王 輝 徐亮亮 孫大明 孟 一 張成龍 許海甲 寧 宇 李章華

1.武漢大學同仁醫(yī)院骨科，湖北武漢 430000；2.武漢體育學院研究生院，湖北武漢 430000；3.湖北省襄陽市中醫(yī)醫(yī)院骨科，湖北襄陽 441000

目前臨床研究表明，組織壞死常伴有缺血缺氧環(huán)境形成，如缺血性股骨頭壞死局部氧分壓可降至1%～2%，甚至無氧，導致骨再生效果降低[1-3]。間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因有多向分化潛能，而在細胞移植方面?zhèn)涫荜P注。本課題組前期實驗證實，靜脈移植的MSCs 可向股骨頭壞死區(qū)遷移、存活及增殖[4]。但此種方法需要大量純度高、活性強的MSCs，且需要多次移植，這些或與局部低氧、趨化因子表達不足有關。因此，提高MSCs 歸巢能力、增加局部MSCs 數(shù)量逐漸成為研究的方向?；|細胞衍生因子-1α（stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α）是趨化因子CXC 亞家族的一員，主要通過與其受體4（CXC subfamily receptor 4，CXCR4）結合促進細胞遷移[5-8]。研究表明，低氧環(huán)境會導致缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）分解受阻而發(fā)生富集，富集的HIF-1α 進而激活下游SDF-1α 蛋白，提高CXCR4 的表達并促進細胞遷移[9-10]。Wang 等[11]發(fā)現(xiàn)，SDF-1 和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達水平更高的M2 型巨噬細胞比M1 型巨噬細胞對骨髓源性細胞的募集作用更強，且能新生更多血管。之前，本課題組證實在常氧環(huán)境下，過表達SDF-1α 可通過HIF-1α/VEGF/SDF-1α/CXCR4 信號軸促進MSCs 遷移[12]，但該研究主要在常氧下進行，目前臨床在極度低氧條件下進行的研究尚不多見。因此，本研究旨在觀察極度低氧條件下SDF-1α 過表達對MSCs 遷移的影響，為改善MSCs 體內(nèi)移植提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

MSCM 培養(yǎng)基（Sciencell，美國，7501）；RNA 提取試劑盒（OMEGA，美國，R693401）；逆轉錄試劑盒及實時熒光定量PCR 試劑盒（TOYOBO，日本，QPK-201）；引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；Lipofectamin TM 2000（Invitrogen，美國，2145903）；AMD3100（Sigma，德國，A5602）；Transwell 小室（Corning，美國，35022254）；SDF-1α腺病毒（SDF-1α adenovirus，Ad-SDF-1α）由吉凱基因（上海）有限公司制作；HIF-1α 單克隆抗體（abcam，美國，179483）；VEGF單克隆抗體（碧云天，中國，AF0312）；CXCR4 單克隆抗體（NOVUS，美國，10074396）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo Fisher，美國，311）；實時熒光定量PCR 儀器（BIORAD，美國，788BR06733）；熒光倒置顯微鏡（Leica，德國，D35578）；酶標儀（Molecular，美國，301-2431241）。

1.2 實驗方法

1.2.1 MSCs 培養(yǎng)及轉染 普通級雄性日本大耳白兔兩只，兩周齡，體重（250±30）g，合格證號：420100000053 84，由武漢市萬千佳興生物科技有限公司提供[SCXK（鄂）2016-0011]，獨籠飼養(yǎng)，自由飲水，溫度控制在（25±1）℃，濕度控制在40%～70%，每日觀察其生活及精神狀態(tài)，定期打掃衛(wèi)生，保持飼養(yǎng)環(huán)境清潔。所有動物實驗均遵循實驗動物護理和使用指南，所有動物實驗均在武漢大學同仁醫(yī)院進行，均經(jīng)武漢大學同仁醫(yī)院倫理委員會批準（倫理批號：SY2019-025）。

按課題組前期方法分離、培養(yǎng)MSCs[13]。將第三代MSCs 計數(shù)后以2×105/孔密度接種于6 孔板，分為四組：①空白組，不進行干預；②AMD3100 組，加入CXCR4特異性抑制劑AMD3100 并使其終濃度為60 μmol/L；③Ad-SDF-1α 組，將Ad-SDF-1α 溶于無血清培養(yǎng)基后以感染復數(shù)為60 MOI 對MSCs 進行轉染，轉染6 h后，將無血清培養(yǎng)基更換為MSCM 培養(yǎng)基；④Ad-SDF-1α+AMD3100 組，將Ad-SDF-1α 溶于無血清培養(yǎng)基后以感染復數(shù)為60 MOI 對MSCs 進行轉染，同時加入AMD3100。各組均在37℃、5% CO2、1% O2環(huán)境中培養(yǎng)48 h，然后觀察細胞狀態(tài)，同時記錄腺病毒轉染效果。

1.2.2 Transwell 實驗 將四組細胞采用1×PBS 洗滌兩遍并用無血清L-DMEM 培養(yǎng)基稀釋至濃度1×105/ml，每組細胞取200 μl 加入Transwell 板的上室，用無血清培養(yǎng)基稀釋SDF-1α 蛋白，使其終濃度為100 μg/L，取500 μl 加入下室。在37℃、5% CO2、1% O2環(huán)境中孵育12 h，擦去上室中未遷移的MSCs，1×PBS 潤洗兩遍后多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色10 min，1×PBS洗去結晶紫，顯微鏡下觀察并記錄遷移的MSCs，用400 μl 33%冰醋酸溶解結晶紫，選擇565 nm 波長，酶標儀下檢測光密度（optical density，OD）值。每組3個復孔。

1.2.3 實時熒光定量PCR 檢測遷移信號軸HIF-1α、VEGF、CXCR4 mRNA 表達 四組細胞培養(yǎng)完成后，1×PBS洗滌兩遍，根據(jù)RNA 提取試劑盒說明書提取總mRNA，各取1 μg mRNA 進行逆轉錄獲取cDNA。引物設計，按照NCBI GENE 查HIF-1α、VEGF、CXCR4 及GAPDH 基因序列，引物序列見表1。PCR 體系各組分SYBR MIX、上下游引物混合液及cDNA 分別為10、1、1 μl，加入DEPC 水補至20 μl，以GAPDH 為內(nèi)參。反應程序為95℃預變性60 s，95℃變性15 s，72℃退火15 s 及60℃延伸15 s，共40 個循環(huán)，以2-ΔΔCt法得出mRNA 表達量。

表1 引物序列

1.2.4 Western blot 檢測遷移信號軸HIF-1α、VEGF、CXCR4 蛋白表達 四組細胞培養(yǎng)完成后，1×PBS洗滌兩遍，加入RIPA 蛋白裂解液，冰上裂解30 min，蛋白濃度用BCA 法定量，將蛋白與上樣緩沖液以4∶1比例混合，100℃煮5 min，SDS-PAGE 電泳后200 mA恒流電轉膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h。分別加入GAPDH 及HIF-1α、VEGF、CXCR4單克隆抗體，以GAPDH 為內(nèi)參，4℃搖床孵育過夜。TBST 洗膜后用二抗室溫孵育1 h，再次洗膜后加入顯影劑，在Biorad化學發(fā)光系統(tǒng)顯影。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，比較采用t 檢驗，多組計量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MSCs 形態(tài)及Ad-SDF-1α 轉染效果觀察

MSCs 貼壁后為梭形、多角形，呈克隆式生長，Ad-SDF-1α 轉染后可觀察到均一且明亮的綠色熒光。見圖1。

圖1 間充質干細胞形態(tài)及基質細胞衍生因子-1α 腺病毒轉染效果

2.2 四組遷移情況比較

AMD3100 組OD 值低于空白組，Ad-SDF-1α 組OD 值高于空白組，Ad-SDF-1α+AMD3100 組OD 值高于AMD3100 組且低于Ad-SDF-1α 組，差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見圖2。

圖2 四組遷移情況比較（n=3）

2.3 四組HIF-1α、VEGF、CXCR4 mRNA 表達比較

AMD3100 組VEGF、CXCR4 mRNA的表達低于空白組，Ad-SDF-1α 組HIF-1α、VEGF、CXCR4 mRNA表達均高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。Ad-SDF-1α+AMD3100 組VEGF、CXCR4 mRNA表達均高于AMD3100 組，HIF-1α、VEGF、CXCR4 mRNA 表達均低于Ad-SDF-1α 組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見圖3。

圖3 四組HIF-1α、VEGF、CXCR4 mRNA 表達比較（n=3）

2.4 四組HIF-1α、VEGF、CXCR4 蛋白表達比較

AMD3100 組HIF-1α、VEGF、CXCR4 蛋白表達低于空白組，Ad-SDF-1α 組HIF-1α、VEGF、CXCR4 蛋白表達均高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義，Ad-SDF-1α+AMD3100 組HIF-1α、VEGF、CXCR4 蛋白表達均高于AMD3100 組且均低于Ad-SDF-1α 組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見圖4。

圖4 四組HIF-1α、VEGF、CXCR4 蛋白表達比較（n=3）

3 討論

HIF-1α/VEGF/SDF-1α/CXCR4 軸對調節(jié)細胞遷移具有重要作用。HIF-1 是啟動基因，由HIF-1α 和HIF-1β 兩個亞基構成，其中HIF-1α 是目前已知最重要的缺氧受體和缺氧誘導轉錄因子，HIF-1α 被激活后可以增加細胞在缺氧環(huán)境中生存能力，維持氧的內(nèi)環(huán)境平衡，使機體適應缺氧，進而促進細胞黏附、遷移和血管生成[14-17]。當其被敲除或抑制后，細胞的遷移明顯被抑制，SDF-1α 和CXCR4 的mRNA 和蛋白水平也顯著降低[18]。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α 并不是直接作用于細胞，當組織或器官缺氧時，HIF-1α 會與HIF-1β結合，并易位到細胞核中，與VEGF 基因5’側翼區(qū)域的特定序列結合，激活VEGF，促進血管形成[19-21]。VEGF 是一種約40 kD 的二聚糖蛋白，作為一種高效的內(nèi)皮細胞有絲分裂原，可刺激增殖、遷移和導管形成[22-23]。如Hong 等[24]研究VEGF 對腫瘤細胞的直接作用時發(fā)現(xiàn)，VEGF 除了可促進腫瘤細胞形成血管外，還可上調腫瘤細胞SDF-1α 及CXCR4 的表達，進而促進細胞轉移。Lima 等[25]的研究也認為VEGF 可招募CXCR4 陽性細胞。VEGF 激活SDF-1α 后，SDF-1α 可誘導CXCR4 從細胞內(nèi)部轉移到細胞表面并與之結合，進而激活下游信號促進細胞遷移[26-27]。研究發(fā)現(xiàn)，SDF-1 及其受體CXCR4 與VEGF 的作用是相互的，在組織缺血缺氧區(qū)，SDF-1/CXCR4 可刺激VEGF 的表達進而促進血管形成[28-29]。這些研究闡明了SDF-1對細胞遷移的重要性及基本作用原理。

MSCs 移植入體內(nèi)時，決定治療效果的關鍵在于MSCs 向損傷或壞死區(qū)域定向歸巢的數(shù)量及活性的維持[30]。目前，對低氧環(huán)境下MSCs 分化能力的意見尚不統(tǒng)一。有研究認為低氧環(huán)境可抑制MSCs 成骨活性，下調成骨因子表達[31-32]。也有研究發(fā)現(xiàn)，低氧利于MSCs成骨分化，隨著缺氧時間進展，MSCs 中骨橋蛋白、骨鈣素及堿性磷酸酶的表達增加，并上調ColⅠ、Ⅲ表達，從而提高MSCs 成骨效應[33-34]。因此增強低氧環(huán)境下MSCs 歸巢能力，提高歸巢數(shù)量就顯得很有必要?；诖四康?，本研究將前期構建的SDF-1α 腺病毒[35]轉染入MSCs，建立過表達SDF-1α 細胞體系，并將MSCs置于極度低氧環(huán)境培養(yǎng)以觀察其遷移能力變化。Transwell 實驗結果顯示，Ad-SDF-1α 組MSCs 遷移數(shù)目最多，AMD3100 組最少，Ad-SDF-1α 與AMD3100共同轉染相對于AMD3100 組有所提高，提示極度低氧條件下SDF-1α 過表達可促進MSCs 遷移，并在一定程度上逆轉AMD3100 的抑制效應。另外，本研究在基因層面對遷移信號軸HIF-1α、VEGF、CXCR4 進行了檢測，結果顯示SDF-1α 過表達不僅可上調其受體CXCR4 表達，同時可上調HIF-1α、VEGF 表達，提示SDF-1α 與HIF-1α 及VEGF 之間存在相互作用，共同促進MSCs 的遷移，這與本課題組前期常氧下研究結果相符[12]。

綜上所述，本研究提示，在極度低氧條件下SDF-1α 過表達仍然具有促進MSCs 遷移的能力，為優(yōu)化MSCs 體外移植提供參考。后續(xù)實驗中，本課題組將通過體內(nèi)實驗及示蹤技術，觀察SDF-1α 過表達后MSCs 的治療效果及其對循環(huán)中MSCs 的影響。