蔡玉榮 王 媛 孔云逸 曾 瑾 王 娟 高蔚豐 李 勇

（寧夏大學(xué)西部生物資源保護(hù)與利用教育部重點實驗室，銀川 750021）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tu‐berculosis，MTB）引起的一類嚴(yán)重影響人類健康的人畜共患慢性消耗性傳染?。?］。雖然從卡介苗的首次使用到現(xiàn)在已有近百年的歷史，但是結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制和新型疫苗研制仍是當(dāng)前的研究重點［2］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，除肺泡巨噬細(xì)胞外，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（type Ⅱalveolar epithelial cells，AECⅡ）也可以作為肺臟抗結(jié)核侵襲的重要屏障，內(nèi)化和控制MTB的生長，并將抗原提呈給初始T 細(xì)胞［3］。除此之外，AECⅡ細(xì)胞能合成和分泌多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)（包括TNF-α、IL-6 和IL-8 等）來促進(jìn)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞遷移至被感染部位，有助于激活細(xì)菌侵入機(jī)體時的抗菌活性，從而在肺泡腔內(nèi)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用［4-5］。MTB 感染后的A549 細(xì)胞能夠分泌細(xì)胞因子如IFN-γ 和TNF-α，這種內(nèi)源性的細(xì)胞因子足以誘導(dǎo)信號通路激活，是目前體外研究MTB感染AECⅡ免疫調(diào)控的重要細(xì)胞模型之一［6］。

有實驗數(shù)據(jù)表明，p53 可通過調(diào)控多種細(xì)胞免疫相關(guān)信號通路來參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，如p53 上調(diào)Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）信號通路中的多個因子，同時增加TLRs 依賴的促炎因子的產(chǎn)生［7-8］。TLRs 可以通過活化NF-κB 的表達(dá)來啟動先天免疫應(yīng)答，抵抗病原微生物的侵襲，其中，TLR-2和TLR-4作為激活NF-κB信號的模式識別受體可以誘導(dǎo)IFN-β和IFN-γ依賴性基因的表達(dá)，促進(jìn)NF-κB后期階段的激活［9］。NF-κB 信號通路在肺泡上皮細(xì)胞中調(diào)控先天免疫和適應(yīng)性免疫，可由TNF-α、IL-6等因子激活，引起炎癥反應(yīng)［10］。此外，NF-κB信號通路在抗結(jié)核感染中穩(wěn)定激活并調(diào)控抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，或作用于其他免疫細(xì)胞來加速細(xì)胞分裂以抵御外來病原的入侵［11］。p53 和NF-κB 作為細(xì)胞應(yīng)答多種胞外信號并調(diào)控轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的主要轉(zhuǎn)錄因子，激活過程十分相似，且與炎癥反應(yīng)的免疫調(diào)控機(jī)制緊密相連［12］。這些發(fā)現(xiàn)提示p53 和NF-κB 信號通路可能在AECⅡ細(xì)胞抗MTB 感染中存在著復(fù)雜的細(xì)胞信號通路互作機(jī)制來響應(yīng)機(jī)體免疫應(yīng)答，其相關(guān)機(jī)制尚未明確。本研究通過建立MTB 減毒株BCG 與AECⅡ細(xì)胞株A549 體外感染模型，分析p53 和NFκB 信號通路中相關(guān)信號分子之間的相互作用規(guī)律來探討p53 和NF-κB 信號通路在AEC Ⅱ細(xì)胞抗結(jié)核感染中的免疫調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞系A(chǔ)549購自中國科學(xué)院北京協(xié)和細(xì)胞庫；卡介苗（BCG）購自成都生物制品研究所；脂多糖（LPS）購自北京索萊寶科技有限公司；p53 基因過表達(dá)載體plRES2-EGFPp53 WT購自Addgene；p53基因干擾載體TP53-RNAi（2648）、空載體con048、NF-κB 對照BLOCK-iTTM Alexa Fluor Red Fluorescent Oligo、NF-κB 干擾載體RNA-Stealth select oligos set tube-set、NF-κB 干擾載體GFP-RELA 購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒、RNA 提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；實時熒光定量試劑盒、DNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒、全蛋白提取試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；7H9 完全培養(yǎng)基、增菌劑（OADC）購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；FBS購自美國Gibco公司；DMEM 高糖完全培養(yǎng)液購自美國HyClone 公司；LipofectamineTMRNAi MAX Reagent、LipofectamineTM3000 Reagent、蛋白彩色預(yù)染Marker 購自Thermo Fisher Scientific；Opti-MEMTMMedium 購自Sigma；RNA-stealth select oligos set tube-set 購自Invitrogen；兔源一抗p53、CBP、MDM2、NF-κB-p65、TLR-4、鼠源一抗TRAF6和β-actin 購自Cell Signaling Technology；二抗IRDye 800CW goat anti-mouse IgG（H+L）、IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG（H+L）購自Licor公司。

1.1.2 實驗儀器 超微量分光光度計Nano‐Drop8000、CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Thermo Fisher科技公司；化學(xué)發(fā)光檢測儀（Amersham Imager 6000）購自美國GE 公司；Human Inflammation Array Q1 芯片（統(tǒng)稱為QAH-INF-1）購自RayBiotech公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種與細(xì)胞培養(yǎng) 制備7H9 培養(yǎng)基，121 ℃高壓滅菌30 min，待冷卻后，加入增菌劑（OADC），4 ℃保存。取?80 ℃保存的BCG 甘油菌接種于7H9完全培養(yǎng)基中，放入37 ℃、5%CO2及飽和濕度恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。A549 細(xì)胞于含10%FBS的DMEM 高糖完全培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2及飽和濕度恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 MTB 感染A549 細(xì)胞模型 將對數(shù)生長期的A549 細(xì)胞以5×105個/ml 的密度接種于6 孔板，于37 ℃、5%CO2及飽和濕度恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待A549 細(xì)胞增殖到培養(yǎng)孔面積的60%時，更換新鮮培養(yǎng)基；加入感染復(fù)數(shù)（MOI）=10 的BCG 感染A549細(xì)胞，設(shè)空白對照，繼續(xù)培養(yǎng)。待A549細(xì)胞增殖到培養(yǎng)孔面積的60%時，更換新鮮培養(yǎng)基；以1 mg/ml LPS作用于每孔，設(shè)空白對照，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 p53和NF-κB 基因過表達(dá)/干擾A549細(xì)胞模型建立

1.2.3.1 p53 基因 將對數(shù)生長期的A549 細(xì)胞以5×105個/ml 的密度接種于6 孔板，待細(xì)胞增殖到培養(yǎng)孔面積的60%時，按照LipofectamineTM3000 Re‐agent 說明書，分別將p53 基因的過表達(dá)和干擾載體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h，觀察A549 細(xì)胞中GFP 的表達(dá)情況，并收集細(xì)胞，進(jìn)行Western blot分析。

1.2.3.2 NF-κB 基因 同1.2.3.1，待細(xì)胞生長到60%時按2 ml/孔更換新鮮Opti-MEM 培養(yǎng)液，分別按照LipofectamineTM3000 Reagent 和LipofectamineTMRNAi MAX Reagent 說明書將NF-κB 基因過表達(dá)載體以及不同量的NF-κB基因siRNA（20、40、60、80和100 nmol/L）轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）分析。

1.2.4 qPCR 分析 根據(jù)qPCR 引物設(shè)計原則設(shè)計所需引物（表1），提取細(xì)胞總RNA，利用超微量分光光度計檢測RNA 純度及濃度，瓊脂糖凝膠電泳分析提取總RNA 的完整性，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，最后進(jìn)行qPCR。qPCR 程序設(shè)定：94 ℃30 s，94 ℃5 s；50～60 ℃15 s；72 ℃10 s；共40～45 個循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2?ΔΔCt法分析。

表1 實時熒光定量PCR引物Tab.1 Quantitative real-time PCR primers

1.2.5 Western blot 分析 提取細(xì)胞總蛋白，BCA檢測濃度（單位：μg/μl）根據(jù)目的蛋白大小的不同配制不同濃度的膠，取50 μg 細(xì)胞總蛋白提取物進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，添加一抗于4 ℃搖床孵育過夜。TBST 洗膜，與HRP 標(biāo)記的鼠或兔二抗（1∶1 000）孵育1 h 后，洗膜，加ECL 底物作用。用Odyssey Sa 近紅外熒光成像系統(tǒng)檢測各蛋白所對應(yīng)的特異性條帶，收集圖像并用Image J圖像分析軟件分析所得圖像的灰度值，以定量分析蛋白表達(dá)水平。

1.2.6 炎癥因子的蛋白定量芯片分析 使用QAH-INF-1芯片分析蛋白樣品。步驟詳見芯片使用說明書。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 5 軟件作圖，SPSS20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析、LSD 以及Duncant檢驗，數(shù)據(jù)以±s表示，P<0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義（*表示組內(nèi)比較，▲表示組間比較）。

2 結(jié)果

2.1 p53和NF-κB 干擾/過表達(dá)A549細(xì)胞模型的建立 在培養(yǎng)48 h 后，A549 細(xì)胞增殖達(dá)90%（圖1A），p53 基因過表達(dá)組表達(dá)熒光的細(xì)胞數(shù)量約50%（圖1B），干擾組細(xì)胞的熒光量約30%（圖1C）。經(jīng)Western blot分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，p53基因過表達(dá)組和干擾組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01，圖1D、E），表明p53 基因的過表達(dá)和干擾A549 細(xì)胞模型建立成功。

圖1 構(gòu)建p53 基因過表達(dá)/干擾A549 細(xì)胞模型后熒光觀察與Western blot分析Fig.1 Immunofluorescence observation and Western blot analysis after constructing p53 gene overexpression/interference A549 cell model

當(dāng)A549 細(xì)胞培養(yǎng)48 h 時細(xì)胞增殖到培養(yǎng)孔面積的90%（圖2A、B），NF-κB 基因過表達(dá)組表達(dá)熒光的細(xì)胞數(shù)量達(dá)到50%左右（圖2C）。經(jīng)qPCR分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，NF-κB-RNAi載體濃度在40 nmol/L時抑制效果最顯著，GFP-RELA 載體表達(dá)極顯著（圖2D），表明NF-κB 基因的過表達(dá)和干擾A549 細(xì)胞模型成功建立。

圖2 構(gòu)建NF-κB基因過表達(dá)/干擾A549細(xì)胞模型后熒光觀察與qPCR分析Fig.2 Immunofluorescence observation and qPCR analy?sis after constructing NF-κB gene overexpression/interference A549 cell model

2.2 MTB 感染A549 細(xì)胞后p53/NF-κB 信號通路基因mRNA表達(dá)分析

2.2.1 p53基因過表達(dá)/干擾的A549細(xì)胞mRNA 表達(dá)分析 在mRNA 水平上，利用熒光定量PCR 技術(shù)分析p53基因干擾和過表達(dá)后A549細(xì)胞內(nèi)p53信號通路的p53、MDM2 與CBP 基因，以及NF-κB 信號通路的TLR-4、TRAF6 和NF-κB 基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，當(dāng)p53 基因干擾時，p53 和CBP 基因表達(dá)水平極顯著下調(diào)（圖3A、C），MDM2極顯著上調(diào)（圖3B）；同時，NF-κB、TLR-4 和TRAF6 基因表達(dá)水平均極顯著上調(diào)（圖3D～F）。當(dāng)p53 基因過表達(dá)時，p53 和CBP 基因表達(dá)水平極顯著上調(diào)（圖3A、C），MDM2 極顯著下調(diào)（圖3B）；并且NF-κB、TLR-4、TRAF6 基因表達(dá)水平也極顯著下調(diào)（圖3D～F）。這些結(jié)果表明，在A549細(xì)胞中p53信號通路的p53協(xié)同CBP負(fù)調(diào)控NF-κB、TLR-4、TRAF6 從而抑制NF-κB 信號通路的活化。

當(dāng)BCG 感染control 組A549 細(xì)胞時，p53 信號通路與NF-κB信號通路均被激活。當(dāng)BCG感染p53干擾的A549細(xì)胞時，CBP 和MDM2基因表達(dá)水平均比Mock 組細(xì)胞極顯著上調(diào)（圖3A～C），其中CBP 基因表達(dá)上調(diào)最顯著；同時，p53 干擾后BCG 感染A549細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TLR-4、TRAF6基因表達(dá)水平極顯著下調(diào)（圖3E、F）。當(dāng)BCG 感染p53 過表達(dá)的A549 細(xì)胞時，P53、MDM2 基因表達(dá)水平較Mock 組細(xì)胞上調(diào)（圖3A、B），CBP 極顯著下調(diào)（圖3C）；同時，NF-κB、TLR-4 和TRAF6 基因表達(dá)水平較Mock 組A549 細(xì)胞均上調(diào)（圖3D～F）。上述結(jié)果顯示，在BCG 侵染A549 細(xì)胞時，p53 信號通路中p53 協(xié)同MDM2 負(fù)調(diào)控CBP，上調(diào)NF-κB 信號通路中的TLR-4和TRAF6，表明P53 信號通路與NF-κB 信號通路協(xié)同調(diào)控MTB 感染AECⅡ細(xì)胞的免疫調(diào)控作用。

圖3 BCG 感染p53 過表達(dá)和干擾A549 細(xì)胞mRNA 相對表達(dá)分析Fig.3 mRNA expression analysis in p53 gene overexpression and interference A549 cells infected with BCG

2.2.2 NF-κB基因過表達(dá)/干擾的A549細(xì)胞mRNA表達(dá)分析 為了進(jìn)一步在mRNA 水平上分析NF-κB信號通路對p53 信號通路的調(diào)控作用，本實驗對A549 細(xì)胞中NF-κB 基因進(jìn)行過表達(dá)和干擾，檢測p53 信號通路中p53、MDM2 和CBP，以及NF-κB 信號通路中NF-κB、TLR-4 與TRAF6 的mRNA 表達(dá)水平變化。當(dāng)NF-κB基因干擾時，NF-κB、TLR-4基本無變化，TRAF6 基因表達(dá)水平極顯著下調(diào)（圖4D～F）；同時p53 與MDM2 基因表達(dá)水平極顯著上調(diào)（圖4A、B），CBP 極顯著下調(diào)（圖4C）。當(dāng)NF-κB 基因過表達(dá)時，NF-κB、TLR-4、TRAF6基因表達(dá)水平極顯著上調(diào)；而p53 與MDM2 基因表達(dá)水平下調(diào)（圖4A、B），CBP 極顯著上調(diào)（圖4C）。這些結(jié)果表明，A549 細(xì)胞中NF-κB 信號通路的NF-κB 協(xié)同TLR-4 和TRAF6 負(fù)調(diào)控p53、MDM2 從而抑制p53 信號通路的活化。

當(dāng)BCG感染control組A549細(xì)胞時，NF-κB信號通路與p53信號通路被激活。當(dāng)BCG感染NF-κB干擾的A549 細(xì)胞時，NF-κB 信號通路的NF-κB、TLR-4、TRAF6 基因表達(dá)水平較Mock 組細(xì)胞顯著或極顯著上調(diào)（圖4D～F）；p53 和CBP 基因表達(dá)水平極顯著上調(diào)（圖4A、C），MDM2 顯著下調(diào)（圖4B）。當(dāng)BCG感染NF-κB 過表達(dá)的A549細(xì)胞時，NF-κB 基因表達(dá)水平較Mock 組顯著下調(diào)（圖4D），TLR-4 和TRAF6基因表達(dá)水平較Mock 組上調(diào)（圖4E、F）；而p53 基因表達(dá)水平下調(diào)（圖4A），MDM2、CBP基因表達(dá)水平顯著上調(diào)（圖4B、C）。上述結(jié)果表明，當(dāng)BCG 感染A549 細(xì)胞時，NF-κB 信號通路通過TLR-4 和TRAF6協(xié)同MDM2、CBP 來活化p53 信號通路，從而共同調(diào)控AECⅡ細(xì)胞的抗結(jié)核反應(yīng)。

圖4 BCG 感染NF-κB 基因過表達(dá)和干擾A549 細(xì)胞mRNA相對表達(dá)分析Fig.4 mRNA expression analysis in NF-κB gene overexpression and interference A549 cells infected with BCG

2.3 MTB 感染A549 細(xì)胞后p53/NF-κB 信號通路分子的蛋白表達(dá)分析

2.3.1 p53基因過表達(dá)/干擾的A549細(xì)胞蛋白表達(dá)分析 使用Western blot 技術(shù)在蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步驗證NF-κB 信號通路與p53信號通路的相互作用關(guān)系，檢測細(xì)胞內(nèi)p53 信號通路的p53、MDM2 與CBP蛋白，以及NF-κB信號通路的TLR-4、TRAF6和NF-κB蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，p53 基因干擾組中，p53 信號通路的p53 和CBP 蛋白表達(dá)量較control 組極顯著下調(diào)（圖5A、C），MDM2 極顯著上調(diào)（圖5B）；NF-κB信號通路的NF-κB 和TLR-4 蛋白的表達(dá)量較control組極顯著上調(diào)（圖5D、E），TRAF6極顯著下調(diào)（圖5F）。p53 基因過表達(dá)組中p53 信號通路的p53蛋白表達(dá)量較control 組極顯著上調(diào)（圖5B），MDM2和CBP 蛋白表達(dá)量下調(diào)（圖5A、C）；NF-κB信號通路的NF-κB、TLR-4 和TRAF6 蛋白表達(dá)量較control 組下調(diào)（圖5D～F）。與mRNA表達(dá)水平結(jié)果一致，表明在A549細(xì)胞中p53信號通路的p53協(xié)同CBP負(fù)調(diào)控NF-κB、TLR-4、TRAF6 從而抑制NF-κB 信號通路的活化。

圖5 BCG 感染p53 基因過表達(dá)和干擾A549 細(xì)胞后的蛋白表達(dá)分析Fig. 5 Protein expression analysis in p53 gene overexpres?sion and interference A549 cells infected with BCG

BCG 感染A549 細(xì)胞后，測定細(xì)胞中p53 信號通路的p53、MDM2、CBP 蛋白，以及NF-κB 信號通路的NF-κB、TLR-4、TRAF6蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示幾種蛋白的表達(dá)水平均發(fā)生顯著或極顯著變化（圖5），說明BCG 感染的A549 細(xì)胞活化了p53 與NF-κB 信號通路。BCG 感染p53 干擾組A549 細(xì)胞后，p53 信號通路中p53、MDM2、CBP 蛋白的表達(dá)較Mock 組細(xì)胞顯著上調(diào)（圖5A～C）；NF-κB 信號通路中NF-κB 和TRAF6 蛋白的表達(dá)較Mock 組顯著上調(diào)（圖5D、F），TLR-4 極顯著下調(diào)（圖5E）。BCG 感染的p53 過表達(dá)組A549 細(xì)胞，p53 信號通路中p53、MDM2 蛋白的表達(dá)較Mock 組顯著上調(diào)（圖5A、B），CBP 蛋白的表達(dá)量極顯著下調(diào)（圖5C）；NF-κB 信號通路中NF-κB、TLR-4 和TRAF6 蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)（圖5D～F）。表明在AECⅡ細(xì)胞抵抗MTB 感染過程中，p53 信號通路的p53 協(xié)同MDM2 與NF-κB 信號通路中的NF-κB 和TRAF6 共同維持AECⅡ細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，結(jié)果與核酸結(jié)果一致。

2.3.2 A549 細(xì)胞NF-κB 基因過表達(dá)/干擾后蛋白的表達(dá)分析 在蛋白質(zhì)水平上分析NF-κB 信號通路對p53 信號通路的調(diào)控作用。在A549 細(xì)胞中過表達(dá)/干擾NF-κB 后，檢測細(xì)胞中p53 信號通路的p53、MDM2、CBP蛋白，以及NF-κB信號通路的NF-κB、TLR-4、TRAF6 蛋白的變化。結(jié)果顯示，NF-κB 基因干擾組細(xì)胞內(nèi)，NF-κB 信號通路的NF-κB、TLR-4 和TRAF6 蛋白的表達(dá)量顯著下調(diào)（圖6D～F）；p53 信號通路的p53 蛋白的表達(dá)量極顯著下調(diào)（圖6A），MDM2、CBP 變化不大（圖6B、C）。NF-κB 基因過表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)，NF-κB 信號通路的NF-κB、TLR-4、TRAF6 蛋白表達(dá)量極顯著上調(diào)（圖6D～F）；p53 信號通路的p53 和MDM2 蛋白表達(dá)量下調(diào)（圖6A、B），CBP 極顯著上調(diào)（圖6C）。上述結(jié)果表明，在A549細(xì)胞中NF-κB 信號通路協(xié)同p53信號通路的CBP 負(fù)調(diào)控p53和MDM2，從而抑制p53信號通路的活化。

BCG 感染NF-κB 干擾組A549 細(xì)胞時，NF-κB 信號通路的NF-κB、TLR-4 和TRAF6 蛋白表達(dá)量較Mock 組細(xì)胞顯著上調(diào)（圖6D～F）；p53 信號通路的p53 和MDM2 蛋白的表達(dá)量下調(diào)（圖6A、B），CBP 顯著上調(diào)（圖6C）。BCG 感染NF-κB 過表達(dá)組A549 細(xì)胞時，NF-κB 信號通路的NF-κB 蛋白表達(dá)量較Mock組顯著下調(diào)（圖6D），TLR-4 和TRAF6 蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)（圖6E、F）；p53 信號通路的p53 和MDM2 的表達(dá)降低（圖6A、B），CBP 的表達(dá)量上調(diào)（圖6C）。以上結(jié)果明，BCG 負(fù)調(diào)控NF-κB 的表達(dá)；BCG 感染A549 細(xì)胞時NF-κB 信號通路的TLR-4 和TRAF6 協(xié)同MDM2、CBP調(diào)控p53信號通路的活化。

圖6 BCG感染NF-κB基因過表達(dá)和干擾A549細(xì)胞后的蛋白表達(dá)分析Fig. 6 Protein expression analysis in NF-κB gene overexpression and interference A549 cells infected with BCG

2.4 MTB 感染基因過表達(dá)/干擾A549 細(xì)胞后炎癥因子的蛋白芯片分析 本實驗使用BCG 感染A549細(xì)胞檢測細(xì)胞因子的表達(dá)量。結(jié)果顯示，BCG 感染的p53 干擾組中IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ 表達(dá)顯著上調(diào)（圖7A）。BCG感染p53過表達(dá)組時，IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ 的表達(dá)顯著上調(diào)（圖7B），與干擾組相比IL-6 極顯著上調(diào)，其他因子均下調(diào)。BCG 感染NF-κB 干擾組，IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ 表達(dá)上調(diào)（圖7C）。BCG 感染NF-κB 過表達(dá)組，IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ 表達(dá)極顯著上調(diào)（圖7D），且變化明顯高于干擾組。LPS 組變化趨勢同BCG 感染有一致性，只是變化差異性不如其顯著。這說明BCG 感染p53 過表達(dá)/抑制和NF-κB 過表達(dá)/干擾A549 前后都能引起細(xì)胞炎癥因子的變化。

圖7 MTB 感染p53/NF-κB 過表達(dá)/干擾A549 細(xì)胞后炎癥因子的定量蛋白芯片檢測結(jié)果分析Fig.7 Quantitative Protein Chip Assay for inflammatory factors in MTB-infected p53/NF-κB overexpression/interfering A549 cells

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當(dāng)MTB 經(jīng)由呼吸道感染肺臟時，AECⅡ細(xì)胞成為第一道細(xì)胞“屏障”來抵抗其侵襲，AECⅡ細(xì)胞可通過不同信號通路（如p53或NF-κB 信號通路等）活化，以分泌細(xì)胞因子和趨化因子（如IL-6、IFN-γ 等）來促進(jìn)宿主早期免疫應(yīng)答反應(yīng)的調(diào)控和炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而抑制MTB的定植、發(fā)展與傳播［13-14］。研究表明，TNF-α 可誘導(dǎo)上皮屏障功能的喪失并增強(qiáng)單核細(xì)胞的通透性，并且它還作為促炎性細(xì)胞因子促進(jìn)IL-6 和IL-8 的分泌［15-16］。IL-6 可以激活中性粒細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞的增殖［17］；IL-8是一種趨化因子，可以激活中性粒細(xì)胞并改變其形態(tài)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞遷移至反應(yīng)位點［18］。本實驗證明BCG 處理對A549細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，并誘導(dǎo)TNF-α、IL-6和IL-8的釋放，從而增強(qiáng)A549 細(xì)胞的免疫力以抵御BCG的感染。p53 作為“基因守護(hù)者”，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄多種特異性細(xì)胞因子和炎癥因子，導(dǎo)致多種凋亡基因的表達(dá)［19］。例如，p53 蛋白受泛素連接酶E3 調(diào)控誘導(dǎo)TNF-α 等［20］。早期研究表明，NF-κB 信號通路在AECⅡ細(xì)胞抗結(jié)核感染中發(fā)揮重要作用，MTB 刺激細(xì)胞表面識別受體TLRs 激活TRAF6，促進(jìn)NF-κB活化來調(diào)控細(xì)胞炎癥反應(yīng)［21］。而p53突變后也可激活NF-κB 的表達(dá)，導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)發(fā)生與傳播［22］。二者的激活過程相似，因此人們推斷p53 與NF-κB 之間存在“cross talk”，共同參與維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)［23］。但它們?nèi)绾卧贏ECⅡ抵抗結(jié)核感染過程中發(fā)揮作用尚不清楚。

研究表明，胰腺癌在侵入機(jī)體時能夠抑制宿主細(xì)胞p53 和NF-κB 信號通路的表達(dá)［23］。因此，推測p53 和NF-κB 信號通路在AECⅡ抵抗結(jié)核感染過程中發(fā)揮重要作用。本研究利用MTB 減毒株BCG 作用于p53 和NF-κB 過表達(dá)/干擾的A549 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)p53 和NF-κB 信號通路都可以被活化，同時引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)，且BCG 組感染強(qiáng)度大于LPS 組。由此可見，p53 和NF-κB 信號通路能夠在AECⅡ細(xì)胞抗結(jié)核免疫中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，p53 與NF-κB在腫瘤細(xì)胞中彼此競爭CBP 而激活其對p53 與NFκB 信號通路的正調(diào)控活性，從而促進(jìn)細(xì)胞生長［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，CBP 還可與p53/NF-κB 協(xié)同作用于A549 細(xì)胞，其中p53 與NF-κB 存在負(fù)調(diào)控作用。本實驗在MTB 免疫過程中，發(fā)現(xiàn)TLR-4 與TRAF6 的表達(dá)也與p53 存在正調(diào)控關(guān)系［25］，這與LIU 等［26］的研究結(jié)果相似。由此可見，AECⅡ識別MTB 時可能依賴多個信號通路共同協(xié)調(diào)控制［21］。同時，本研究發(fā)現(xiàn)p53和NF-κB 信號通路可以通過調(diào)控炎癥細(xì)胞因子和趨化因子（如TNF-α）等的作用誘導(dǎo)信號通路激活，進(jìn)而影響AECⅡ細(xì)胞抗MTB 感染的免疫調(diào)控，這一結(jié)果與LIM等［27］和王媛等［28］研究結(jié)果相似。

然而，隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)NF-κB和p53 的相互作用不單單表現(xiàn)拮抗作用，在某種特定條件下則表現(xiàn)為協(xié)同作用［29-30］。本實驗利用BCG作用于NF-κB 基因過表達(dá)/干擾的A549 細(xì)胞時，發(fā)現(xiàn)TLR-4 和TRAF6 的表達(dá)趨勢與NF-κB 一致，說明二者不僅能在T細(xì)胞中協(xié)同促進(jìn)NF-κB信號通路的激活還能在AECⅡ細(xì)胞發(fā)揮同樣的作用［31］。本實驗中MDM2 表達(dá)的變化在NF-κB 信號通路和p53 信號通路中的趨勢相似，表明p53 信號通路可能通過MDM2 作用于NF-κB 信號通路，這也進(jìn)一步表明了p53 能夠協(xié)同MDM2 介導(dǎo)NF-κB 的轉(zhuǎn)錄和翻譯［32］。另一方面，本實驗發(fā)現(xiàn)TNF-α 與NF-κB 的作用趨勢也與p53 的表達(dá)結(jié)果一致，這表明p53 和NF-κB 都參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生，存在協(xié)同效應(yīng)。這也印證了本課題組的猜想，BCG 能夠與LPS 一樣導(dǎo)致p53 信號通路和NF-κB 信號通路在A549 細(xì)胞中發(fā)揮協(xié)同作用［33］。IL-6 等細(xì)胞因子在BCG 作用后的變化趨勢表明其與NF-κB 的變化量有直接聯(lián)系，這與既往文獻(xiàn)［16］結(jié)果相似，由此可見，NF-κB通過多種關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)反饋機(jī)制控制炎癥和免疫激活。綜上所述，在AECⅡ細(xì)胞中NF-κB 信號通路與p53 信號通路間存在拮抗作用；當(dāng)MTB 侵染AECⅡ細(xì)胞時，NF-κB 信號通路與p53 信號通路表現(xiàn)出協(xié)同參與AECⅡ細(xì)胞抗MTB 感染的免疫調(diào)控作用，并為進(jìn)一步探究NF-κB與p53信號互作在AECⅡ細(xì)胞抗MTB感染中的免疫調(diào)控作用提供了數(shù)據(jù)支撐。