification of Host Proteins Interacting with RNA Silencing Suppressor of

FENG Xiaoyan， WANG Jungang， WANG Wenzhi， SHEN Linbo， ZHAO Tingting， FENG Cuilian，ZHANG Shuzhen

Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

（SCSMV） is a major pathogen of sugarcane mosaic disease. P1 protein encoded by SCSMV is an RNA silencing suppressor， which plays a key role in suppressing the host’s RNA silencing defense. However， its mechanism is not yet clear. Interaction with host proteins is one of the main pathways for RNA silencing suppressors to exert the suppression functions. Therefore， identifying host proteins that interact with viral RNA silencing suppressors is an important method to study the mechanism of suppressors. In order to explore the mechanism of SCSMV P1 suppressing the host RNA silencing， in this study， SCSMV was ligated to the plasmid pGBKT7 to construct the bait plasmid pGBKT7-P1， then pGBKT7-P1 was tested for toxicity and self-activation， and finally pGBKT7- P1 was used as a bait to screen the host proteins that interact with P1 from the sugarcane cDNA library by yeast two-hybrid technology. The results showed that the bait plasmid pGBKT7-P1 was successfully constructed. After the pGBKT7-P1 bait plasmid was transferred into the Y2H Gold yeast strain， the yeast strain grew well in the SD/-Trp plate and liquid medium， indicating that the pGBKT7-P1 bait plasmid was non-toxic to the Y2H Gold yeast strain. The yeast strain containing the pGBKT7-P1 bait plasmid grew white rather than blue colonies on the SD/-Trp/X-α-Gal plate， and did not grow on the SD/-Trp/X-α-Gal/AbA and SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA plates， indicating that the pGBKT7-P1 bait plasmid had no self-activation activity. The sugarcane cDNA library was screened with pGBKT7-P1 bait plasmid. After screening on SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA plate once and SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA plate three times， 42 positive yeast clones were obtained. The positive yeast plasmids were extracted and introduced into for amplification. After sequencing and blastx comparison analysis， a total of 13 host sugarcane proteins that may interact with SCSMV P1 were obtained， namely auxin-responsive proteins IAA1， IAA15， transcription factors NAC， GATA4， OFP4， eukaryotic translation initiation factor eIF5A， chaperone DnaJ， co-chaperone SBA1， heavy metal-associated isoprenylated plant protein HIPP35， suppressor of mec-8 and unc-52 protein homolog SMU2， outer envelope pore protein OEP24， and two uncharacterized proteins. Based on the functions of the proteins， it was speculated that P1 may interact with host proteins to regulate the expression of host defense response-related genes， and/or interact with host proteins to affect the synthesis， processing， or transport of host RNA silencing-related proteins， thereby exerting the RNA silencing suppressor function of P1. The research results would lay an important foundation for the subsequent in-depth analysis of the RNA silencing suppression mechanism of P1.

; RNA silencing suppressor; P1 protein; interacting protein

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.06.016

甘蔗線條花葉病毒（， SCSMV）隸屬馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）禾本科病毒屬（），是引起甘蔗花葉病的主要病原之一。SCSMV侵染甘蔗除能引起典型的花葉癥狀外，還會(huì)導(dǎo)致甘蔗植株矮化，分蘗減少，汁液變少，口感變差，產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降。據(jù)統(tǒng)計(jì)，當(dāng)SCSMV發(fā)生率超過(guò)50%時(shí)，可導(dǎo)致蔗莖和蔗糖產(chǎn)量分別顯著下降16%～17%和19%～21%。自1978年首次報(bào)道以來(lái)，SCSMV在全球范圍迅速傳播，目前已在中國(guó)、印度尼西亞、泰國(guó)、印度等主要甘蔗種植國(guó)家廣泛發(fā)生，嚴(yán)重制約甘蔗產(chǎn)業(yè)發(fā)展。目前缺乏行之有效的針對(duì)SCSMV的科學(xué)防控方法。

RNA沉默是植物用以抵抗病毒侵染的重要天然防御機(jī)制^[6-。病毒為了對(duì)抗這一機(jī)制，在與植物長(zhǎng)期共進(jìn)化過(guò)程中，通過(guò)自身編碼RNA沉默抑制子來(lái)干擾植物的RNA沉默通路從而建立有效侵染。RNA沉默抑制子通常是病毒成功侵染植物的必需因子，因此，闡明其作用機(jī)制可為病毒的科學(xué)防控提供理論指導(dǎo)。SCSMV編碼的P1蛋白是RNA沉默抑制子，其在SCSMV抑制寄主的RNA沉默防御從而建立有效侵染中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但目前尚未清楚其抑制RNA沉默的作用機(jī)制。解析SCSMV P1的作用機(jī)制對(duì)該病毒的科學(xué)防控具有重要意義。

RNA沉默抑制子不僅可以通過(guò)結(jié)合siRNA和dsRNA來(lái)發(fā)揮其抑制作用，還可通過(guò)與寄主蛋白互作來(lái)實(shí)現(xiàn)其抑制功能。因此，鑒定與病毒RNA沉默抑制子互作的寄主蛋白是研究抑制子作用機(jī)制的一個(gè)重要途徑。目前，已有多個(gè)病毒RNA沉默抑制子的寄主互作蛋白被鑒定，這些互作蛋白種類多樣、功能不一，按作用通路大致可歸納為2類，一類是RNA沉默通路蛋白，另一類是非RNA沉默通路蛋白。RNA沉默通路蛋白：AGO、Dicer、DRB4、RDR6和SGS3是RNA沉默通路中的重要蛋白，有些病毒編碼的抑制子與這些蛋白中的一個(gè)或幾個(gè)互作，通過(guò)干擾它們的正常功能來(lái)抑制RNA沉默。非RNA沉默通路蛋白：馬鈴薯Y病毒屬（）病毒編碼的HC-Pro抑制子與寄主轉(zhuǎn)錄因子RAV2互作，可能通過(guò)RAV2調(diào)控寄主防御反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)抑制寄主的RNA沉默機(jī)制。黃瓜花葉病毒（，CMV）編碼的2b抑制子與寄主核糖體蛋白亞基RPS11互作，下調(diào)寄主中RPS11的mRNA水平導(dǎo)致2b抑制子活性降低、病毒復(fù)制和積累減少，表明2b可能通過(guò)作用于寄主蛋白R(shí)PS11來(lái)發(fā)揮其抑制子功能。甜菜嚴(yán)重曲頂病毒（， BSCTV）、甜菜曲頂病毒（， BCTV）和番茄金色花葉病毒（， TGMV）編碼的抑制子與寄主甲基化循環(huán)相關(guān)蛋白SAMDC1或ADK互作，通過(guò)抑制SAMDC1降解或者促使ADK失活，從而抑制寄主DNA甲基化介導(dǎo)的基因沉默。

鑒定與病毒RNA沉默抑制子互作的寄主蛋白是研究抑制子作用機(jī)制的重要途徑，目前已被應(yīng)用于多個(gè)病毒RNA沉默抑制子作用機(jī)制的解析，但未見(jiàn)SCSMV編碼的RNA沉默抑制子P1與寄主蛋白互作研究的報(bào)道。本研究利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與SCSMV P1蛋白互作的寄主（甘蔗）蛋白，以期為闡明SCSMV P1抑制RNA沉默的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為SCSMV的科學(xué)防控提供理論依據(jù)。

?材料與方法

?材料

酵母雙雜交所用質(zhì)粒pGBKT7購(gòu)自美國(guó)Clontech公司。Y2H Gold菌株和DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司。高保真酶Phanta HS Super-Fidelity DNA Polymerase購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;快速限制性內(nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司;T DNA連接酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司;X-α-gal和AbA溶液購(gòu)自北京酷來(lái)搏科技有限公司。瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司;酵母質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

?方法

1.2.1 ?SCSMV 基因的克隆? 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中SCSMV的基因組序列（GenBank：GQ246 187.1）及本實(shí)驗(yàn)室獲得的SCSMV 基因序列（待發(fā)表）設(shè)計(jì)基因擴(kuò)增引物，并在正向引物引入酶切位點(diǎn)R I，反向引物引入酶切位點(diǎn)H I，引物序列具體如下：P1-R I-F：TCCGA ATTCATGGCTACTATCACTAAG，P1-H I-R：TCCGGATCCTCAGTAAAATACTAAATCTTC。以實(shí)驗(yàn)室保存的含有基因的pMD-18T載體為模板，使用高保真酶Phanta HS Super-Fidelity DNA Polymerase PCR擴(kuò)增基因。擴(kuò)增程序：95℃ 30?s;95℃ 10 s，54℃ 10 s，72℃ 17 s（30個(gè)循環(huán)）;72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。

1.2.2 ?pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建? 將基因膠回收產(chǎn)物用快速限制性內(nèi)切酶R I和H I進(jìn)行雙酶切，然后使用T DNA連接酶將酶切后的基因與經(jīng)相同酶切處理的pGBKT7質(zhì)粒進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，采用PCR法鑒定陽(yáng)性克隆。提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒并進(jìn)行酶切驗(yàn)證，將酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒即為pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒。

1.2.3 ?誘餌質(zhì)粒毒性及自激活檢測(cè)? 按照Clontech公司的Yeastmaker Yeast Transformation System 2手冊(cè)說(shuō)明進(jìn)行Y2H Gold酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。毒性檢測(cè)：將100 ng的pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒和pGBKT7空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化Y2H Gold酵母感受態(tài)細(xì)胞，然后取100 μL稀釋10倍的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于SD/-Trp平板，30℃倒置培養(yǎng)3?d左右，挑取平板上生長(zhǎng)良好的單菌落接種于50 mL SD/-Trp（含50 μg/mL卡那霉素）液體培養(yǎng)基中，30℃ 260 r/min培養(yǎng)20～24 h后測(cè)量值。自激活檢測(cè)：將轉(zhuǎn)化了pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒、pGBKT7空質(zhì)粒、陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒（pGBKT7-53和pGADT7-T）和陰性對(duì)照質(zhì)粒（pGBKT7-Lam和pGADT7-T）的Y2H Gold酵母菌分別劃線于分區(qū)的SD/-Trp、SD/-Trp/X-α- Gal、SD/-Trp/X-α-Gal/AbA和SD/-Trp/-Leu/X-α- Gal/AbA平板上，30℃倒置培養(yǎng)2～3 d，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.4 ?酵母雙雜交文庫(kù)篩選? 甘蔗cDNA文庫(kù)的構(gòu)建委托上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。采用共轉(zhuǎn)法對(duì)甘蔗cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，將5 μg的pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒和15 μg的文庫(kù)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化Y2H Gold酵母感受態(tài)細(xì)胞，具體操作參照Clontech公司的Yeastmaker Yeast Transformation System 2手冊(cè)進(jìn)行。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于SD/ -Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA平板上，30℃倒置培養(yǎng)3～5?d后，將平板上的藍(lán)色克隆轉(zhuǎn)移到SD/-Trp/- Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA平板上，重復(fù)3次。對(duì)3次轉(zhuǎn)板后仍正常生長(zhǎng)的藍(lán)色陽(yáng)性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取。利用pGADT7載體通用引物T7：TAATACGACTCACTATAGGGC和3￠ AD：AGAT GGTGCACGATGCACAG對(duì)提取的酵母質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。PCR程序：95℃ 5 min;95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min（35個(gè)循環(huán)）;72℃ 10 min。將經(jīng)PCR鑒定后的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于LB平板上（含100?μg/mL氨芐青霉素），37℃過(guò)夜培養(yǎng)后挑取PCR陽(yáng)性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。使用NCBI的blastx功能對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，以獲得候選互作蛋白的相關(guān)信息。

結(jié)果與分析

2.1 ?SCSMV 基因擴(kuò)增

利用特異性引物P1-R I-F和P1-H I-R對(duì)SCSMV 基因的編碼框進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得1074?bp左右的片段，片段大小與預(yù)測(cè)的目的基因大小一致（圖1），表明基因擴(kuò)增成功。

誘餌質(zhì)粒構(gòu)建

利用R I和H I對(duì)SCSMV 基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，然后用T DNA連接酶將酶切的基因連接至pGBKT7載體，構(gòu)建pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒。對(duì)構(gòu)建的誘餌質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果顯示酶切得到與預(yù)期大小一致的基因片段（圖2）。誘餌質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果也顯示插入的序列方向及編碼框完全正確，表明pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒構(gòu)建成功。

誘餌質(zhì)粒毒性及自激活檢測(cè)

將分別轉(zhuǎn)化了pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒和pGBKT7空質(zhì)粒的Y2H Gold酵母感受態(tài)細(xì)胞涂布于SD/-Trp平板，結(jié)果顯示含有誘餌質(zhì)粒和空質(zhì)粒的酵母均可在平板上生長(zhǎng)正常，且菌落數(shù)量大體相同，菌落大小均為2～3 mm。挑取平板上生長(zhǎng)良好的單菌落接種于SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20～24 h后含有誘餌質(zhì)粒和空質(zhì)粒的菌液值分別達(dá)到2.168和2.308，均超過(guò)0.8的判定標(biāo)準(zhǔn)。以上結(jié)果表明，pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒對(duì)Y2H Gold酵母菌株無(wú)毒性。

將含有pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒的Y2H Gold酵母菌株劃線于不同的營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上，結(jié)果如圖3所示。含有誘餌質(zhì)粒的菌株與含有空質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒的菌株一樣，在SD/-Trp平板上正常生長(zhǎng)，在SD/-Trp/X-α-Gal平板上長(zhǎng)出白色菌落，在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA和SD/-Trp/-Leu/X-α- Gal/AbA平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，而陽(yáng)性對(duì)照在SD/ -Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/X-α-Gal/AbA和SD/-Trp/ -Leu/X-α-Gal/AbA平板上均長(zhǎng)出藍(lán)色菌落。以上結(jié)果表明，pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒無(wú)自激活活性，可用于酵母雙雜交篩選。

的寄主互作蛋白篩選

用pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒對(duì)甘蔗cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，經(jīng)SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA平板篩選1次及SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA平板篩選3次后，成功獲得42個(gè)陽(yáng)性酵母克隆。提取陽(yáng)性酵母質(zhì)粒，使用pGADT7載體通用引物對(duì)T7/3' AD進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，有3個(gè)酵母質(zhì)粒（15、34、41）未擴(kuò)增出片段，2個(gè)酵母質(zhì)粒擴(kuò)增出雙片段（37、40），其余酵母質(zhì)粒擴(kuò)增出單一片段，擴(kuò)增獲得的片段大小均在750 bp以上（圖4）。

將擴(kuò)增出片段的酵母質(zhì)粒導(dǎo)入DH5α進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，分離插入片段，并挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析。對(duì)于擴(kuò)增出雙片段的酵母質(zhì)粒，每條擴(kuò)增片段所對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性克隆均送去測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blastx比對(duì)分析，去除重復(fù)序列后，獲得13個(gè)候選互作蛋白，它們分別是：生長(zhǎng)素應(yīng)答蛋白IAA1、IAA15，轉(zhuǎn)錄因子NAC、GATA4、OFP4，真核翻譯起始因子eIF5A，分子伴侶DnaJ，輔分子伴侶SBA1，重金屬相關(guān)異戊二烯化植物蛋白HIPP35，mec-8和unc-52蛋白同系物抑制子SMU2，外膜孔蛋白OEP24，及2個(gè)未表征蛋白（表1）。

討論

SCSMV引起甘蔗花葉病導(dǎo)致甘蔗產(chǎn)量減少和品質(zhì)下降，目前在多個(gè)甘蔗種植國(guó)家廣泛發(fā)生，對(duì)甘蔗產(chǎn)業(yè)發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅。SCSMV編碼的P1蛋白是RNA沉默抑制子，在SCSMV抵抗寄主的RNA沉默防御中發(fā)揮關(guān)鍵作用，闡明其作用機(jī)制可為該病毒的科學(xué)防控提供理論依據(jù)。鑒定與病毒RNA沉默抑制子互作的寄主蛋白是研究抑制子作用機(jī)制的重要途徑。因此，為初步解析SCSMV P1抑制RNA沉默的作用機(jī)制，本研究采用酵母雙雜交技術(shù)篩選與SCSMV P1蛋白互作的寄主（甘蔗）蛋白，結(jié)果共獲得13個(gè)候選互作蛋白，包括IAA1、IAA15、NAC、GATA4、OFP4、eIF5A、DnaJ、SBA1、HIPP35、SMU2、OEP24、和2個(gè)未表征蛋白。

AUX/IAA（auxin/indole-3-acetic acid）是生長(zhǎng)素早期應(yīng)答基因家族，是生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)途徑的核心因子，生長(zhǎng)素通過(guò)調(diào)節(jié)AUX/IAA蛋白水平進(jìn)而調(diào)控一系列響應(yīng)生長(zhǎng)素的基因表達(dá)。AUX/IAA蛋白不僅參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，還在植物與病毒相互作用過(guò)程中發(fā)揮作用。水稻矮縮病毒（，RDV）編碼的P2蛋白與水稻AUX/IAA蛋白IAA10互作，通過(guò)抑制26S蛋白酶體介導(dǎo)的IAA10降解來(lái)干擾生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)途徑，影響生長(zhǎng)素應(yīng)答基因的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)病毒侵染力、促進(jìn)病情發(fā)展。在轉(zhuǎn)基因水稻中的研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)使水稻更容易受到RDV感染，而敲低則增強(qiáng)了水稻對(duì)RDV的抗性。煙草花葉病毒（， TMV）編碼的復(fù)制酶蛋白與擬南芥AUX/IAA蛋白IAA26互作，通過(guò)改變IAA26的亞細(xì)胞定位及生長(zhǎng)素應(yīng)答基因的表達(dá)水平，來(lái)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生特定病征。本研究利用酵母雙雜交技術(shù)篩選獲得2個(gè)與SCSMV P1蛋白互作的AUX/IAA蛋白，即IAA1和IAA15，這2個(gè)蛋白在篩庫(kù)得到的酵母質(zhì)粒中多次出現(xiàn)——在篩庫(kù)獲得的42個(gè)酵母質(zhì)粒中，有8個(gè)質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序及blastx比對(duì)分析得到IAA1，有11個(gè)質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序及blastx比對(duì)分析得到IAA15。推測(cè)SCSMV編碼的P1蛋白與甘蔗IAA1和IAA15互作，可能通過(guò)抑制IAA1和IAA15的降解和/或改變其亞細(xì)胞定位，繼而干擾生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)途徑，影響生長(zhǎng)素應(yīng)答基因的表達(dá)，從而抑制寄主的RNA沉默防御，增強(qiáng)病毒侵染力。

NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，其可激活植物體內(nèi)病程相關(guān)基因的表達(dá)從而調(diào)節(jié)植物的防御反應(yīng)。研究表明，病毒可通過(guò)靶向寄主的NAC轉(zhuǎn)錄因子來(lái)增強(qiáng)侵染性。TMV編碼的復(fù)制酶蛋白與寄主轉(zhuǎn)錄因子NAC互作，通過(guò)誘導(dǎo)NAC降解來(lái)抑制寄主病程相關(guān)基因的表達(dá)，從而幫助病毒建立系統(tǒng)侵染。番茄卷葉病毒（， TLCV）編碼的復(fù)制輔助蛋白R(shí)En與寄主轉(zhuǎn)錄因子NAC互作，并誘導(dǎo)NAC在感染細(xì)胞中特異性表達(dá)，從而增強(qiáng)病毒DNA的復(fù)制。水稻突變體由于 插入破壞了其轉(zhuǎn)錄因子NAC的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致RDV在突變體中的積累量顯著下降，表明NAC對(duì)RDV在水稻體內(nèi)的增殖是必需的。本研究利用酵母雙雜交技術(shù)篩選獲得1個(gè)與SCSMV P1蛋白互作的甘蔗NAC轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子在篩庫(kù)得到的酵母質(zhì)粒中屢次出現(xiàn)——篩庫(kù)獲得的42個(gè)酵母質(zhì)粒中有4個(gè)質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序及blastx比對(duì)分析得到NAC。表明SCSMV P1可能通過(guò)與寄主轉(zhuǎn)錄因子NAC互作，通過(guò)NAC來(lái)影響寄主病程相關(guān)基因的表達(dá)從而抑制寄主的RNA沉默防御，增強(qiáng)病毒侵染力。除了NAC外，本研究還篩選到2個(gè)與SCSMV P1互作的寄主轉(zhuǎn)錄因子（GATA4和OFP4），暗示P1可能通過(guò)與多個(gè)寄主轉(zhuǎn)錄因子互作，通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子來(lái)影響寄主防御反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)其RNA沉默抑制子的功能。

eIF5A是普遍存在于植物、動(dòng)物、真菌等真核生物體內(nèi)的翻譯因子，在蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程的延伸階段和終止階段具有普遍的促進(jìn)作用。本研究顯示，SCSMV編碼的P1蛋白與甘蔗eIF5A互作，推測(cè)其可能通過(guò)eIF5A調(diào)控RNA沉默相關(guān)蛋白的翻譯進(jìn)而抑制寄主的RNA沉默。分子伴侶是一類普遍存在于生物體內(nèi)的保守蛋白質(zhì)家族，能協(xié)助蛋白質(zhì)的正確折疊、組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)乃至降解，對(duì)蛋白功能的發(fā)揮具有重要意義。輔分子伴侶是一類與分子伴侶結(jié)合并調(diào)節(jié)其功能的蛋白。本研究利用酵母雙雜交技術(shù)篩選到1個(gè)與SCSMV P1蛋白互作的甘蔗分子伴侶（DnaJ）及1個(gè)輔分子伴侶（SBA1），暗示P1可能通過(guò)作用于寄主的分子伴侶和輔分子伴侶來(lái)干擾RNA沉默相關(guān)蛋白的正確折疊、組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)或降解，進(jìn)而抑制寄主的RNA沉默。金屬離子在生物體內(nèi)扮演著非常重要的角色，生物體內(nèi)將近一半的蛋白質(zhì)需要金屬離子，金屬離子是這些蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)成分或催化因子。HIPP是植物中負(fù)責(zé)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵蛋白之一，對(duì)植物體內(nèi)金屬相關(guān)蛋白功能的發(fā)揮具有重要意義。本研究利用酵母雙雜交技術(shù)篩選到1個(gè)與SCSMV P1蛋白互作的甘蔗HIPP蛋白（HIPP35），推測(cè)P1可能通過(guò)結(jié)合寄主HIPP35來(lái)影響寄主金屬相關(guān)蛋白的功能，從而抑制寄主的RNA沉默。此外，本研究利用酵母雙雜交技術(shù)還篩選到與SCSMV P1蛋白互作的甘蔗蛋白SMU2、OEP24，及2個(gè)未表征蛋白，P1亦可能通過(guò)與這些蛋白互作來(lái)發(fā)揮其RNA沉默抑制子的功能。

本研究利用酵母雙雜交技術(shù)篩選到13個(gè)可能與SCSMV P1蛋白互作的寄主甘蔗蛋白，基于這些蛋白的功能，推測(cè)P1可能通過(guò)與寄主蛋白IAA1、IAA15、NAC、GATA4和/或OFP4互作來(lái)調(diào)控寄主防御反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，和/或通過(guò)與寄主蛋白eIF5A、DnaJ、SBA1和/或HIPP35互作來(lái)影響寄主RNA沉默相關(guān)蛋白的合成、加工或轉(zhuǎn)運(yùn)，從而發(fā)揮其RNA沉默抑制子的功能。研究結(jié)果為后續(xù)深入解析P1抑制RNA沉默的作用機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。但本研究?jī)H通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)研究蛋白互作關(guān)系，由于酵母結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，其蛋白質(zhì)的加工和修飾與甘蔗可能存在差異，因此酵母雙雜交的結(jié)果僅是提示蛋白質(zhì)相互作用的可能性，后續(xù)還需要進(jìn)行雙分子熒光互補(bǔ)、免疫共沉淀、GST pull-down等試驗(yàn)驗(yàn)證蛋白的互作關(guān)系。SCSMV編碼的P1蛋白與寄主蛋白如何互作？P1如何通過(guò)與寄主蛋白互作來(lái)發(fā)揮其抑制RNA沉默的功能？這些問(wèn)題有待進(jìn)一步研究。

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