陳勝杰 李 溪 李 超

1.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，廣東廣州 510405；2.廣東省佛山市婦幼保健院中心實驗室，廣東佛山 528000

根據(jù)世界衛(wèi)生組織2019 年全球結(jié)核病的最新報告，全球潛伏性結(jié)核感染人群接近20 億，新發(fā)結(jié)核病患者996 萬例[1]。我國是全球結(jié)核病高負擔國家之一，結(jié)核病的防控仍然十分嚴峻[2]。由于耐藥結(jié)核分枝桿菌的產(chǎn)生及其引起的耐多藥結(jié)核病的持續(xù)流行，一線抗結(jié)核藥物已不能滿足臨床的治療需求[3-4]。開展?jié)撛谟行Э菇Y(jié)核藥物十分重要[5-6]。環(huán)絲氨酸（D-Cycloserine，DCS）是廣譜二線抗結(jié)核藥物，能夠抑制結(jié)核分枝桿菌生長，是代表性潛在藥物[7-8]。2011 年世界衛(wèi)生組織已推薦將DCS 用于耐多藥結(jié)核病的治療[9]。近年，伊朗、南非等國家采用DCS 治療耐多藥結(jié)核病取得了較好的效果[10-11]。同時，聯(lián)合藥敏試驗能夠評估藥物聯(lián)合作用時的抑菌或殺菌活性，指導臨床用藥[12-13]。但目前關(guān)于DCS 與一線藥物聯(lián)合效應的報道尚不多見。鑒于以上情況，本研究采用體外聯(lián)合藥敏實驗，探討DSC 與利福平（Rifampicin，RFP）和異煙肼（Isoniazid，INH）對耐藥結(jié)核分枝桿菌的體外作用效果。希望借此為臨床抗結(jié)核藥物配伍方案提供更多可靠合理的選擇。

1 材料與方法

1.1 菌株

結(jié)核分枝桿菌標準株（H37Rv，ATCC27294）和38株經(jīng)菌種鑒定為結(jié)核分枝桿菌的臨床分離株為本室保存菌株。

1.2 試劑和耗材

7H9 培養(yǎng)基（M0178）和OADC（M0678）營養(yǎng)添加劑購自美國BD 公司；利福平（R3501）和異煙肼（I3377）購自美國Sigma 公司；Alamar Blue（R7017）購自美國AbD Serotec 公司；96 孔酶標板（M9410）購自美國Corning 公司。

1.3 藥物最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）測定

采用微孔板Alamar blue 顯色法測定菌株對DCS、利福平和異煙肼的MIC[14]。具體步驟參照文獻[14]。96 孔板中每孔加入100 μl 7H9 培養(yǎng)基，采用倍比稀釋的方法得到藥物濃度梯度，同一行的各孔加入稀釋菌液100 μl；另做一塊空白板。在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從第6 天開始，空白板中加入顯色劑隔天觀察變色情況。MIC 定義為藍色完全沒有發(fā)生改變的最小藥物濃度。確定藥物MIC 后，倍比稀釋下進行聯(lián)合藥物試驗[15]。讀取結(jié)果并記錄單用和聯(lián)用MIC。

1.4 分級抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI）計算與判讀標準

FICI=MIC A 藥聯(lián)用/MIC A 藥單用+MIC B 藥聯(lián)用/MIC B 藥單用；FICI≤0.5 為協(xié)同作用，0.5＜FICI≤4.0為無相關(guān)作用，F(xiàn)ICI＞4.0 為拮抗作用[16]。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件對藥物MIC 以及FICI進行數(shù)據(jù)分析，采用R 語言ggplot2 包可視化單用與聯(lián)用MIC 變化分布情況。

2 結(jié)果

2.1 藥物單用與聯(lián)用對耐藥結(jié)核分枝桿菌MIC 比較

38 株菌株MIC 見表1，與單獨用藥比較，DCS 分別與RFP 和INH 聯(lián)用后，78.9%和71.1%菌株MIC 降低。如表2 所示，DSC 與RFP 和INH 聯(lián)用后MIC50和MIC90 均明顯下降，DSC 與RFP 和INH 單用和聯(lián)用后各菌株MIC 對比分布箱線圖如圖1 所示，與單獨用藥比較，聯(lián)用MIC 呈明顯下降態(tài)勢。

圖1 DCS 與RFP 和INH 單用及聯(lián)用MIC 分布箱線圖

表1 38 株菌株DCS 與RFP 和INH 單用及聯(lián)用MIC（μg/ml）

表2 DCS 與RFP 和INH 單用及聯(lián)用MIC50 和MIC90（μg/ml，n=38）

2.2 聯(lián)合用藥FICI 指數(shù)

38 株菌株聯(lián)用FICI 分布見表3。兩種藥物聯(lián)合試驗均未檢測到對分離菌株的拮抗作用。聯(lián)合藥敏協(xié)同作用和無相關(guān)作用結(jié)果見圖2～3。

圖2 聯(lián)合藥敏協(xié)同作用結(jié)果示意圖（FICI=0.25+0.25=0.5）

表3 DCS 與RFP 和INH 聯(lián)用FICI 分布[例（%），n=38]

3 討論

圖3 聯(lián)合藥敏無相關(guān)作用結(jié)果示意圖（FICI=0.5+0.5=1）

當前，由于不規(guī)范、不合理用藥等因素加劇了耐多藥結(jié)核病的治療。尋找安全、有效的治療藥物是目前結(jié)核病研究的重要問題。聯(lián)合用藥能有效提高療效、降低藥物毒性和延緩耐藥性的產(chǎn)生，近幾年，采用聯(lián)合用藥治療耐多藥結(jié)核病已經(jīng)成為一種重要的治療方案[17-18]。DCS 可有效破壞細菌細胞壁，干擾結(jié)核分枝桿菌合成，提高抗結(jié)核效果，有研究表明，該藥物臨床耐藥率較低，且與常規(guī)抗結(jié)核藥物聯(lián)合使用無交叉耐藥性，對結(jié)核耐藥菌株抗菌活性高[19-20]。Alamar blue顯色法可用于結(jié)核分枝桿菌RFP 和INH 耐藥性的快速檢測[21]，棋盤稀釋法是聯(lián)合藥敏的經(jīng)典方法[22]。有研究顯示，采用棋盤稀釋法可準確評價以FICI 為基礎(chǔ)的體外藥物相互作用效果[23]。在體內(nèi)外，抗菌藥物聯(lián)合效應包括協(xié)同、無關(guān)和拮抗。聯(lián)合藥敏實驗評估DCS 與RFP 和INH 抗結(jié)核的作用效果，為臨床結(jié)核病的治療管理提供實驗室理論依據(jù)。有研究發(fā)現(xiàn)，使用棋盤稀釋法評估胡椒堿和RFP、INH、乙胺丁醇、鏈霉素中任一種聯(lián)合使用的抗結(jié)核活性，是否具有協(xié)同性取決于聯(lián)合的藥物及研究的菌株，任何一組聯(lián)合藥物都不會對所有的結(jié)核菌株都表現(xiàn)為協(xié)同作用[24]，本研究也支持這一結(jié)果。本研究中DCS 與RFP 和INH 藥物配伍時雖然協(xié)同效應分別僅為18.4%和13.2%。但是值得注意的是24 株（63.2%）菌株的RFP 聯(lián)合MIC以及22 株（57.9%）菌株的INH 聯(lián)合MIC 降低數(shù)個濃度梯度，兩種聯(lián)合藥物方案均沒有發(fā)現(xiàn)拮抗效應，與單獨用藥比較，聯(lián)用MIC 呈明顯下降態(tài)勢，且聯(lián)合用藥后聯(lián)用MIC50 和MIC90 均下 降。DCS 與RFP 和INH 聯(lián)用均能不同程度地降低臨床耐藥株的耐藥性，從側(cè)面可推斷針對耐藥結(jié)核患者，采用DCS 聯(lián)合方案能在保證有效藥物濃度的前提下降低RFP 和INH的用藥濃度，進而降低藥物副作用。

綜上所述，DCS 與RFP 和INH 聯(lián)用，為耐多藥結(jié)核病的治療提供有益的實驗依據(jù)，可能成為未來研究抗結(jié)核分枝桿菌藥物相互作用的新選擇。然而體外試驗預測體內(nèi)治療效果有其局限性[25]，因此更確切的實際聯(lián)合作用效果還需更進一步的臨床驗證。