鄧輝雄 王革非 李雁嫘 宋鑫利 谷李銘 李 蕊

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，病原與免疫學(xué)研究中心，汕頭 515041）

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）感染引起的新冠肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）疫情在全球200多個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行，對(duì)全球公共衛(wèi)生安全造成巨大威脅，給社會(huì)生活及經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成巨大損失。我國(guó)與其他國(guó)家的科研人員針對(duì)SARS-CoV-2 的表征、候選抗原和表位的鑒定、動(dòng)物模型的建立、免疫應(yīng)答的表征以及疫苗設(shè)計(jì)研究取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展［1-2］。截至2020年11月，至少已有5種SARS-CoV-2疫苗進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)。但SARS-CoV-2 的抗原特性、抗原變異對(duì)宿主的保護(hù)性免疫反應(yīng)的影響有待進(jìn)一步驗(yàn)證［2］。

利用免疫信息學(xué)篩選、分析鑒定具有免疫保護(hù)性的表位，可有效提高保護(hù)性抗體親和力和細(xì)胞免疫平衡。病毒抗原，包括Spike 蛋白及RBD 區(qū)域存在多種表位。其中部分表位具有免疫保護(hù)作用，能夠誘導(dǎo)中和抗體和抑制病毒復(fù)制的抗體，以及抑制或殺傷感染細(xì)胞及輔助免疫平衡應(yīng)答的效應(yīng)T 細(xì)胞。大多數(shù)表位所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答不具有中和或抑制病毒復(fù)制的作用，反而可能會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答失衡并加重炎癥反應(yīng)，存在免疫病理?yè)p傷、抗體依賴的感染增強(qiáng)（ADE）等負(fù)面風(fēng)險(xiǎn)，甚至可能減弱具有免疫保護(hù)力表位的免疫保護(hù)效應(yīng)［3-4］。

Spike 蛋白是SARS-COV-2 的關(guān)鍵抗體靶點(diǎn)，其同源三聚體在受體結(jié)合和病毒入侵的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。全長(zhǎng)三聚體Spike 蛋白通常具有很高的免疫原性（約600 kD），其不僅包含RBD 及強(qiáng)效中和抗體的主要靶點(diǎn)，還包含能誘導(dǎo)中和抗體或保護(hù)性抗體的非RDB 區(qū)域，如N 端結(jié)構(gòu)域。目前已報(bào)道了一種基于結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的疫苗，確保MERS-CoV Spike蛋白穩(wěn)定維持在具有最佳抗病毒效果的融合前構(gòu)象，進(jìn)而提高基于全長(zhǎng)Spike蛋白的疫苗保護(hù)效果，該策略能維持宿主體液免疫和細(xì)胞免疫的有效平衡［5-6］。

為確保合成肽疫苗效果，本研究基于免疫信息學(xué)進(jìn)行SARS-CoV-2 優(yōu)勢(shì)保護(hù)性抗原表位的篩選、鑒定及對(duì)接分析，計(jì)算機(jī)克隆及免疫模擬預(yù)測(cè)分析抗原表位，構(gòu)建候選多價(jià)表位疫苗，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 SARS-CoV-2候選疫苗毒株的確定 選擇NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)表的surface glycoprotein［Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2］（NC_045512.2）為細(xì)胞表位預(yù)測(cè)模板。通過(guò)NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein）數(shù)據(jù)庫(kù)收集了579 條序列不同的SARS-COV-2 Spike 蛋白氨基酸序列作為保守性分析模板，所有蛋白數(shù)據(jù)以FASTA文件格式收集。

1.2 細(xì)胞表位預(yù)測(cè) 通過(guò)ABCpred（http：//crdd.osdd. net/raghava/abcpred/）和BCPreds（http：//ailab.ist.psu.edu/bcpred/）預(yù)測(cè)候選新冠病毒毒株的線性B 細(xì)胞表位。ABCpred 是基于遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的學(xué)習(xí)算法，默認(rèn)閾值為0.51，表位長(zhǎng)度為16，其準(zhǔn)確率為65.93%［7］。而基于內(nèi)核方法實(shí)現(xiàn)的BCPreds 準(zhǔn)確率為75.8%［8］。IEDB 服務(wù)器（http：//www.iedb.org/）和RANKPEP 服務(wù)器（http：//imed. med. ucm. es/Tools/rankpep. html）用來(lái)預(yù)測(cè)MHCⅡ型表位［9-10］。選擇IEDB 默認(rèn)參數(shù)設(shè)置，并選擇一個(gè)MHC HLA 等位基因中人群覆蓋度可達(dá)最小等位基因99%覆蓋率的等位基因參考集［11］。RANKPEP 使用定位特異性評(píng)分矩陣（PSSMs）或已知與給定MHC 分子結(jié)合的一組對(duì)齊肽作為MHC肽結(jié)合的預(yù)測(cè)因子，可重點(diǎn)預(yù)測(cè)保守表位，避免突變引起的免疫逃逸［10］，表位與MHCⅡ的結(jié)合潛力通過(guò)EpiTOP（http：//www.pharm‐fac.net/EpiTOP/index.php）評(píng)估［12］。IFNepitope（http：//crdd. osdd. net/raghava/ifnepitope/）和IL4pred（http：//crdd.osdd.net/raghava/il4pred/）預(yù)測(cè)IFN-γ 誘導(dǎo)性抗原表位和非IL-4誘導(dǎo)性抗原表位［13-14］。MHCⅠ結(jié)合CTL表位預(yù)測(cè)分別用NetMHCpan 4.1服務(wù)器（http：//www. cbs. dtu. dk/services/NetMHCpan/）、IEDB 服務(wù)器（http：//tools. iedb. org/mhci/）、Rankpep 服務(wù)器（http：//imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html）、CTL‐pred（http：//crdd. osdd. net/raghava/ctlpred/）、NetCTL server 1.2（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/）進(jìn)行分析。選擇的所有服務(wù)器HLA 等位基因的參數(shù)均可達(dá)到97%的群體覆蓋率［15］。NetMHCpan4.1 server 利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)表位與任何已知序列的MHC分子的結(jié)合［16］，本研究只選擇了強(qiáng)結(jié)合能力的抗原表位進(jìn)行進(jìn)一步分析。IEDB 服務(wù)器使用ANN、SMM 和CombLib 組成的共識(shí)推薦方法［17］。Rankpep 使用位置特異性評(píng)分矩陣（PSSM）［10］。CTLpred 利用T細(xì)胞表位模式代替MHC 結(jié)合物預(yù)測(cè)CTL 表位［18］。NetCTL 預(yù)測(cè)方法綜合預(yù)測(cè)MHCⅠ類結(jié)合肽、蛋白酶體C端裂解、TAP 轉(zhuǎn)運(yùn)效率。所有預(yù)測(cè)的表位均由IEDB（http：//tools.iedb.org/immunoge‐nicity/）進(jìn)行免疫原性檢測(cè)，并通過(guò)ToxinPred（https：//webs. iiitd. edu. in/raghava/toxinpred/design.php）確定其無(wú)毒性［19-20］。在本研究的表位預(yù)測(cè)策略中，使用多種工具可比單獨(dú)使用一種工具獲得更可靠的結(jié)果。

1.3 保護(hù)性表位的鑒定 為了選擇合適的表位進(jìn)行進(jìn)一步分析，通過(guò)比較服務(wù)器生成的B細(xì)胞表位、Th 表位和CTL 表位，找出重疊度高的最佳片段，使表位同時(shí)具有誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力。選擇MHCⅠ結(jié)合物，CTL 和B 細(xì)胞表位重疊區(qū)域作為潛在的表位，使用IEDB 服務(wù)器（http：//tools. immuneepitope. org/mhcii/）確定最佳結(jié)合物的IEDB評(píng)分［9］。

1.4 候選抗原表位保守性評(píng)估及T 細(xì)胞（HTL&CTL）表位等位基因人群覆蓋分析 通過(guò)IEDB（http：//tools.iedb.org/conservancy/）上的表位保守性分析工具評(píng)估病毒血清型的保守水平［21］。根據(jù)已確定的候選表位與579條不同的SARS-COV-2 Spike蛋白質(zhì)序列比對(duì)，計(jì)算抗原表位的保守性情況。分析類型和序列識(shí)別閾值分別設(shè)置為“線性”和“100%”，選擇去除相同模板序列。IEDB 人群覆蓋度工具（http：//tools. iedb. org/population/）用于評(píng)估預(yù)測(cè)的T細(xì)胞表位（MHCⅠ和MHCⅡ）的人群覆蓋率［22］。

1.5 疫苗構(gòu)建及抗原性、過(guò)敏原性、溶解度的預(yù)測(cè) 基于上述免疫信息學(xué)分析得到的表位，使用KK、AAY 和GPGPG linker 將B 細(xì)胞表位、HTL 和CTL 表位按順序連接在一起，50S 核糖體蛋白L7/L1分子佐劑通過(guò)EAAAK 在N 端連接［23］。采用Vexigen（http：//www. ddg-pharmfac. net/vaxijen/VaxiJen/Vaxi‐Jen.html）和ANTIGENpro（http：//scratch.proteomics.ics.uci.edu/）預(yù)測(cè)構(gòu)建的多表位疫苗的抗原性［24-25］。AllerTop server（https：//www. ddg-pharmfac. net/Aller‐TOP/）用于預(yù)測(cè)最終疫苗構(gòu)建的過(guò)敏原性，與其他服務(wù)器進(jìn)行的過(guò)敏原預(yù)測(cè)相比，AllerTOPV2.0 的敏感度高達(dá)94%［26］。SOLpro（http：//scratch.proteomics.ics.uci.edu/）用于預(yù)測(cè)構(gòu)建的疫苗蛋白的溶解度［27］。利用ExPASy 工具（https：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)疫苗的分子量、等電點(diǎn)（PI）、半衰期、穩(wěn)定性等理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)［28］。

1.6 疫苗二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)及二硫鍵設(shè)計(jì) 以Raptor X（http：//raptorx. uchicago. edu/StructPredV2/predict/）和PSIPRED 4.0（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipredtest）預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)［29-30］。以trRosetta（https：//yanglab. nankai. edu. cn/trRosetta/）完成對(duì)最終蛋白疫苗的三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)［31］，trRosetta 是一種快速、準(zhǔn)確地從頭預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的算法，其基于一個(gè)限制性的Rosetta 模塊直接能量最小化構(gòu)建蛋白質(zhì)穩(wěn)定構(gòu)象，約束了包括殘基間距離和方向分布，由深度殘基神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行預(yù)測(cè)。在CASP1 和CAMEO 派生集的基準(zhǔn)測(cè)試中，trRosetta 的性能優(yōu)于所有之前描述的方法?；贠mega、Phi、Distance、Theta、Contact 參數(shù)以及TM-score。PyMOL 程序用于三維模型的可視化。在進(jìn)行下一步之前，有必要提高蛋白模型的穩(wěn)定性。利用Disulfide by Design2.0（http：//cptweb. cpt. wayne. edu/DbD2/index. php）對(duì)候選蛋白疫苗進(jìn)行二硫鍵設(shè)計(jì)［32］。

1.7 三級(jí)結(jié)構(gòu)的重修與驗(yàn)證 GalaxyRefine（http：//galaxy. seoklab. org/cgi-bin/submit. cgi？type=REFINE）用于重修三級(jí)結(jié)構(gòu)［33］。為了驗(yàn)證三級(jí)結(jié)構(gòu)模型的質(zhì)量，使用RAMPAGE 在線服務(wù)器（http：//mordred.bioc. cam. ac. uk/～rapper/rampage. php）和ProSA-web（https：//prosa. services. came. sbg. ac. at/prosa. php）對(duì)模型進(jìn)行檢測(cè)［34-35］。

1.8 B 細(xì)胞構(gòu)象表位的預(yù)測(cè)及蛋白分子對(duì)接分析 利用DiscoTope2.0（http：//www. cbs. dtu. dk/ser‐vices/DiscoTope/）預(yù)測(cè)疫苗蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象B細(xì)胞表位［36］。蛋白質(zhì)間的相互作用對(duì)于理解細(xì)胞功能和組織結(jié)構(gòu)非常重要。分子對(duì)接是預(yù)測(cè)受體與配體在穩(wěn)定構(gòu)象下相互作用的一種方法。配體和受體間的相互作用取決于他們的親和力，親和力越高，配體和受體分子間的相互作用越穩(wěn)定。使用ClusPro 2.0（https：//cluspro. bu. edu/login. php）預(yù)測(cè)作為受體的TLR-4（PDB ID：4G8A）和作為配體的蛋白疫苗間的相互作用［37］。TLR-4（PDB ID：4G8A）受體使用pyMol 去掉水分子及其他雜質(zhì)。該服務(wù)器產(chǎn)生的對(duì)接配合物具有良好的脫溶自由能和靜電相互作用。LigPLot+用來(lái)確定疫苗配體和TLR-4 受體是否具有氫鍵和疏水相互作用的氨基酸殘基。

1.9 計(jì)算機(jī)克隆及免疫模擬分析 計(jì)算機(jī)模擬克隆通過(guò)SnapGene 軟件完成，而多表位疫苗的免疫原性和免疫應(yīng)答模式通過(guò)C-ImmSim 服務(wù)器（http：//150.146.2.1/C-IMMSIM/index.php）完成，該服務(wù)器基于位置特異性評(píng)分矩陣（PSSM）原理，預(yù)測(cè)候選疫苗模型抗原表位，并基于經(jīng)典免疫學(xué)原理使用機(jī)器學(xué)習(xí)模型預(yù)測(cè)免疫應(yīng)答相互作用［38］。在本實(shí)驗(yàn)中，基于群體覆蓋率使用了以下MHC 等位基因：HLA A*11：01、HLA A*31：01、HLA B*35：01、HLA B*53：01、HLA DRB5*01：01、HLA DRB1*09：01。按典型免疫過(guò)程間隔1 周注射，共免疫3 次。所有模擬參數(shù)均設(shè)置為默認(rèn)值，時(shí)間步長(zhǎng)設(shè)置為1、20 和40（每個(gè)時(shí)間步長(zhǎng)為8 h，時(shí)間步長(zhǎng)1 為第1 次免疫時(shí)間點(diǎn)），抗原分子的氨基酸序列作為疫苗。

2 結(jié)果

2.1 SARS-CoV-2 表位的初步篩選 表1 為經(jīng)鑒定的5 個(gè)B 細(xì)胞表位，表2 為6 個(gè)Th 表位，表3 為5 個(gè)CTL 表位。所有候選抗原表位在Spike 蛋白的構(gòu)象位置如圖1A，獲得能夠中和Spike蛋白與ACE2結(jié)合域的中和抗體具有重要意義，本研究選擇的B-1 和B-2 候選抗原表位如圖1B，在Spike 蛋白R(shí)BD 和ACE2 結(jié)合域上，具有能夠誘導(dǎo)主要中和抗體、破壞其與ACE2結(jié)合的潛力。候選Th抗原表位和CTL抗原表位結(jié)合的HLA 等位基因?qū)?yīng)的不同地區(qū)人群覆蓋度分析結(jié)果如表4 所示，候選表位可覆蓋全世界95.4%的人群，盡管對(duì)應(yīng)不同地區(qū)人群有差異，但依然具有較高的人群覆蓋度，如目前新冠疫情的高發(fā)地區(qū)南亞有98.39%的人群覆蓋度，歐洲有99.67%的人群覆蓋度，南美有99.95%的人群覆蓋度。對(duì)于全球性暴發(fā)流行的新冠病毒，開(kāi)發(fā)能夠適應(yīng)高人群覆蓋度的疫苗具有重要意義。

表4 候選Th和CTL表位等位基因中不同地區(qū)人群覆蓋率Tab.4 Population coverage calculation of Th and CTL epitopes specific alleles

圖1 SARS-CoV-2 Spike蛋白候選抗原表位空間展示Fig.1 Epitopes of SARS-CoV-2 Spike protein candidate antigen

表1 候選B細(xì)胞表位Tab.1 Candidate B cell epitopes

表2 候選Th細(xì)胞表位Tab.2 Candidate Th cell epitopes

表3 候選CTL細(xì)胞表位Tab.3 Candidate CTL cell epitopes

2.2 SARS-CoV-2表位疫苗構(gòu)建 基于上述免疫信息學(xué)分析得到的表位，使用KK、AAY 和GPGPG linker將B 細(xì)胞表位、HTL 和CTL 表位按順序連接在一起，B 細(xì)胞表位之間使用雙賴氨酸（KK）linker 保持其獨(dú)立的免疫原性活性，MHC 分子在MHCⅡ分子介導(dǎo)的抗原提呈到Th0之前，作用于抗原的KK序列，使用AAY 和GPGPG linker 可增強(qiáng)疫苗亞基的識(shí)別能力。Linker 可確保良好的穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)域取向和折疊率，使用EAAAK linker 連接表位和50S L7/L12分子佐劑氨基酸序列，示意圖如圖2所示。

圖2 SARS-CoV-2表位疫苗氨基酸序列Fig.2 Amino acid residues sequence of SARS-CoV-2 epitopes-based vaccine

2.3 SARS-CoV-2表位疫苗理化性質(zhì)分析 疫苗全長(zhǎng)392 個(gè)氨基酸，分子量大小為41.649 92 kD，pI：9.35，在體外哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞中半衰期為30 h，體內(nèi)酵母細(xì)胞中大于20 h，大腸桿菌中大于10 h，抗原穩(wěn)定指數(shù)為21.82，歸類為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。Vaxijen v2.0 預(yù)測(cè)保護(hù)性抗原在設(shè)定閾值為0.4 時(shí)分?jǐn)?shù)為0.416 2，可作為抗原；ANTIGENpro 預(yù)測(cè)抗原免疫原性為0.964 894；預(yù)測(cè)過(guò)表達(dá)溶解度為0.942 995，提示可溶。脂肪族指數(shù)為84.52，Grand average of hydropathicity（GRAVY）：?0.117，球狀蛋白結(jié)構(gòu)中的脂肪族鏈代表了該蛋白的熱穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)脂肪族指數(shù)的升高表明該蛋白質(zhì)在性質(zhì)上是熱穩(wěn)定的，GRAVY代表蛋白質(zhì)序列疏水性的平均值。

2.4 SARS-CoV-2表位疫苗二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) PSIPRED和Raptox 對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，蛋白疫苗由11.1%的螺旋、35.3%的折疊和53.6%的卷曲組成。溶劑可及性（ACC）由26%的埋藏、25%的居中和48%的外側(cè)組成。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)如圖3所示。

圖3 SARS-CoV-2表位疫苗二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析Fig.3 Secondary structure prediction of SARS-CoV-2 epitopes-based vaccine

2.5 疫苗三級(jí)結(jié)構(gòu)建模 最佳疫苗三級(jí)結(jié)構(gòu)建模結(jié)果如圖4F 所示。進(jìn)一步使用Disulfide by De‐sign2.0進(jìn)行二硫鍵設(shè)計(jì)，在默認(rèn)參數(shù)下，分析得到的B-factor 均為0，認(rèn)為通過(guò)trRosetta 能量最小化的蛋白質(zhì)建模已足夠穩(wěn)定，不需要進(jìn)一步的二硫鍵設(shè)計(jì)。預(yù)測(cè)模型的Ramachandran 質(zhì)量分析表明，預(yù)測(cè)模型中分別有379 個(gè)（97.2%）、8 個(gè)（2.1%）和3 個(gè)氨基酸（0.8%）的氨基酸殘基分別位于有利、允許和異常區(qū)域（圖5）。

圖4 SARS-CoV-2疫苗三級(jí)結(jié)構(gòu)建模Fig.4 SARS-CoV-2 epitopes-based vaccine tertiary struc?ture modeling

圖5 疫苗三級(jí)結(jié)構(gòu)模型refine 前Ramachandran 分析模型質(zhì)量Fig.5 Validation of vaccine tertiary structure model before refine using Ramachandran plot

2.6 疫苗三級(jí)結(jié)構(gòu)的refine 和驗(yàn)證 應(yīng)用Galaxy‐Refine 程序?qū)ν葱阅Ｐ徒Y(jié)構(gòu)進(jìn)行了改進(jìn)重修。GalaxyRefine 為模型構(gòu)建了5 個(gè)重修模型。重修前蛋白質(zhì)模型各種參數(shù)為GDT-HA（1.000 0）、RMSD（0.000）、Molprobity（2.509）、Clash score（48.7）、poor rotamers（2.0）以及Ramachandran plot（97.2），重修后確認(rèn)模型1 為最佳候選模型，其具體參數(shù)為GDT-HA（0.9458）、RMSD（0.440）、Molprobity（1.995）、Clash score（19.4）、poor rotamers（0.7）以及Ramachandran plot（97.9）。使用Pymol 軟件繪制的卡通圖比對(duì)結(jié)果如圖6A 所示。Ramachandran 對(duì)重修三級(jí)結(jié)構(gòu)模型的驗(yàn)證表明，重修后的模型質(zhì)量獲得提升（圖6B）。Ramachandran 圖表明，在優(yōu)化后，有利區(qū)域含382個(gè)氨基酸（97.9%），允許區(qū)域含6個(gè)氨基酸（1.5%），不允許區(qū)域含2 個(gè)氨基酸（0.5%）。而ProSA 網(wǎng)絡(luò)（蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析）顯示，蛋白質(zhì)疫苗結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確度分析結(jié)果在類似大小的天然蛋白質(zhì)常見(jiàn)的分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，z值為?7.07（圖6C）。該圖通過(guò)繪制氨基酸序列位置函數(shù)的能量分布來(lái)顯示局部模型質(zhì)量（圖6D），一般來(lái)說(shuō)，正值對(duì)應(yīng)輸入結(jié)構(gòu)存在問(wèn)題部分。結(jié)果提示，基于同源性建模的多價(jià)抗原表位腸道病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型精度可滿足進(jìn)一步分析。

圖6 候選疫苗三級(jí)結(jié)構(gòu)的重修和驗(yàn)證Fig.6 Refinement and validation of vaccine tertiary struc?ture model

2.7 計(jì)算機(jī)模擬克隆候選多價(jià)表位疫苗及構(gòu)象B細(xì)胞表位分析 計(jì)算機(jī)模擬克隆選擇pGEX-KG 原核表達(dá)載體，使用Snapgene 軟件對(duì)疫苗的氨基酸序列進(jìn)行反向翻譯得到疫苗表達(dá)基因序列，通過(guò)密碼子的優(yōu)化獲得更好的表達(dá)。通過(guò)選擇BamHⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)構(gòu)建pGEX-S 新冠疫苗原核表達(dá)載體，示意圖如圖7A所示。候選疫苗構(gòu)象B 細(xì)胞表位分析surface 結(jié)構(gòu)如圖7B 所示，共有44個(gè)構(gòu)象B細(xì)胞表位。

圖7 原核表達(dá)載體構(gòu)建和構(gòu)象B細(xì)胞表位分析Fig.7 Diagram of silico cloning and conformational B-cell epitope prediction

2.8 疫苗與TLR4-MD2 復(fù)合體對(duì)接 在平衡模式下選擇model.000.05 作為最佳對(duì)接模型，對(duì)接結(jié)果如圖8A 所示，在該對(duì)接模式下可以獲得穩(wěn)定的結(jié)合。LigPLot+確定疫苗配體和TLR-4/MD2 受體具有氫鍵的氨基酸殘基為Asn365、Asn181、Gly363、Arg184、Asn210、Lys170、Tyr371、His350、Gly391、Tyr383、Thr389、Glu33、Arg368。具有疏水相互作用的氨基酸殘基為Ile366、Ile362、Ile364、Gly213、Trp374、Val353、Ala357、Phe375、Ala392、Phe390、Trp388、His379、Tyr371、Thr35、Phe375、His376。

圖8 候選疫苗蛋白與人TLR4/MD2受體對(duì)接復(fù)合體結(jié)果Fig.8 Complexes of candidated vaccine protein docking with human TLR4/MD2 receptor

2.9 計(jì)算機(jī)模擬免疫應(yīng)答刺激 多表位疫苗的免疫原性和免疫應(yīng)答由C-ImmSim 服務(wù)器進(jìn)行，按典型免疫過(guò)程間隔1 周注射，共免疫3 次。所有模擬參數(shù)均設(shè)置為默認(rèn)值，時(shí)間步長(zhǎng)設(shè)置為1、20 和40（每個(gè)時(shí)間步長(zhǎng)為8 h，時(shí)間步長(zhǎng)1為第1次免疫時(shí)間點(diǎn)），抗原分子的氨基酸序列作為疫苗。通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬免疫應(yīng)答刺激可快速評(píng)估疫苗的免疫原性，快速篩選候選疫苗，節(jié)約時(shí)間和成本。計(jì)算機(jī)模擬免疫應(yīng)答刺激可以確定疫苗符合誘導(dǎo)免疫應(yīng)答規(guī)律，具有良好的免疫原性，可有效激活體液免疫和細(xì)胞免疫，結(jié)果如圖9～12所示。

圖9 模擬免疫刺激免疫B細(xì)胞和Th數(shù)量變化展示Fig.9 B cell and Th counts shown in silico immune simu?lation

圖10 模擬免疫刺激免疫CTL、NK、MA、DC、EP 細(xì)胞數(shù)量變化展示Fig.10 CTL，NK，MA，DC，EP cell counts shown in silico immune simulation

圖11 免疫球蛋白和免疫復(fù)合物變化趨勢(shì)Fig.11 Trends of immunoglobulins and immunocomplexes

圖12 細(xì)胞因子和白細(xì)胞介素的濃度變化趨勢(shì)Fig.12 Concentration trends of cytokines and interleukins

3 討論

借助免疫信息學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)開(kāi)發(fā)新冠病毒疫苗是一種有效的策略，目前已有一些借助免疫信息學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)設(shè)計(jì)的新冠疫苗研究和本文類似［39-40］，不同的是，本研究策略側(cè)重于體液免疫和細(xì)胞免疫的平衡。疫苗的保護(hù)作用除了能夠誘導(dǎo)中和抗體外，還需依賴于細(xì)胞毒性CD8 T 細(xì)胞和輔助性CD4 T細(xì)胞來(lái)完全清除病毒。免疫應(yīng)答的重要特征之一就是輔助性T細(xì)胞亞型的激活及相對(duì)應(yīng)的特異性類型細(xì)胞因子的釋放。加載在MHCⅡ上的抗原表位可激活Th1 和Th2 型輔助細(xì)胞。Th2 主要引發(fā)針對(duì)細(xì)胞外病原體的體液反應(yīng)，而Th1 激活針對(duì)細(xì)胞內(nèi)病原體（病毒、癌癥）的細(xì)胞免疫。然而，Th1和Th2 分別與介導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫不嚴(yán)格相等［41］，例如Th1 途徑也可刺激適度水平的基于抗體的反應(yīng)。Th1細(xì)胞因子傾向于產(chǎn)生促炎反應(yīng)，而Th2與抗炎反應(yīng)相關(guān)。不平衡的Th1/Th2 反應(yīng)可能引起免疫病理學(xué)并發(fā)癥，例如廣泛的組織損傷炎癥或強(qiáng)烈的過(guò)敏反應(yīng)。因此，在疫苗開(kāi)發(fā)過(guò)程中應(yīng)考慮適當(dāng)平衡Th1和Th2反應(yīng)。Th與APC相互作用可依靠IL-4 這樣的細(xì)胞因子形成局部正反饋，特異性的激活遞呈了有效表位的APC，同時(shí)也擴(kuò)增了能夠識(shí)別有效表位的Th，避免泥沙俱下的胡亂遞呈［14］。針對(duì)每個(gè)不同表位的Th，可以確立反應(yīng)方式，是奮力殺死敵人，還是選擇免疫耐受，與之和平相處。理想抗原應(yīng)由一般人群中的多個(gè)MHCⅠ和MHCⅡ等位基因呈遞，并包含與中和抗體相關(guān)的線性B 細(xì)胞表位。很多抗原并沒(méi)有足夠有效的抗原表位，無(wú)法有效激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞，所以效率低，準(zhǔn)確找到有效的抗原表位具有重要意義。本研究通過(guò)免疫信息學(xué)篩選出具有平衡體液免疫和細(xì)胞免疫特征的新冠病毒候選B 細(xì)胞、Th 和CTL 細(xì)胞表位，設(shè)計(jì)具有多表位的高免疫原性候選疫苗。通過(guò)計(jì)算機(jī)免疫模擬刺激實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)候選疫苗可誘導(dǎo)CD8+T 細(xì)胞，同時(shí)產(chǎn)生CD4+T 輔助性1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，其具有良好的抗病毒特性。佐劑不僅可用于提高蛋白質(zhì)疫苗引起的抗體反應(yīng)的強(qiáng)度和持久性，還可影響T 細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞因子模式，從而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，50S L7/L12 分子佐劑已被證明可通過(guò)激活TLR4 信號(hào)通路增強(qiáng)免疫應(yīng)答，實(shí)驗(yàn)通過(guò)分子對(duì)接確定候選疫苗與TLR4 的結(jié)合模式和相互作用的氨基酸殘基。在設(shè)計(jì)疫苗時(shí)需要在激發(fā)最大的免疫原性的同時(shí)盡可能地減少潛在的副作用。冠狀病毒株之間的多樣性為我們提出了另一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)樵诠跔畈《緦僦兄辽儆? 個(gè)不同的亞組。盡管SARS-CoV和SARS-CoV-2 處在相同的亞組，但二者的基因組只有77%相同［42］。了解SARS-CoV-2 的共有和獨(dú)特表位有助于為患者設(shè)計(jì)更好的疫苗或開(kāi)展診斷性臨床試驗(yàn)。另一方面，新冠病毒疫苗可能存在的抗體依賴增強(qiáng)（antibody-dependent enhancement，ADE）效應(yīng)也是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)的ADE 效應(yīng)主要認(rèn)為抗體不能中和病毒，反而充當(dāng)了一個(gè)特洛伊木馬，讓病毒更容易感染單核細(xì)胞。決定抗體是否引起ADE 的因素主要包括抗體的特異性、滴度、親和力以及抗體的亞型［43］。在猴子模型中，針對(duì)SARSCoV 的刺突蛋白的不同表位的抗體，其誘導(dǎo)的反應(yīng)也各不相同，有些可起到很好的保護(hù)作用，有些則容易引起ADE 效應(yīng)［44］。使用有效的表位設(shè)計(jì)疫苗可認(rèn)為是有效避免ADE效應(yīng)的策略。

4 結(jié)論

通過(guò)免疫信息學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析，進(jìn)行基于抗原表位的新冠病毒分子疫苗設(shè)計(jì)，信息學(xué)分析結(jié)果初步顯示，具備高保守性、免疫原性的B 細(xì)胞表位、MHC 等位基因高人群覆蓋度的IL-4、IFN-γ 誘導(dǎo)型Th 表位及CTL 候選表位構(gòu)建的疫苗具有良好的平衡體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答能力。