劉飛翔，董其惠，吳 蓉，邱益彬，黃燕燕，蘇二正,4

(1.南京林業(yè)大學 輕工與食品學院 食品科學與工程系，江蘇 南京 210037;2.亳州學院 生物與食品工程系，安徽 亳州 236800;3.南京林業(yè)大學 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210037;4.南京林業(yè)大學 林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210037)

酶作為一種生物催化劑，具有選擇性強、催化效率高、反應條件溫和以及催化活性調節(jié)方便等優(yōu)點，在食品、化工、醫(yī)學、造紙、農業(yè)和紡織業(yè)等領域有著廣泛的應用。然而，游離酶不僅對所處的環(huán)境十分敏感，在高離子強度、強酸、強堿、高溫以及一些有機溶劑中穩(wěn)定性差，而且游離酶不容易回收再利用，混入產品后純化困難，大大限制了酶在更多工業(yè)方面的應用[1-2]。固定化酶技術的出現(xiàn)可克服游離酶的上述不足，一定程度上提高了酶的催化穩(wěn)定性、儲存穩(wěn)定性和重復使用率，在食品工業(yè)、精細化工、生物工程和醫(yī)藥等領域的應用前景廣闊[3]。

酶的固定化是通過物理或者化學的方法，將原來的水溶性酶與固態(tài)不溶性載體進行包埋或者結合，使酶不溶于水，但仍然可以起到催化作用，并能反復使用的過程。固定化載體作為固定化酶最重要的一個組成部分，具體的載體材料的選擇、載體材料的結構和性能都會對酶的固定化產生影響[4]?；谳d體材料對酶固定化的重要性，很多學者一直致力于不同固定化載體材料的開發(fā)和應用。

纖維素及其衍生物是一類理想的基質，因為它具有成本低、無毒、可再生、可降解和生物相容性好等優(yōu)點，常常被用作載體材料，尤其適于用作固定化酶的載體[5-7]。因為纖維素分子含有大量的羥基，通過氧化纖維素不同位置上的羥基，可以改變纖維素的結構，從而賦予纖維素許多新的功能，同時也使得纖維素及其衍生物作為載體時，能夠有更多的變化方式。本文就改性纖維素、纖維素膜、纖維素小球等載體在酶固定化領域的研究進展、催化機制及應用進行總結和分析，為相關的研究者提供參考。

1 改性纖維素作為載體

1.1 氧化纖維素

Crook等[8]早在1970年就嘗試用高碘酸鈉、脲和甲醛溶液氧化處理纖維素，制成高反應活性的纖維素衍生物用于固定化胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶。徐鳳彩等[9]也嘗試用高碘酸鈉、尿素、甲醛溶液氧化甘蔗渣纖維素用于固定木瓜蛋白酶。纖維素主鏈上的葡萄糖環(huán)基上有3個反應活潑的羥基，可以通過不同的氧化劑將纖維素進行部分氧化，引入如醛基、酮基、羧基或烯醇基等新的官能團。為此，根據(jù)引入官能團的不同，用于固定化酶的氧化纖維素載體可分為醛基氧化纖維素、醛基環(huán)氧化纖維素、重氮化化纖維素、羧甲基纖維素和乙基纖維素。

1.1.1 醛基氧化纖維素

在纖維素主鏈的C2和C3位上，使用高碘酸鈉進行氧化，使C2、C3位的羥基被氧化后生成雙醛基(圖1)[10]。這有利于酶分子上非活性中心的氨基和氧化纖維素上的醛基直接發(fā)生共價反應，形成共價固定化酶，達到固定酶的目的。

圖1 纖維素的羥基氧化及其酶的固定化Fig.1 Hydroxyl oxidation of cellulose and its immobilized enzyme

李珊珊等[11]使用雙醛基氧化纖維素作為載體固定胰蛋白酶時發(fā)現(xiàn)，當氧化時間為3.5 h、pH為2、溫度為35 ℃時，醛基氧化纖維素的質量分數(shù)高達74.06%，固定的胰蛋白酶表現(xiàn)出了較高的穩(wěn)定性，在最適反應條件下，重復使用性也有所提高。

郭慶啟等[12-13]使用雙醛基氧化纖維素固定β-半乳糖苷酶和木瓜蛋白酶，并且研究了固定化酶的性質，結果發(fā)現(xiàn)：與游離β-半乳糖苷酶和木瓜蛋白酶相比，固定化酶的熱穩(wěn)定性和耐酸堿性都增強，雖然與底物的親和力有所降低，但是重復使用5次之后，殘余的酶活性仍較高。

1.1.2 醛基環(huán)氧化纖維素

在堿性條件下，纖維素C6位的羥基比C2和C3位的羥基更活潑，環(huán)氧氯丙烷可以和纖維素C6位的羥基發(fā)生親核取代生成環(huán)氧化纖維素(圖2)[13]，生成的環(huán)氧化纖維素與高碘酸鈉繼續(xù)進行氧化反應，使得C2和C3位上的羥基發(fā)生氧化，生成含有醛基的環(huán)氧化纖維素。醛基環(huán)氧化纖維素的環(huán)氧基與酶分子結構上的非活性中心的氨基可直接發(fā)生共價結合進行固定化，省去中間交聯(lián)活化工藝步驟，使固定化程序一步完成，且發(fā)生的是共價鍵反應，所以酶結合得比較牢固。

圖2 醛基環(huán)氧化纖維素的生成及其酶的固定化Fig.2 Formation process of aldehyde epoxide cellulose and its immobilized enzyme

郭慶啟等[14]使用環(huán)氧氯丙烷和高碘酸鈉先后對纖維素進行環(huán)氧化和雙醛氧化，得到雙醛環(huán)氧化的纖維素，并以此作為載體，共價法固定β-半乳糖苷酶，結果發(fā)現(xiàn)：與游離酶相比，固定化酶反應的最適溫度升高，熱穩(wěn)定性和耐酸堿性增強，在重復使用5次之后，相對酶活還保持初始酶活的64%左右，較為穩(wěn)定。

1.2 重氮化纖維素

重氮法活化纖維素載體，具有方法簡便、偶聯(lián)率較大、穩(wěn)定性良好等優(yōu)點。郭海學[15]利用重氮化纖維素固定葡萄糖淀粉酶，固定后的酶熱穩(wěn)定性和最適溫度都有所提高。郭橋等[16]以纖維素為載體，利用重氮法活化后再固定糖化酶和α-淀粉酶，在pH為4～5時，可以得到高活性的共固定化酶，在60 ℃時，固定化酶表現(xiàn)出最高活性。

1.3 羧甲基纖維素

左秀鳳等[17]使用羧甲基纖維素作為載體，固定胰凝乳蛋白酶，固定后的胰凝乳蛋白酶的最適溫度提高了5 ℃，在2 ℃儲存放置20 d后，酶活仍能保持75%以上。

張銳等[18]用羧甲基纖維素-殼聚糖電解質復合物作為載體，使用戊二醛作為交聯(lián)劑，固定乳糖酶并優(yōu)化固定化條件，分析固定化酶的性能，結果發(fā)現(xiàn)，固定化酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性都優(yōu)于游離酶，重復使用性也有所提高。

1.4 乙基纖維素

郭青等[19]用乙基纖維素包埋法固定α-淀粉酶，固定后的α-淀粉酶具有良好的熱穩(wěn)定性和存儲穩(wěn)定性，而且固定化的方法相對簡單，大大減少了酶變性的可能，最大程度地保留了酶的活力。

2 纖維素膜作為載體

近年來，纖維素膜載體是固定化酶領域比較熱的一種載體[20]。使用醋酸纖維素膜固定化酶有以下優(yōu)點：第一，酶的損失小。當酶處于微結構時，微結構中的流體速度基本為零，因此憑借有機相和水相的剪切力，并不能將酶從微結構中移出。同時醋酸纖維素膜較為緊密，酶不易脫落進入水相。第二，單位膜面積上的酶負載量比較大，單位面積的酶活較高。第三，由于固定之后的酶處在有機相和水相的界面，這些酶可以不經(jīng)過交聯(lián)而固定，所以可以最大程度地保持游離態(tài)，從而達到最高的酶活性和酶活回收率[21]。

細菌纖維素膜可與海藻酸鹽、殼聚糖、淀粉、絲素蛋白、絲膠蛋白和木聚糖等材料結合形成生物復合材料，以提高該纖維素基功能材料的力學和生物學性能[22]。除了傳統(tǒng)的植物基纖維素膜外，許多微生物產生的胞外聚合物被稱為細菌纖維素膜，也被廣泛用于酶的固定化。與植物纖維素及其納米纖維(以紙漿形式獲得)相比，細菌纖維素膜獨特而復雜的三維納米孔結構更有利于生物分子的固定化[23-24]。

2.1 纖維素膜吸附固定化酶

時敏等[25]以醋酸纖維素-聚四氟乙烯復合膜作為載體，對磷脂酶進行吸附固定，結果發(fā)現(xiàn)：這種復合膜具有一定的吸附性和疏水性，化學穩(wěn)定性和力學穩(wěn)定性都比較好。以此種復合膜吸附固定磷脂酶，可提高酶的活性和穩(wěn)定性，控制和調節(jié)酶的活性和選擇性，從而有利于酶的回收和再利用[26-27]。

葉麟等[28]采用物理吸附法將麥麩中的植物酯酶固定于玻璃纖維素膜上,利用Box-Behnken試驗，確定最佳固定化條件：固定化溫度29 ℃、固定化時間4 h、磷酸鹽緩沖液pH 7.0，在該條件下酶活回收率的預測值為28.21%，驗證值為27.51%。該研究為利用固定化麥麩酯酶快速檢測有機膦和氨基甲酸酯類農藥殘留提供了技術參考。

然而，固定在膜表面的酶分子受表面吸附力的影響較大，其結構和催化性能均可能受到損害。因此，為了避免表面的負面影響，通常采用一種增加額外間隔的方法。Konovalova等[29]采用殼聚糖作為間隔物，通過共價結合固定在氧化后的纖維素膜表面，而后使用辛巴藍F3G-A染料作為親和配體對淀粉酶進行吸附固定，并將該固定化酶后的纖維素膜應用于淀粉超濾，極大提高了淀粉的傳質系數(shù)和通過量。

由此可見，纖維素膜吸附固定化酶制備工藝簡單、快捷，酶的負載量較大，是一種較有前景的膜固定化酶制備方法。

2.2 纖維素膜交聯(lián)固定化酶

張永剛等[30]使用醋酸纖維素膜作為材料，用氨基硅烷偶聯(lián)劑對該膜進行化學修飾[31]，改性之后的醋酸纖維素膜表面帶有氨基，然后使用戊二醛作為交聯(lián)劑固定脂肪酶(圖3)，結果發(fā)現(xiàn)，硅烷偶聯(lián)劑濃度過高或者反應時間過長都會破壞醋酸纖維素膜的空間結構，但當優(yōu)化偶聯(lián)劑濃度之后，成功實現(xiàn)了脂肪酶的固定化，并且酶活回收率較高。

圖3 纖維素膜的化學修飾及其酶的固定化Fig.3 Chemical modification of cellulose membrane and its immobilized enzyme

梁單瓊等[32]使用醋酸纖維素和聚四氟乙烯為材料制備復合膜，采用吸附-交聯(lián)的方法固定脂肪酶，并研究溫度、吸附時間、交聯(lián)時間、交聯(lián)劑等條件對脂肪酶固定化效率和催化效果的影響，結果發(fā)現(xiàn)，固定化之后的酶重復使用10次之后，相對酶活保持在55.5%左右。

時敏等[33]使用醋酸纖維素-聚丙烯復合膜固定谷氨酰胺酶，采用先吸附后交聯(lián)的方法進行固定，并對固定化酶和游離酶的酶學性質進行比較后發(fā)現(xiàn)：游離酶最適溫度為35～40 ℃，而固定化酶膜最適溫度為45～50 ℃；游離酶最適pH為6～7，固定化酶膜最適pH為5～6，固定化酶的最適pH向酸性偏移。

程浩等[34]采用二氯亞砜和乙二胺將細菌纖維素薄膜進行氯化和氨基化，并對β-半乳糖苷酶進行固定，結果發(fā)現(xiàn)：在最佳固定化酶的條件下，最高酶活回收率為 78.4%，吸附酶量為63.1 mg/g；經(jīng)固定化后，酶的最適溫度為40 ℃，比游離酶高10 ℃，最適pH提高 0.5，重復使用7次后剩余77.8%的相對酶活。

2.3 纖維素膜包埋固定化酶

王杰等[35]使用醋酸纖維素作為載體材料，采用相轉移制膜技術，結合包埋法制作脲酶固定化膜，并對膜的酶活收率和穩(wěn)定性進行研究，結果發(fā)現(xiàn)，固定化之后的脲酶最適反應溫度和最適pH都略好于游離脲酶，并且穩(wěn)定性也有所增強。

郭永勝等[36]考察鑄膜液配比對醋酸纖維素固定化氨基?；肝⒖诪V膜的影響，結果發(fā)現(xiàn)，在最佳鑄膜液配比時，相對酶活的產率高達98.2%，重復使用10次后仍保留初始酶活的79.7%，并且其儲存穩(wěn)定性也大大提高。

王超等[37]研究醋酸纖維素膜作為載體，使用包埋-交聯(lián)組合法固定木瓜蛋白酶，經(jīng)過實驗和優(yōu)化，該固定化酶的穩(wěn)定性、相對酶活都較高。

2.4 纖維素膜共價結合固定化酶

采用共價法將酶固定在醋酸纖維素膜上，形成的酶膜比較穩(wěn)定，比酶活也比較高。王順光等[38]采用該方法制備了葡萄糖氧化酶膜，穩(wěn)定性及重復使用性都較好。

Sternberg等[39]使用高碘酸鈉氧化的方法，在纖維素膜上引入活性基團，將酶共價固定在膜上。Vasconcelos等[40]通過傅里葉變換紅外光譜證實了氧化后的細菌纖維素膜可以共價固定化木瓜蛋白酶，固定化后的酶活可保持93.1%，并且相對于原始的細菌纖維素膜，氧化膜可固定更多的木瓜蛋白酶。

使用共價法將酶固定在纖維素膜上，雖然可解決酶分子的脫落問題，使得制成的酶膜穩(wěn)定性有所提高，但是該方法較為繁瑣，一定程度上增加了操作的難度。

3 纖維素微球作為載體

纖維素微球顆粒直徑一般在微米至毫米范圍內[41]，可用于固體載體的合成、蛋白質的固定以及色譜分析等領域。微球的制備可以通過引入大量的化學官能團或者將纖維素與有機、無機化合物混合來實現(xiàn)。

3.1 纖維素微球的制備

纖維素微球的制備過程可以大致分為三步：溶解纖維素(或者纖維素的衍生物)、將纖維素多糖溶液塑造成球形顆粒、顆粒固化成微球。

3.1.1 球形顆粒成形

纖維素微球可以通過纖維素多糖溶液形成球形小液滴，并且在凝固浴中凝固而獲得(圖4)[41]。當纖維素溶液以很高的速度從一個細小的出口噴出后，經(jīng)過一個旋轉裝置，被切割成球形顆粒，隨后落入凝固浴(介質)之中。液體的噴射和切割液可以直接在凝固介質中完成，微球的形狀和尺寸可以通過噴嘴的直徑、噴射和旋轉的速度以及切割刀的幾何形狀來進行控制。另外一種讓顆粒成形的方式是使用高速分散法，因為纖維素溶液或者纖維素衍生物在與它們極性相反的、不能互溶的溶劑中會形成乳狀液，這些含有可溶性多糖的乳液滴，可以通過加入水或者改變pH和溫度，從而引起中間衍生物的裂解形成大小相同的纖維素微球。分散后的液滴直徑大小從十幾到幾百毫米，它的大小是由混合的速度、纖維素溶液的黏度、表面活性劑的類型和用量、疏水和親水性溶劑所占比例共同決定的[42-43]。與滴入法相比，分散法所制備的微球大小是前者的1/10左右，而且分散法不需要其他設備就可以獲得很好的產品。

圖4 纖維素的溶解和成球途徑[41]Fig.4 General routes for dissolution of cellulose and shaping into beads[41]

3.1.2 纖維素的溶解和再生

為了控制微球能夠更好地成形，研究人員研究了多種可以溶解纖維素的溶劑(圖4)，這些溶劑大致可以分成三類[41]：①衍生化纖維素溶劑。纖維素依次經(jīng)過堿化、老化和CS2處理之后，被衍生為黃原酸纖維素，可以溶解在NaOH中。當溶液形成所需要的纖維素微球之后，黃原酸酯取代基可以通過酸處理或者提高溫度(90 ℃)來實現(xiàn)裂解，進而再生成纖維素。由于使用了CS2，這種工藝缺點較大，因此尋找綠色環(huán)保的替代品成為近年來人們所關注的熱點。②非衍生化溶劑。經(jīng)常使用非衍生化纖維素的溶劑，如銅銨氫氧化物和其他含有銅、鎘、鎳或鐵等的金屬鹽的水合物，通過絡合纖維素上的羥基而溶解纖維素[41]。但是由于重金屬的存在，它們的應用也受到了一定的限制。③穩(wěn)定的纖維素衍生物。醋酸纖維素常被用來制備纖維素微球，因為它非常穩(wěn)定，而且制備后的微球不需要處理就可以儲存起來。與黃原酸酯和氨基甲酸酯基團不同的是，乙酰基在再生時并不需要裂解，用水置換有機溶液就可以使得醋酸纖維素沉淀。但這樣做的缺點就是，在制備微球時需要其他的工藝處理去除乙酰基或甲硅烷基。

3.1.3 纖維素微球性能調節(jié)

纖維素微球的尺寸大小主要是由形成球形液滴時使用的方法決定的，而微球的物理特性，如比表面積、密度、孔徑大小和結構等都是由凝結工藝決定的。因此，可以通過調節(jié)凝固浴的溫度和組成調節(jié)微球的內表面積和形態(tài)等，還可以通過在纖維素微球中加入無機物成分來改變其物理特性[45]。

3.2 纖維素微球的功能化

3.2.1 纖維素微球的化學修飾

為了使纖維素微球能夠適應各種不同類型的應用，可以通過引入不同的化學基團來實現(xiàn)。

①醚化。纖維素微球可以通過在堿性條件下與乙烯基化合物(烷基化)、環(huán)氧乙烷(羥烷基化)或者鹵素發(fā)生反應進行醚化，醚鍵能夠在較低或者較高pH的體系中保持穩(wěn)定。纖維素微球化學改性最常用的一種方法是用氯乙酸對其羧甲基化，會產生用于離子交換的陰離子材料[46-47]。纖維素微球和一些帶有雙功能化基團的試劑中一個基團進行連接醚化后，可以讓另外一個活性基團繼續(xù)進行功能化的反應，比如纖維素微球與環(huán)氧氯丙烷在堿性條件下就是分兩個步驟進行反應的，與多糖的羥基進行環(huán)氧開環(huán)反應形成鹵代醇取代，隨后去除HCl得到了一種新的環(huán)氧乙烷基[48]。另外，纖維素與烯丙基溴和二乙烯砜進行衍生化反應可引入活性烯烴基團[49-50]。

②酯化。纖維素微球與無機酸衍生物酯化能產生帶電的材料，如，與硫酸或磷酸反應形成帶電材料，這些帶電材料可用于離子交換或親和吸附色譜[51-52]。纖維素微球還能與對甲苯磺酰氯反應使它們更容易進行親核取代反應。同時，甲苯磺基是一個很好的離去基團，可以被胺和氨所取代[53]。通過與羧酸衍生物酯化制備功能化纖維素微球的研究報道較少，這可能是由于酯鍵在堿性水溶液中穩(wěn)定性較低，從而影響衍生化纖維素微球的穩(wěn)定性[54]。

③氧化。高碘酸鈉氧化已被廣泛用于活化纖維素微球，特別是用于酶的偶聯(lián)[55-57]。該反應導致纖維素的構成單元中萄葡糖環(huán)的C2—C3鍵選擇性裂解，得到2個活性羰基[58]，再經(jīng)過哌啶氧合氨鹽氧化，纖維素的伯醇羥基可被選擇性地轉化，得到6-脫氧-6-羧基纖維素[59]。

3.2.2 功能化基團引入

①烯烴。用過氧化物引發(fā)劑活化后，烯烴基團比較容易地通過自由基加成機制與硫醇反應[60]。纖維素微球能與烯丙基溴或二乙烯基砜反應，隨后再連接各種巰基化合物。烯烴基團還能迅速與溴或N-溴代琥珀酰亞胺反應，在水環(huán)境里，鹵化產生溴代醇，去除HBr即可得環(huán)氧乙烷[61-62]。這種活化方法已被應用于微球與含氨基的取代基偶聯(lián)中[50]。

②環(huán)氧乙烷。環(huán)氧乙烷對纖維素微球的活化反應通常在溫度較低的環(huán)境中或者反應較短的時間內即可實現(xiàn)。將環(huán)氧乙烷基團鏈接到纖維素的主鏈，是一種對活性微球進行官能化的最主要、最常用的方式。更直接一點的方式是用環(huán)氧氯丙烷對纖維素異構進行醚化[49]。

③胺類和羰基衍生物。胺類和羰基衍生物都是非常通用的活性基團，它們之間可以相互發(fā)生反應，從而生成亞胺，而且亞胺通?？梢灾苯舆€原成胺，以提高纖維素主鏈的化學穩(wěn)定性[63]。胺基或羰基衍生物官能團中的某一種可以連接在纖維素主鏈上，這樣官能化之后的纖維素微球就能很容易與靶分子進行反應。

基于具有“綠色”材料的優(yōu)勢，纖維素微球憑借其良好的理化性質，應用的領域也越來越廣泛。曲紅波等[63]使用多孔纖維素微球作為固定化酶的載體，用NaIO4氧化法活化來固定糖化酶，制成的固定化酶穩(wěn)定性較好、成本較低、使用方便。張中勤等[64]以球狀纖維素為基體，通過醚化和胺化反應，制備出一種新的固定化酶載體——球狀纖維素單寧樹脂，這種載體對酶的吸附性比較強，可以用來固定化酶。

對于新型的纖維素微球載體材料的制備、研制、開發(fā)和應用還在不斷探索之中。

4 磁性纖維素微球作為載體

磁性高分子微球是指通過適當?shù)姆椒ㄊ褂袡C高分子與無機磁性物質結合形成的具有一定磁性及特殊結構的微球。因磁性高分子微球同時兼具高分子微球的特性和磁響應性，所以它不但能通過共聚及表面改性等方法賦予其表面新的功能基團(如—OH、—COOH、—CHO、—NH2和—SH等),還能在外加磁場下方便、迅速地分離[65]。納米磁性Fe3O4具有量子尺寸效應、超順磁性、磁有序顆粒的小尺寸效應和宏觀量子隧道效應等特殊磁性能，一般使用水滴法進行合成。磁性纖維素微球作為一種新型的固定化酶載體，有著良好的應用前景，其制備與固定化過程如圖5所示。

圖5 磁性纖維素微球載體的制備及其酶的固定化Fig.5 Preparation of magnetic cellulose microsphere carrier and its immobilized enzyme

Zhang等[66]采用改性的多孔磁性纖維素微球對產自南極假絲酵母的脂肪酶B進行固定化，固定化脂肪酶的催化比酶活可達1.0 U/mg，并用于文冠果種油的酯交換反應制備生物柴油，在最佳反應條件下，制備的生物柴油收率高達92.3%。

Tamaddon等[67]采用磁性微纖維素微球和納米纖維素微球對脲酶進行固定化，固定化的脲酶經(jīng)6個循環(huán)后仍然保持了75%～80%的酶活。

與傳統(tǒng)的固定化載體相比，磁性纖維素微球載體有易回收、成本較低、操作簡便等優(yōu)點[68]。雖然現(xiàn)在對磁性纖維素微球的研究仍然處于起步的階段，還不能針對不同類型的酶準確地選擇磁性載體和固定化方法，但是，隨著相關研究的深入，相信很快這些問題都能得到解決。

5 總結

本文介紹了改性纖維素、纖維素膜、纖維素微球和磁性纖維素微球作為固定化酶載體的研究進展，這些纖維素載體形式可以通過吸附、交聯(lián)、共價結合以及包埋等不同方式實現(xiàn)對酶的固定化，經(jīng)纖維素基載體材料固定化的酶，在熱、酸堿、貯藏穩(wěn)定性上有所提高，重復使用性能也得到不同程度的提高。由于纖維素具有可再生、可降解、價廉等優(yōu)勢，纖維素基載體材料用于固定化酶的研究將得到更多關注，新的纖維素載體形式也必將不斷涌現(xiàn)。