袁建華

(江西省醫(yī)藥學(xué)校，江西 南昌 330200)

1 引言

探究穿心蓮片中的穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯檢測(cè)的研究方法，提高檢測(cè)穿心蓮片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以確定穿心蓮片的質(zhì)量檢測(cè)方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑和儀器

ulti Mate HY-055高效液相色譜儀(ulti mate HY-055 檢測(cè)器，Thermo Scirncetific色譜工作站)；KQ3200DE HY-007數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；ME204E HY-036電子天平儀(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。硅膠 G板是由青島海洋化工所研制，自己制作的板的厚度取值0.5 mm；預(yù)制板的范圍 0.2 mm～0.25 mm，規(guī)格10 mm×20 mm；剩余試劑均為分析純。CAMAG HY-044雙波長(zhǎng)紫外觀察箱(瑞士)。DZF-6050MB HY-016真空干燥箱。SX3.3-10 HY-052節(jié)能纖維電阻爐(杭州卓馳儀器有限公司)。HC-3518 HY-027離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)。PB-10 HY-003 PH計(jì)(Sartorius).H50 Lab Tech HY-072冷卻水循環(huán)機(jī)。

2.2 試藥

脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品(批號(hào)：110854-200306中檢所)，穿心蓮片(廣西嘉進(jìn)藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：1803271、1803272、1803273，規(guī)格：0.25 g/片)，穿心蓮對(duì)照藥材若干(批號(hào)：121082-200603 中檢所)甲醇，乙腈，乙醇為色譜純，水為高純水，其他試劑均為分析純[3]。

2.3 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇—水(60：40)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：225 nm(穿心蓮內(nèi)酯)、254 nm(脫水穿心蓮內(nèi)酯)[14]。

2.1 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

2.1.1 溶液制備

供試品溶液的制備將此次三個(gè)批號(hào)的穿心蓮片隨機(jī)取其中的20片，若是包衣片，則除去表面包衣(注：①用刀片將包衣小心去除，不能將內(nèi)芯切掉，否則重新取樣；②用濕潤(rùn)的紗布將穿心蓮片濕潤(rùn)，然后來(lái)回摩擦，將包衣摩擦掉后放入一張白凈的濾紙上，待所有包衣去除完畢，備注好是哪一批。放到烘箱上面進(jìn)行烘干，烘干后即可繼續(xù)實(shí)驗(yàn))，用電子天平精密稱定20片總重，記錄這個(gè)數(shù)據(jù)，然后將稱量好的穿心蓮片用研缽研細(xì)，用小勺取0.5 g，采用減重法精密稱定并記錄好數(shù)據(jù)，將稱量好的粉末倒入具塞錐形瓶中，用25 mL的移液管配合洗耳球操作，精密加入甲醇25 mL，蓋好塞子，連帶塞子稱定其總重量，置于試驗(yàn)臺(tái)上面浸泡1小時(shí)，在這之后將它放進(jìn)超聲儀中，設(shè)置30分鐘，處理完后拿出來(lái)放冷，再稱重，損少的重量繼續(xù)加甲醇補(bǔ)足，搖勻，用濾紙配合小漏斗進(jìn)行濾過(guò)，用錐形瓶裝濾液，用移液管精密量取續(xù)濾液10 mL，加在中性氧化鋁柱(200目～300目，5 g，柱內(nèi)徑為1.5 cm)上[15]，此中性氧化鋁柱采用干法裝柱，并用洗耳球輕敲，使得柱子平整且緊密，但不能太過(guò)緊實(shí)。然后用甲醇20 mL進(jìn)行洗脫，收集洗脫液并置于50 mL的 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

對(duì)照品溶液的制備用電子天平采用減量法(先將稱量紙放上去，清零，然后取一定量的對(duì)照品，保證量足夠，再清零，將一部分對(duì)照品倒入量瓶中，再將稱量紙跟剩余的對(duì)照品放入天平中，看顯示的數(shù)字即是稱取該對(duì)照品的量)精密稱取0.1135 g穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品、0.1232 g脫水穿 心蓮內(nèi)酯對(duì)照品，將它們分別倒入兩個(gè)規(guī)格為100 mL的量瓶中，用記號(hào)筆做好標(biāo)記并在實(shí)驗(yàn)記錄本上記錄好數(shù)據(jù)，然后加適量甲醇進(jìn)行溶解并且稀釋到刻度，則所得對(duì)照品的濃度分別是113.5μg/mL、123.2μg/mL。

陰性對(duì)照溶液的制備 取適量輔料[16]，按照3.2.2的方法同理配置 陰性對(duì)照溶液。

2.1.2 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液 各10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜[17]。 從下面的圖譜中可以看出，在這個(gè)色譜條件下，穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯分離效果良好[18]，陰性樣品在穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品于相同保留時(shí)間沒(méi)有吸收峰出現(xiàn)，說(shuō)明并沒(méi)有出現(xiàn)干擾[19]。

圖1 HPLC色譜圖A.穿心蓮片；B.穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品；C.陰性樣品

2.1.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取上述配置好的穿心蓮 內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液各2 μL、4 μL、8 μL、10 μL、14 μL、18 μL，將其依次注入高效液相色 譜儀中，測(cè)定它們的峰 面積。按對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，色譜峰的面積為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線[20]。結(jié)果顯示，穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi) 酯的進(jìn)樣量和它的色譜峰的 面積都顯示出良好的線性關(guān)系。其回歸方程：穿心蓮內(nèi)酯：Y=6328.1X+190.95，R2=0.9996線性范圍：0.227 μg～2.043 μg；脫水穿心蓮內(nèi)酯：Y=4975.2X-118.78，R2=0.9994，線性范圍：0.2464 μg～2.2176 μg。結(jié)果見(jiàn)表1、表2和圖2、圖3。

表1 穿心蓮內(nèi)酯線性表

表2 脫水穿心蓮內(nèi)酯線性表

圖2 穿心蓮內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)曲線(r=0.9996)

圖3 脫水穿心蓮內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)曲線(r=0.9994)

2.1.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取供試品(批號(hào)：1803271)溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，連續(xù)測(cè)定 5 份，記錄每個(gè)的峰面積，算出平均峰面積，結(jié)果為穿心蓮內(nèi)酯平均峰面積為21460.6，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.40 %；脫水穿心蓮內(nèi)酯平均峰面積為14539.8，RSD=0.38 %。

從表3和表4可知，穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯峰面積的RSD值均小于2%，表明方法的精密度良好。

表3 穿心蓮內(nèi)酯精密度試驗(yàn)

表4 脫水穿心蓮內(nèi)酯精密度試驗(yàn)

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品(批號(hào)：1803271)溶液10 μL，分別在2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)的時(shí)候測(cè)定其色譜峰面積。最后穿心蓮內(nèi)酯的平均峰面積為21465.7，RSD=0.23%；脫水穿心蓮內(nèi)酯的平均峰 面積為14538.7，RSD=0.34%。

從表5和表6可知，穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯峰面積的RSD值小于2%，表明供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

表5 穿心蓮內(nèi)酯穩(wěn)定性試驗(yàn)

表6 脫水穿心蓮內(nèi)酯穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取5份相同容量的同一批次 的樣品，按照樣品的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明樣品中的穿心蓮內(nèi)酯平均的含量為22.47 mg/片，RSD值為0.20%；脫水穿心蓮內(nèi)酯平均的含量為20.08 mg/片，RSD值為0.36 %。

從表7和表8可知，穿心蓮內(nèi)酯峰和脫水穿心蓮內(nèi)酯峰含量的RSD值小于2 %，表明方法的重現(xiàn)性良好。

表7 穿心蓮內(nèi)酯重復(fù)性試驗(yàn)

表8 脫水穿心蓮內(nèi)酯重復(fù)性試驗(yàn)

2.1.7 加樣回收試驗(yàn)

精密地量取6份已知含量的 樣品溶液并精密加入適量的 對(duì)照品，按照樣品溶液制備的方法制 備好，然后樣品溶液和對(duì)照品溶液 各取10 μL，各自進(jìn)樣之后測(cè)定其峰面積 并計(jì)算好回收率。結(jié)果為：穿心蓮內(nèi)酯平均回收率 為100.215 %，RSD=1.91 %；脫水穿心蓮內(nèi)酯平均回收率 為99.103 %，RSD=1.97 %[10]，詳見(jiàn)表8和表9。

表8 穿心蓮內(nèi)酯加樣回收試驗(yàn)

表9 脫水穿心蓮內(nèi)酯加樣回收試驗(yàn)

2.1.8 含量測(cè)定

取3批樣品，依照供試品溶液的制備辦法制備，得供試品溶液，按照“3.1”項(xiàng)下的色譜條件來(lái)進(jìn)行含量測(cè)定。其結(jié)果見(jiàn)表10和表11。

表10 穿心蓮內(nèi)酯含量

表11 脫水穿心蓮內(nèi)酯含量

3 結(jié)果與討論

薄層層析中穿心蓮藥材和樣品的分離效果都不錯(cuò)，但其中脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品的點(diǎn)相對(duì)來(lái)說(shuō)不太明顯，原因可能是對(duì)照品的濃度比較低。由此結(jié)果也可知道此方法中的展開(kāi)劑以及條件都很合適，適用于穿心蓮片的鑒別實(shí)驗(yàn)。

穿心蓮內(nèi)酯的線性回歸方程為：Y=6328.1X+190.95，R2=0.9996，線性范圍是0.227 μg～2.043 μg；脫水穿心蓮內(nèi)酯的線性回歸方程為：Y=4975.2X-118.78，R2=0.9994，線性范圍是0.2464 μg～2.2176 μg。在系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)中精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD值均小于2%，表明此方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均良好。

本次三批穿心蓮片中的穿心蓮內(nèi)酯含量分別為22.1517 mg/片、22.9167 mg/片、22.3868 mg/片，脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量分別為20.1220 mg/片、20.0864 mg/片、20.0637 mg/片，表明此廠家生產(chǎn)的三個(gè)批次的穿心蓮片質(zhì)量比較穩(wěn)定，且穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯較高，有較好的藥用價(jià)值。

以上所述，對(duì)于穿心蓮片中的穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的檢測(cè)可以運(yùn)用此種方法，且效果良好，簡(jiǎn)潔方便。