劉 英 何鳳屏▲ 劉玉蘭 李定云

1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院體檢中心，廣東韶關(guān) 512026；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院檢驗科，廣東韶關(guān) 512026；3.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院胃腸外科，廣東韶關(guān) 512026

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）為全球常見的三大惡性腫瘤之一，其死亡率排第三位。隨著我國人民的生活節(jié)奏加快以及飲食結(jié)構(gòu)改變，其發(fā)病率與病死率均持續(xù)升高，而且有年輕化的趨勢，嚴(yán)重威脅著人類的健康。CRC 的病因尚未明確，其發(fā)病機理極其復(fù)雜、涉及到多階段、多步驟、多基因改變的過程。目前國內(nèi)外對CRC 的早期診斷仍處于較低水平，約半數(shù)的患者在明確診斷時已進入中期和晚期。因此，對CRC 發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移機制進行深入研究，尋找預(yù)防和治療的有效途徑，是目前國內(nèi)外研究的熱點，也是亟待解決的關(guān)鍵問題。本研究認為，microRNA-214（miRNA-214）上調(diào)導(dǎo)致HOXB7 基因下調(diào)，可能就是抑制CRC 細胞生長、侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵所在點，為此進一步把Wnt/β-catenin 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路納入研究范疇，分析其作用機制，旨在為CRC 轉(zhuǎn)移的早期診斷和治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2020年12月汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院收治的200 例CRC 住院患者為研究對象，按照是否發(fā)生轉(zhuǎn)移分為無轉(zhuǎn)移組（100 例）和轉(zhuǎn)移組（100 例），另選取同期健康體檢者200 例為對照組。無轉(zhuǎn)移組中，男68 例，女32 例；年齡23～65歲，平均（57.91±5.36）歲。轉(zhuǎn)移組中，男71 例，女29 例；年齡23～66 歲，平均（58.01±5.40）歲；肝轉(zhuǎn)移47 例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移53 例。對照組中，男115 例，女85 例；年齡21～64 歲，平均（56.39±5.24）歲。三組的性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究已得到醫(yī)院倫理委員會審批（批準(zhǔn)文號：YBAF-2018-012），所有受試者均已簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①入選患者均為初次診治，首次接受抗腫瘤治療（包括放療、化療、免疫治療等）；②臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有急性感染性疾?。虎诤喜?yán)重的心肝腎肺等器官功能不全；③患者拒絕接受檢查；④經(jīng)研究者判斷患者不適合參加本研究；⑤標(biāo)本不合格，不能進行檢測的樣本；⑥臨床數(shù)據(jù)缺失或記錄不規(guī)范樣本。

1.2 方法

①收集血漿標(biāo)本，所有研究對象均在清晨7:30 am，空腹抽取靜脈血檢測常規(guī)腫瘤標(biāo)志物，同時抽取5 ml 靜脈血置于EDTA 試管中，立即送到實驗室提取DNA 或RNA，并放置于-80℃冰箱中保存?zhèn)錂z。②利用人CRC 細胞SW480、SW1116（上海慧穎生物科技有限公司）進行實驗；③采用實時熒光定量PCR技術(shù)分別檢測miRNA-214、HOXB7、Wnt/β-catenin 的mRNA 的表達，并作相關(guān)性分析。檢測miRNA-214、HOXB7、Wnt/β-catenin 的引物和探針由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供，在BIO-RAD CFX96 實時熒光定量PCR 儀上進行熒光擴增和檢測其相對表達量。④采用miRanda、PicTar 和Tar-getScan 數(shù)據(jù)庫預(yù)測miRNA-214 的靶基因。⑤利用基因敲除和轉(zhuǎn)染技術(shù)驗證miRNA-214 通過靶向HOXB7 基因調(diào)控Wnt/β-catenin 的表達的作用機制。⑥將miRNA-214 模擬物和重組有HOXB7 基因3' UTR 區(qū)miRNA-214 潛在結(jié)合位點的野生型和突變型的熒光素酶報告基因分別轉(zhuǎn)染到CRC 細胞系SW1116 和SW480 細胞，并檢測HOXB7 mRNA 和蛋白水平，為了進一步研究miRNA-214 和HOXB7 之間的直接結(jié)合和抑制作用，24 h 后檢測熒光素酶活性，對HOXB7-wt-3' UTR 及其突變體型（FGFR1-mt-3' UTR）進行擴增和克隆pGL3 中熒光素酶報告基因，進一步驗證miRNA-214對HOXB7 基因的直接靶向調(diào)控促進CRC 細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。

觀察三組中miRNA-214、HOXB7、Wnt/β-catenin的表達，分析三者的聯(lián)系，并且分析對CRC 細胞生長和遷移的影響。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 三組miRNA-214 表達情況的比較

轉(zhuǎn)移組和無轉(zhuǎn)移組的miRNA-214 表達量分別為（1.23±0.34）和（2.05±1.19），均低于對照組的（5.94±1.84）（t值=27.69，P值＜0.05；t值=21.51，P值＜0.05），且轉(zhuǎn)移組低于無轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （t=21.51，P＜0.05）（圖1）。

圖1 三組miRNA-214 表達情況的比較

2.2 miRNA-214 在CRC SW1116、SW480 細胞株中的表達情況

miRNA-214 在CRC SW1116 細胞株中的表達量為（3.57±1.89），低于對照組的（6.13±2.17），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=24.31，P＜0.05）；miRNA-214 在SW480 細胞株中的表達量為（2.86±1.74），低于對照組的（5.58±2.03）（t=23.78，P＜0.05）（圖2～3）。

圖2 miRNA-214 在CRC SW1116 細胞株中的表達量

圖3 miRNA-214 在CRC SW480 細胞株中的表達量

2.3 miRNA-214 對HOXB7 基因、CRC 細胞生長和遷移的影響

首先評估FGFR1 敲除是否可以模擬miRNA-214過度表達的效果，用si RNA 轉(zhuǎn)染SW1116 細胞獲得HOXB7；Western 印跡分析證實HOXB7 表達減少（圖4A）。用miRNA-214 模擬物轉(zhuǎn)染SW1116 和SW480細胞，并且檢測HOXB7 mRNA 和蛋白水平，研究結(jié)果表明，在SW1116 和SW480 細胞生長和轉(zhuǎn)移的過程中，miRNA-214 呈高表達，HOXB7 呈低表達。與對照組比較，轉(zhuǎn)染si-HOXB7 的SW1116 和SW480 細胞顯示減少細胞集落形成 （P＜0.05）（圖4B），其效應(yīng)與miRNA-214 過表達相似。

圖4 Western blot 檢測miRNA-214、HOXB7、si-HOXB7 的表達

2.4 HOXB7 在CRC 組織和細胞株中的表達

與對照組比較，HOXB7 在SW1116 和SW480 細胞株中呈高表達水平（圖5A），HOXB7 在CRC 無轉(zhuǎn)移組和CRC 轉(zhuǎn)移組呈現(xiàn)高表達水平（圖5B）。

圖5 HOXB7 在CRC 組織和細胞株中的表達

2.5 miRNA-214 與HOXB7 表達的相關(guān)性分析

數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果表明，HOXB7 具有良好的生物活性，miRNA-214 潛在的結(jié)合位點在3' UTR 區(qū)域中（圖6A）。miRNA-214 模擬物轉(zhuǎn)染結(jié)果表明，HOXB7表達受miRNA-214 負調(diào)控（圖6B、C）。實時熒光定量PCR 檢測結(jié)果顯示，在CRC 患者組織和CRC SW1116 細胞中，miRNA-214 與TOXB7的表達水平呈負相關(guān)（r=-0.394，P＜0.01）（圖6D）。

圖6 HOXB7 表達及其與miRNA-214 的相關(guān)性分析

2.6 miRNA-214 與HOXB7 熒光酶活性的相關(guān)性分析

在共轉(zhuǎn)染的細胞中，與陰性對照細胞和空白細胞相 比，pcDNAmiRNA-214 在SW1116 和SW480 細 胞中的HOXB7-wt-3' UTR 熒光素酶活性降低（P＜0.05）（圖7A），且在HOXB7-mt-3' UTR 和pcDNAmiRNA-214 之間沒有發(fā)現(xiàn)熒光素酶活性的差異（圖7B）。

圖7 分析miRNA-214 與HOXB7 熒光酶活性的表達

2.7 miRNA-214 模擬物對HOXB7 表達的影響

miRNA-214 模擬物降低了SW1116、SW480 細胞中HOXB7 的表達水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 miRNA-214 模擬物對HOXB7 表達的影響

2.8 HOXB7 表達對Wnt/β-catenin 表達的影響

采用免疫熒光染色技術(shù)檢測CRC SW1116 細胞發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HOXB7 過表達后，Wnt/β-catenin 表達也增高；而在加入miRNA-214 干擾HOXB7 后，Wnt/βcatenin 表達明顯下降（圖8）。

圖8 HOXB7 表達對Wnt/β-catenin 表達的影響

3 討論

CRC 為最常見的惡性腫瘤之一，早期無明顯癥狀，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，大部分患者在明確診斷時就發(fā)生轉(zhuǎn)移了。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，50%的原發(fā)性CRC 患者同時伴有肝轉(zhuǎn)移，而且部分病人在接受原發(fā)腫瘤手術(shù)切除和輔助化療后仍出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移。其預(yù)后與診斷時機密切相關(guān)，這導(dǎo)致預(yù)后差和病死率高的重要因素，可見侵襲和轉(zhuǎn)移是造成CRC 患者死亡的首要原因。

腫瘤細胞發(fā)生-發(fā)展-侵襲-轉(zhuǎn)移的過程是腫瘤細胞與宿主細胞之間相互作用的連續(xù)動態(tài)過程，這個過程是復(fù)雜的、多步驟的，多種細胞組分、相關(guān)基因以及標(biāo)志性分子參與，并形成復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)。miRNA 是一種具備調(diào)控功能的小分子RNA，miRNA-214 在多種惡性腫瘤中低表達，而在癌旁正常組織中高表達，提示其可能具有抑制基因的特性。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-214 與多種惡性腫瘤相關(guān)，可通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮抑癌和促癌作用。miRNA-214 在CRC 中表達下調(diào)，參與了CRC 的發(fā)生和發(fā)展，在癌細胞增殖過程中miRNA-214 可能直接或間接調(diào)控某些蛋白mRNA 3'UTR 區(qū)，使蛋白合成抑制減少，使細胞周期與細胞增殖活性失調(diào)而發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。HOXB7 基因?qū)偻串愋秃谢騂oxB 家族，是一種很重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在正常組織中幾乎不表達。HOXB7 基因的異常表達被國外學(xué)者證實與腫瘤的臨床惡性程度和不良預(yù)后有密切相關(guān)。本實驗研究的核心指標(biāo)HOXB7 基因最初是在研究腫瘤新生血管生成過程中被發(fā)現(xiàn)的，它可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞分泌相關(guān)細胞因子促進腫瘤轉(zhuǎn)移，推測其與腫瘤的血管生成有關(guān)。Wnt 為一種分泌型糖蛋白，導(dǎo)致β-catenin 積累。β-catenin 即β-連環(huán)蛋白，游離的β-catenin 進入細胞核，可以調(diào)節(jié)基因表達，其異常表達或激活能引起腫瘤。Wnt 信號通路為一種復(fù)雜的蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)，最常見于胚胎發(fā)育及惡性腫瘤，而即Wnt/β-catenin 是經(jīng)典的Wnt 信號通路，可激活核內(nèi)靶基因的表達。

本研究結(jié)果顯示，miRNA-214 在CRC 轉(zhuǎn)移和CRC 無轉(zhuǎn)移患者組織中的表達量分別為（1.23±0.34）和（2.05±1.19），低于在結(jié)直腸切緣無瘤黏膜組織中的表達量；miRNA-214 在CRC SW1116 和SW480 細胞株中的表達量均低于在正常細胞株中的表達量（P ＜0.05）。用miRNA-214模擬物轉(zhuǎn)染SW1116 和SW480 細胞發(fā)現(xiàn)，在SW1116 和SW480細胞生長和轉(zhuǎn)移的過程中，miRNA-214 高表達抑制了HOXB7 的表達，降低了HOXB7 mRNA 和蛋白水平。研究結(jié)果提示，在大腸癌細胞系中，HOXB7 是miRNA-214 的靶基因，兩者之間的表達水平呈負相關(guān)（r=-0.394，P＜0.01），miRNA-214 低水平表達激活HOXB7 基因，并促進CRC 細胞生長和遷移，而miRNA-214 高表達會抑制HOXB7 基因，進而抑制CRC 細胞生長和遷移。HOXB7敲除可以達到模擬miRNA-214 高表達的效果，沉默HOXB7 顯示，miRNA-214 高表達會抑制CRC 細胞侵襲和遷移。而且HOXB7 在CRC 無轉(zhuǎn)移和CRC 轉(zhuǎn)移患者呈現(xiàn)高表達水平，在SW1116 和SW480 細胞株中也呈高表達水平，CRC 發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者血清中HOXB7 的濃度高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，表明HOXB7基因與CRC 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。HOXB7 基因表達上調(diào)，既提高了CRC 細胞的運動和侵襲能力，又激活免疫系統(tǒng)的巨噬細胞，提示HOXB7 基因可能是腫瘤細胞激活和利用自身免疫系統(tǒng)的重要樞紐。實驗研究采用免疫熒光染色技術(shù)，檢測CRC SW1116 細胞中HOXB7 過表達后的Wnt/β-catenin 表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HOXB7 過表達后，Wnt/β-catenin 表達也增高；當(dāng)加入miRNA-214 干 擾HOXB7 后，Wnt/β-catenin表達明顯下降，提示HOXB7 通過Wnt/β-catenin 通路發(fā)生作用。

因此，本研究認為miRNA-214 就是一個新的抑癌因子，miRNA-214 上調(diào)導(dǎo)致HOXB7 基因下調(diào)可能就是抑制CRC 細胞生長、侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵所在點，這提示miRNA-214—HOXB7—Wnt/β—catenin 通路可能作為未來潛在的CRC 抗癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移療法的新靶點。本項目從多個方面和多個層次研究miRNA-214 靶向HOXB7 基因調(diào)控Wnt/β-catenin 通路，闡明該通路參與抑制CRC 侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機制，這為早期輔助診斷CRC 提供了新的檢測手段?？偨Y(jié)來看，本項目的創(chuàng)新點在于，首次提出miRNA-214靶向HOXB7 基因調(diào)控抑制CRC 細胞生長、 侵襲、遷移的分子機制，首次提出miRNA-214 的表達調(diào)控Wnt/β-catenin 信號通路發(fā)揮抑制CRC 細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用機制。本項目的研究一方面提示了miRNA-214—HOXB7—Wnt/β—catenin 通路可能作為未來潛在的CRC 抗癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移療法的新靶點，另一方面也可以作為臨床診斷和預(yù)后評價的新分子標(biāo)志物，這為CRC 診斷和治療提供了新的靶點。因此，本項目的研究具有較大的臨床價值和科學(xué)意義。